一株粪肠球菌FJL19及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103074281 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103074281 A *CN103074281A* (21)申请号 201310020433.9 (22)申请日 2013.01.21 CGMCC No. 6995 2012.12.17 C12N 1/20(2006.01) A23K 1/16(2006.01) A23K 1/18(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 黑龙江八一农垦大学 地址 163319 黑龙江省大庆市高新开发区新 阳路 2 号 (72)发明人 王秋菊 崔一喆 刘胜军 孙蕊 张爱忠 (74)。

2、专利代理机构 大庆市建华专利事务所 23119 代理人 孙薇 (54) 发明名称 一株粪肠球菌 FJL19 及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一株粪肠球菌 （Enterococcus faecalis） FJL19， 其保藏编号为 CGMCC No.6995。 本发明还提供了上述粪肠球菌 FJL19 具有抑制 鸡肠道中大肠杆菌生长、 促进雏鸡生长的作用。 本发明从笼养成年蛋鸡空肠中分离出粪肠球菌 FJL19， 此菌株生长旺盛， 18 小时培养菌数就可达 5.1109cfu/ml， 且具有抑菌作用， 可以利用培养 基生产抑菌蛋白， 降低雏鸡肠道大肠杆菌数量 ； 通过此乳酸菌制备菌制剂饲喂雏鸡，。

3、 可以提高雏 鸡的生长 ； 因此粪肠球菌 FJL19 在动物饲养尤其 是家禽新型饲料添加剂开发和抗生素替代品研究 上具有重大的社会意义和经济价值。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103074281 A CN 103074281 A *CN103074281A* 1/1 页 2 1. 一株粪肠球菌 （Enterococcus faecalis） FJL19， 其保藏编号为 CGMCC No.6995。 2. 。

4、权利要求 1 所述的粪肠球菌 FJL19 具有抑制鸡肠道中大肠杆菌生长、 促进雏鸡生长 的作用。 权 利 要 求 书 CN 103074281 A 2 1/9 页 3 一株粪肠球菌 FJL19 及其应用 技术领域 0001 本发明属于动物微生物领域， 涉及一株粪肠球菌 FJL19 及其应用， 特别涉及一株 从鸡肠道中分离出来的粪肠球菌 FJL19 及其应用。 背景技术 0002 乳酸菌是一类重要的益生菌， 是动物肠道中一类重要的优势菌群。乳酸菌制剂作 为一种新型的绿色动物微生态制剂， 因其无毒、 无抗药性、 无残留、 无副作用而备受饲料界 的广泛关注。 0003 采用乳酸菌作为益生菌饲喂动物，。

5、 除了由于乳酸菌具有一定的营养作用和对肠道 的粘附作用外， 主要在于乳酸菌对于一些腐败菌和有害菌具有抑制作用。 第一， 乳酸菌可以 产生乳酸， 创造酸性环境抑制有害菌及不耐酸的腐败菌生长 ； 第二， 乳酸菌产生 H2O2， 激活 过氧化氢酶硫氰酸系统， 抑制和杀灭革兰氏阴性菌、 过氧化氢酶阳性细菌等 ； 第三， 部分 乳酸菌可以产生抑菌性的细小蛋白质或肽类， 称为细菌素， 对大肠杆菌等致病菌有拮抗作 用。 而且， 有了产生抑菌蛋白的乳酸菌， 就可以生产细菌素， 可以替代抗生素， 使动物生产更 安全。分离筛选可以产生细菌素的乳酸菌成为现在益生菌开发的研究热点。 0004 产生细菌素的乳酸菌来源很。

