一种定向诱导间充质干细胞分化的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103146642 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146642 A *CN103146642A* (21)申请号 201310049416.8 (22)申请