6、多， 购买的工业菌株和标准菌株， 有很多也可以产生 细菌素， 环境、 土壤、 泡菜、 酸奶中都可以分离乳酸菌。然而益生菌最后要饲喂动物， 那么相 对于其他来源的菌株， 动物无疑是乳酸菌的最好来源。来自动物肠道的乳酸菌可以适应动 物肠道环境， 耐受动物的胃酸和胆盐的消化， 无疑是最好的益生菌来源。可见， 通过从动物 肠道分离和筛选能够产生细菌素的乳酸菌将是动物用益生菌筛选的重要研究方向。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一株粪肠球菌 （Enterococcus faecalis） FJL19， 其保藏编号 为 CGMCC No.6995。 0006 本发明的第二个目的是提供上述粪肠球菌 F。

7、JL19 具有抑制鸡肠道中大肠杆菌生 长、 促进雏鸡生长的作用。 0007 本发明通过以下技术方案来实现 ： 0008 一、 一 株 粪 肠 球 菌 （Enterococcus faecalis） FJL19， 其 保 藏 编 号 为 CGMCC No.6995。 0009 本发明中粪肠球菌 FJL19 为革兰氏阳性， 形态为球形， 是从笼养成年蛋鸡盲肠内 容物中分离的乳酸菌菌株， 经过产抑菌蛋白等特性测定筛选得到的目标菌株。 0010 筛选的具体步骤如下 ： 0011 1、 乳酸菌分离纯化 ： 0012 采用无菌操作， 用载玻片刮取笼养成年蛋鸡盲肠内容物 1g， 置于盛有 9mL 无菌生 理。

8、盐水的玻璃试管中， 充分震荡摇匀， 然后吸取0.5mL混合液于盛有4.5mL无菌生理盐水的 试管中， 此稀释度为10-1， 重复以上过程作10倍比稀释， 至10-6稀释浓度， 选择10-4、 10-5、 10-6 说 明 书 CN 103074281 A 3 2/9 页 4 三个稀释度， 吸取 0.lmL 菌液滴于 MRS 培养基平板上， 平板涂布后采用厌氧培养法 （5%CO2） 将涂好的培养皿置 37培养箱培养 48h。采用四分区划线法， 用接种环挑取形态不同的菌 落在MRS琼脂培养基上进行划线分离培养， 经48h培养后， 在四分区中挑取分离效果好的菌 落用接种环接种于 MRS 斜面培养基上。

9、作纯培养， 重复传代纯培养 3 次， 而后置于 4冰箱保 存备用。 0013 2、 菌体形态的观察 0014 取干净玻片， 用接种环取一环无菌水于玻片上， 而后挑取少量细菌， 涂匀， 待干燥 后， 固定。革兰氏染色 ： 先用草酸铵结晶紫染液染色 1min， 用水冲洗， 接着滴加卢氏碘液覆 盖1min， 用水冲洗， 然后滴加95%乙醇至乙醇液不呈现紫色时停止约0.5min， 最后用番红染 液复染 1min， 水洗。油镜镜检 （16100） ， 选取革兰氏染色为阳性、 形态为杆状或球状的菌 株做后备菌株留用。 0015 革兰氏染色试剂配制 ： 0016 草酸铵结晶紫染色液的配制 0017 A 液结。

10、晶紫 2g 95% 酒精 20mL 0018 B 液草酸铵 0.8g 蒸馏水 80mL 0019 混合 A、 B 液， 静置 48h 之后使用。 0020 卢氏碘液 0021 碘片 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300mL 0022 先将碘化钾溶解在少量水中， 再将碘片溶解在碘化钾溶液中， 待碘全溶后加足水 即可。 0023 95% 酒精 0024 番红复染液 0025 番红 2.5g 95% 酒精 100mL 0026 取上述配好的番红酒精 10mL 与 80mL 蒸馏水混匀而成。 0027 3、 抑菌性乳酸菌的筛选 ： 0028 （1） 菌液的制备 ： 将分离纯化出的乳酸菌活化 2-3 代后。

11、， 按 2%(v/v) 的接种量各自 接至新鲜 MRS 液体培养基中， 37厌氧培养 24h， 使其菌液浓度达到 108cfu/mL， 测定其抑菌 活性。 将黄色微球菌接种于肉汤培养基中， 于37摇床培养2代， 用无菌水作10倍比稀释， 使其菌液浓度达到 105cfu/mL， 作为指示菌备用。 0029 （2） 产酸能力测定 ： 将分离纯化出的乳酸菌活化 2-3 代后， 按 2%(v/v) 的接种量接 至各自新鲜 MRS 液体培养基中， 37厌氧培养， 分别于 0h、 48h 两个时间点用酸度计测定各 实验菌株 5mL 发酵液的 pH 值。每个试验菌株发酵液作 3 个重复， 取平均数。用 0h。

12、、 48h 两 个时间点各实验菌株发酵液的 pH 值变化， 即 pH 值来衡量乳酸菌的产酸能力。选取产酸 能力高的菌株进行下一步测定。 0030 （3） 抑菌实验 ： 采用牛津杯法对分离纯化出的乳酸菌进行抑菌效果测定。 0031 取 100L 指示菌液分别滴加到已凝固好的培养基中， 用涂布棒涂布均匀。在无菌 条件下用无菌镊子夹取4个牛津杯对称放在平皿上， 然后分别吸取200L乳酸菌发酵液于 3 个牛津杯中， 另一个牛津杯中加入等量的 MRS 培养液作对照， 于 37下恒温培养 16-18h。 每个乳酸菌发酵液做 2 个重复， 用游标卡尺测其抑菌圈直径的大小， 取平均数， 选择抑菌环 说 明 书。

13、 CN 103074281 A 4 3/9 页 5 大的乳酸菌。 0032 为了尽快筛选出所需菌种， 初步筛选采用了抑菌和产酸能力 2 项基本指标加和淘 汰法。每项指标中， 排在首位的加 100 分， 位居第二的加 99 分， 以此类推， 排在最后的加 1 分。对初筛试验的 2 项结果各自进行加和并排序， 选出总分较高的前 10 名菌株进行下一步 研究。 0033 4、 产细菌素乳酸菌的筛选 0034 将步骤 2 中筛选到的乳酸菌进行液体培养， 为了减少酸的抑菌效果， 对培养液用 1mol/L NaOH 溶液调整 pH 值至 6.8， 然后进行牛津杯法测定抑菌环， 方法同上， 选择抑菌环 最大。

14、的乳酸菌。再进行液体培养后， 在培养液中加入 0.1mg/L 的蛋白酶 37作用 2h， 取菌 液做抑菌试验， 筛选没有抑菌环的菌株， 为产生抑菌蛋白的目标乳酸菌。 0035 在上述筛选方法中， 培养基为 MRS 培养基 ： 0036 固体平板或斜面培养基 ： 胰蛋白胨 10g， 牛肉膏 10g， 酵母膏 5g， 柠檬酸铵 2g， 葡萄 糖 20g， 磷酸二氢钾 2g， 乙酸钠 5g， 吐温 -801g， 硫酸镁 0.5g， 硫酸锰 0.2g， 琼脂 20g， 蒸馏水 1000mL， pH6.8。 0037 液体培养基 ： 胰蛋白胨 10g， 牛肉膏 10g， 酵母膏 5g， 柠檬酸铵 2g，。

15、 葡萄糖 20g， 磷酸 二氢钾 2g， 乙酸钠 5g， 吐温 -801g， 硫酸镁 0.5g， 硫酸锰 0.2g， 蒸馏水 1000mL， pH6.8。 0038 采用上述技术方案的积极效果 ： 本发明从笼养成年蛋鸡空肠中分离出粪肠球菌 FJL19， 此菌株生长旺盛， 18 小时培养菌数就可达 5.1109cfu/mL， 且具有抑菌作用， 可以利 用培养基生产抑菌蛋白， 降低雏鸡肠道大肠杆菌数量 ； 通过此乳酸菌制备菌制剂饲喂雏鸡， 可以提高雏鸡的生长 ； 因此粪肠球菌 FJL19 在动物饲养尤其是家禽新型饲料添加剂开发和 抗生素替代品研究上具有重大的社会意义和经济价值。 附图说明 0039。

16、 图 1 是粪肠球菌的革兰氏染色镜检结果 ； 0040 图 2 是粪肠球菌菌液的抑菌效果对比 ； 0041 图中， 1、 2 为目的菌株的抑菌圈， 3、 4 为其他分离菌株的抑菌圈 ； 0042 图 3 是蛋白酶处理后粪肠球菌菌液的抑菌效果 ； 0043 图中， 1 为未处理的菌液， 2、 3 和 4 分别为蛋白酶 K， 胰蛋白和木瓜蛋白酶处理的菌 液 ； 0044 图 4 是粪肠球菌的 PCR 扩增结果 ； 0045 图中， 1Marker， 2 植物乳杆菌 ； 0046 图 5 是粪肠球菌的生长曲线图。 0047 本发明所涉及的粪肠球菌 （Enterococcus faecalis） FJ。

17、L19， 于2012年12月17日 在中国专利局或国际专利组织承认的保藏中心进行了专利程序保藏， 保藏单位全称为中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 简称为 CGMCC， 保藏单位地址 ： 北京市朝阳区 北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 保藏编号 ： CGMCC No.6995。 具体实施方式 0048 下面结合实施例、 试验例对本发明的技术方案做进一步的说明， 但不应理解为对 本发明的限制 ： 说 明 书 CN 103074281 A 5 4/9 页 6 0049 本发明中生物材料的来源 ： 0050 1、 细菌通用引物购自上海博亚生物技术有限公司。 0051。

18、 实施例 1 0052 本实施例用于说明粪肠球菌 FJL19 的筛选。 0053 1、 乳酸菌分离纯化 ： 0054 采用无菌操作， 用载玻片刮取笼养成年蛋鸡盲肠内容物 1g， 置于盛有 9mL 无菌生 理盐水的玻璃试管中， 充分震荡摇匀， 然后吸取0.5mL混合液于盛有4.5mL无菌生理盐水的 试管中， 此稀释度为10-1， 重复以上过程作10倍比稀释， 至10-6稀释浓度， 选择10-4、 10-5、 10-6 三个稀释度， 吸取 0.lmL 菌液滴于 MRS 培养基平板上， 平板涂布后采用厌氧培养法 （5%CO2） 将涂好的培养皿置 37培养箱培养 48h。采用四分区划线法， 用接种环挑。

19、取形态不同的菌 落在MRS琼脂培养基上进行划线分离培养， 经48h培养后， 在四分区中挑取分离效果好的菌 落用接种环接种于 MRS 斜面培养基上作纯培养， 重复传代纯培养 3 次， 而后置于 4冰箱保 存备用。 0055 2、 菌体形态的观察 0056 取干净玻片， 用接种环取一环无菌水于玻片上， 而后挑取少量细菌， 涂匀， 待干燥 后， 固定。革兰氏染色 ： 先用草酸铵结晶紫染液染色 1min， 用水冲洗， 接着滴加卢氏碘液覆 盖1min， 用水冲洗， 然后滴加95%乙醇至乙醇液不呈现紫色时停止约0.5min， 最后用番红染 液复染 1min， 水洗。油镜镜检 （16100） ， 选取革兰氏。

20、染色为阳性、 形态为杆状或球状的菌 株做后备菌株留用。结果如图 1 所示。 0057 革兰氏染色试剂配制 ： 0058 草酸铵结晶紫染色液的配制 0059 A 液结晶紫 2g 95% 酒精 20mL 0060 B 液草酸铵 0.8g 蒸馏水 80mL 0061 混合 A、 B 液， 静置 48h 之后使用。 0062 卢氏碘液 0063 碘片 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300mL 0064 先将碘化钾溶解在少量水中， 再将碘片溶解在碘化钾溶液中， 待碘全溶后加足水 即可。 0065 95% 酒精 0066 番红复染液 0067 番红 2.5g 95% 酒精 100mL 0068 取上述配好的。

21、番红酒精 10mL 与 80mL 蒸馏水混匀而成。 0069 3、 抑菌性乳酸菌的筛选 ： 0070 （1） 菌液的制备 ： 将分离纯化出的乳酸菌活化 2-3 代后， 按 2%(v/v) 的接种量各自 接至新鲜 MRS 液体培养基中， 37厌氧培养 24h， 使其菌液浓度达到 108cfu/mL， 测定其抑菌 活性。 将黄色微球菌接种于肉汤培养基中， 于37摇床培养2代， 用无菌水作10倍比稀释， 使其菌液浓度达到 105cfu/mL， 作为指示菌备用。 0071 （2） 产酸能力测定 ： 将分离纯化出的乳酸菌活化 2-3 代后， 按 2%(v/v) 的接种量接 至各自新鲜 MRS 液体培养基。

22、中， 37厌氧培养， 分别于 0h、 48h 两个时间点用酸度计测定各 说 明 书 CN 103074281 A 6 5/9 页 7 实验菌株 5mL 发酵液的 pH 值。每个试验菌株发酵液作 3 个重复， 取平均数。用 0h、 48h 两 个时间点各实验菌株发酵液的 pH 值变化， 即 pH 值来衡量乳酸菌的产酸能力。选取产酸 能力高的菌株进行下一步测定。 0072 （3） 抑菌实验 ： 采用牛津杯法对分离纯化出的乳酸菌进行抑菌效果测定。 0073 取 100L 指示菌液分别滴加到已凝固好的培养基中， 用涂布棒涂布均匀。在无菌 条件下用无菌镊子夹取4个牛津杯对称放在平皿上， 然后分别吸取20。

23、0L乳酸菌发酵液于 3 个牛津杯中， 另一个牛津杯中加入等量的 MRS 培养液作对照， 于 37下恒温培养 16-18h。 每个乳酸菌发酵液做 2 个重复， 用游标卡尺测其抑菌圈直径的大小， 取平均数， 选择抑菌环 大的乳酸菌。 0074 为了尽快筛选出所需菌种， 初步筛选采用了抑菌和产酸能力 2 项基本指标加和淘 汰法。每项指标中， 排在首位的加 100 分， 位居第二的加 99 分， 以此类推， 排在最后的加 1 分。对初筛试验的 2 项结果各自进行加和并排序， 选出总分较高的前 10 名菌株进行下一步 研究。 0075 4、 产细菌素乳酸菌的筛选 0076 将步骤 2 中筛选到的乳酸菌进。

24、行液体培养， 为了减少酸的抑菌效果， 对培养液用 1mol/L NaOH 溶液调整 pH 值至 6.8， 然后进行牛津杯法测定抑菌环， 方法同上， 选择抑菌环 最大的乳酸菌。结果如图 2 所示。再进行液体培养后， 在培养液中加入 0.1mg/L 的蛋白酶 37作用 2h， 取菌液做抑菌试验， 筛选没有抑菌环的菌株， 为产生抑菌蛋白的目标乳酸菌。 结果如图 3 所示。 0077 在上述筛选方法中， 培养基为 MRS 培养基 ： 0078 固体平板或斜面培养基 ： 胰蛋白胨 10g， 牛肉膏 10g， 酵母膏 5g， 柠檬酸铵 2g， 葡萄 糖 20g， 磷酸二氢钾 2g， 乙酸钠 5g， 吐温 。

25、-801g， 硫酸镁 0.5g， 硫酸锰 0.2g， 琼脂 20g， 蒸馏水 1000mL， pH6.8。 0079 液体培养基 ： 胰蛋白胨 10g， 牛肉膏 10g， 酵母膏 5g， 柠檬酸铵 2g， 葡萄糖 20g， 磷酸 二氢钾 2g， 乙酸钠 5g， 吐温 -801g， 硫酸镁 0.5g， 硫酸锰 0.2g， 蒸馏水 1000mL， pH6.8。 0080 实施例 2 0081 本实施例用于说明粪肠球菌 FJL19 的鉴定。 0082 1、 菌株属的鉴定 0083 过氧化氢酶试验 ： 将3%H2O2直接加到斜面的菌苔上， 观察是否有气泡的产生。 若有 气泡产生则为阳性反应。 0084。

26、 硝酸盐还原试验 ： 将细菌接种到培养基上， 37培养 48h， 沿管壁加入甲液和乙 液， 观察。立刻呈现红色、 橙红色为阳性反应。 0085 明胶液化试验 ： 将细菌接种到培养基上， 20培养 48h， 观察。接种管液化为阳性 反应。 0086 吲哚试验 ： 接种细菌于 MRS 培养液中， 37培养 48h。于培养液中加入二甲苯 2-3mL， 摇匀， 静置片刻后， 沿管壁加入吲哚试剂 2mL， 二甲苯下层液体变玫瑰红色者为阳性 反应。 0087 硫化氢试验 ： 将细菌接种于 MRS 培养液后， 用无菌的镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂 于接种管内。下端接近培养基表面而不接触液面。上端用棉塞塞进。置于。

27、 37培养 48h， 说 明 书 CN 103074281 A 7 6/9 页 8 观察。纸条变黑为阳性反应。 0088 通过过氧化氢酶试验、 硝酸盐还原试验、 明胶液化试验、 吲哚试验和硫化氢试验， 结果显示均为阴性， 说明粪肠球菌 FJL19 为乳酸菌属。 0089 2、 菌株种的鉴定 0090 发酵糖产酸产气试验 ： 用接种针分别挑取少量细菌接种于乳糖、 D- 木糖、 蔗糖、 蜜 二糖、 棉籽糖、 松三糖、 核糖醇、 山梨醇和甘露醇生化发酵管中， 37培养48h。 生化管中紫色 变成黄色表示产酸， 为阳性反应。 0091 15和 45生长试验 ： 挑取几环细菌接种于 MRS 斜面培养基上。

28、， 15和 45培养 48h， 观察细菌是否在斜面上生长。 0092 精氨酸水解试验 ： 将细菌接种到培养基上， 37培养 48h， 观察， 呈现红色、 橙红色 为阳性反应。 0093 马尿酸盐水解试验 ： 将细菌接种到培养基上， 37培养 48h， 观察。呈现红色、 橙红 色为阳性反应。 0094 精氨酸产氨试验 ： 接种细菌于含精氨酸的培养基中， 37培养 48h。向培养液中加 奈氏试剂数滴， 当产氨时出现橙黄或黄褐色沉淀， 即为阳性反应。 0095 通过马尿酸盐水解试验、 精氨酸水解试验、 15和 45生长试验， 及各类糖发酵试 验， 结果与 常见细菌系统鉴定手册 和 乳酸细菌的分类鉴定。

29、 对照。鉴定结果显示该菌 株为粪肠球菌。 0096 在上述筛选方法中， 生化培养基及相关试剂配制如下 ： 0097 硫化氢试验培养基 ： 胰胨 10g ； 牛肉膏 3g ； 酵母提取物 5g ； NaCl 5g ； 半胱氨酸 0.4g ； 葡萄糖 2g ； 蒸馏水 1000mL。调 pH 值于 7.2， 115高压灭菌 20min。 0098 乳糖、 D- 木糖、 鼠李糖、 蔗糖、 蜜二糖、 棉籽糖、 松三糖、 核糖醇、 山梨醇和甘露醇糖 发酵鉴定生化管， 为海博生物购买。 0099 吲哚试剂 ： 对二甲基氨基苯甲醛 1g， 无水乙醇 95mL， 浓盐酸 20mL。 0100 精氨酸液 ： L。

30、- 精氨酸 1.5g， 半胱氨酸 （1g/mL H2O） 0.05mL， 蒸馏水 10mL， 调 pH 至 7.0， 灭菌后加 3 滴至 PY 基础培养液中。奈氏试剂 ： 将 20g KI 溶于 50mL 蒸馏水， 并在此溶 液中加 HgI2小颗粒， 至溶液达饱和为止 （约 32g） ， 然后再加 460mL 水和 134gKOH。将上清液 贮存于暗色瓶中备用。 0101 糖发酵的实验结果如表 1 ： 0102 表 1 糖发酵试验结果 0103 说 明 书 CN 103074281 A 8 7/9 页 9 0104 3.16S rDNA 测序鉴定 0105 采用本领域技术人员公知的方法， 用试。

31、剂盒提取细菌基因组 DNA， 反转录为 cDNA， 根据乳酸杆菌的16S rDNA基因序列的保守区域， 采用细菌通用引物， 进行基 因常规PCR扩 增， 其中， 0106 上游引物 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 0107 下游引物 5-ACGGCTACCTTGTTACGACTT3 0108 扩增结果电泳检测， 电泳显示条带清楚单一， 说明扩增成功， 结果如图 4， 同时条 带提纯， TA- 克隆技术， 测序后， 在 Gene bank 的 BLAST 上进行序列比对， 确定为粪肠球菌 （Enterococcus faecalis） 。 0109 试验例 1 0110 本试验。

32、例用于说明粪肠球菌 FJL19 的作用。 0111 1、 乳酸菌全菌液制剂制备 0112 （1） 乳酸菌发酵时间测定 ： 将活化后的乳杆菌作为发酵种子液 1%（v/v） 接种于 MRS 液体培养基中， 37， 170r/min 摇床培养， 在前 24h 每隔 2h， 24h 后在第 36 和 48h 取样， 按 10 倍法用 0.9% 的生理盐水进行梯度稀释后， 取 10-4-10-6稀释度 100l 稀释液在 MRS 琼 脂培养基均匀涂布， 每个梯度做 3 个重复， 平皿在 37， 5%CO2条件下培养 24h。取菌落数在 30-300 的稀释度值计算菌液浓度， 同时取样， 采用牛津杯法测定。

33、各时间点菌液的抑菌效果， 确定最适发酵时间。 0113 如图 5 所示， 图中横坐标代表时间， 纵坐标代表活菌数， 粪肠球菌在接种后 10h 内 活菌数缓慢上升， 从 10h 后则呈现迅速上升的状态， 而在 18h 时即达到了活菌数 109以上， 此时达到了最高值。而到了 36h 时活菌数已经下降到 108， 并呈现逐渐下降状态。主要原因 是培养基营养物质的消耗， 有害代谢产物积累增加等原因导致菌体生长环境的变化， 从而 使活菌数量减少。从生长曲线可以看出， 粪肠球菌在 16-20h 时活菌数维持在 109数量级， 并且比较稳定， 所以选择 18h 这一时间段收获菌体。 0114 （2） 全菌。

34、液制备 ： 将试验菌株活化 2-3 代后， 按 1%（v/v） 的接种量接至经优化的 液体培养基中， 37， 170r/min 摇床培养 18h， 4， 3500rpm 离心 30min， 用一定体积的上清 液悬浮菌体， 4保存备用。 0115 2、 乳酸菌制剂在雏鸡饲养的应用效果 0116 （1） 试验材料 ： 上述全菌液制剂， 活菌数为 5.1109cfu/mL（菌个数） ； 抗生素为 4% 黄霉素。 0117 （2） 试验动物和试验设计 ： 选用 240 只 1 日龄健康的 AA 肉仔鸡， 公母各半， 平均 体重 40.550.67g， 随机分为 4 组， 组 （对照组， 基础日粮） ，。

35、 组 （抗生素组， 基 础日粮 +0.01%黄霉素） ， （全菌液制剂组， 基础日粮+0.5%的全菌液制剂） 、 组 （全菌液制剂组， 基 础日粮 +1% 的全菌液制剂） ， 每组 5 个重复， 每个重复 12 只鸡， 试验期 28 天。 0118 （3） 测定指标 ： 0119 A、 生产性能指标 ： 分别于试验第1天、 15天、 29天早8 ： 00时称量各重复空腹重 （禁 食12h） ， 并准确记录各重复采食量。 计算各组鸡的平均日增重 （ADG） 、 平均日采食量 （ADFI） 和饲料转化比 （FCR） 。结果如表 2 ： 0120 表 2 乳酸菌制剂对雏鸡日增重和料重比的影响 说 明。

36、 书 CN 103074281 A 9 8/9 页 10 0121 0122 注 ： 同行比较， 不同小写字母表示差异显著 （p 0.05） ， 不同大写字母表示差异极 显著 （p 0.01） ， 无标记或字母相同者表示差异不显著 （p 0.05） 。 0123 试验结果显示， 1 14d 和 15 28d， 1.0% 乳酸菌制剂组肉仔鸡平均日增重 显著高于对照组 （p0.05） ， 制剂组间平均日增重差异不显著 （p0.05） ， 1 14d， 抗生素组与其它各处 理间平均日增重无显著差异 （p0.05） ； 15 28d， 抗生素组平均日增重显著高于对照组 （p0.05） 。试验全期， 乳。

37、酸菌制剂组平均日增 重均显著高于对照组 （p0.05） 。 0124 15 28d， 1.0% 乳酸菌制剂组料肉比均显著低于对照组 （p0.05） ， 0.5% 制剂组、 抗生素与对照组之间料肉比差异均不显 著 （p0.05） 。试验全期， 制剂组料肉比均显著低于对照组 （p0.05） 。 0125 总体而言， 乳酸菌制剂和抗生素均能改善肉仔鸡的生长性能， 且 1.0% 制剂组优于 0.5% 制剂组和抗生素组。 0126 B、 盲肠菌群数量 ： 于试验第 15、 29 日， 随机在各重复取一只接近平均体重的试 鸡， 颈静脉放血处死， 立即解剖， 用无菌棉线结扎盲肠后取出， 无菌条件下称取盲肠内。

38、容物 0.5g， 10 倍稀释， 平板涂布法测定盲肠内乳酸菌和大肠杆菌数量。结果如表 3 ： 0127 表 3 乳酸菌制剂对雏鸡盲肠中乳酸菌和大肠杆菌数量的影响 （log10cfu/g） 0128 说 明 书 CN 103074281 A 10 9/9 页 11 0129 注 ： 同行比较， 不同小写字母表示差异显著 （p 0.05） ， 不同大写字母表示差异极 显著 （p 0.01） ， 无标记或字母相同者表示差异不显著 （p 0.05） 。 0130 2w 时， 1.0% 乳酸菌制剂组肉仔鸡盲肠内乳酸菌菌数显著高于对照组和抗生素组 （p0.05） ； 0.5% 乳酸菌制剂组乳酸 菌菌数显著。

39、高于抗生素组 （p0.05） ； 对照组乳酸菌 数显著高于抗生素组 （p0.05） ， 抗生素组大肠杆菌 数显著低于对照组 （p0.05） 。 0131 4w时， 1%和0.5%乳酸菌制剂组乳酸菌数显著高于抗生素组 （p0.05） ； 0.5% 和 1.0% 乳酸菌制剂组大肠杆菌数显著 低于其它处理组 （p0.05） 。 随着乳酸菌制剂添加量的增加， 盲肠内乳酸菌数增加， 大肠杆菌 数减少， 这表明， 乳酸菌能够优化肠道菌群结构。 0132 综上， 该菌株能够显著抑制鸡肠道内的大肠杆菌数量， 同时促进雏鸡生长， 可替代 传统的抗生素， 减少抗生素在动物饲养上的应用， 大大提高了生物安全性。 说 明 书 CN 103074281 A 11 1/2 页 12 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103074281 A 12 2/2 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 103074281 A 13 。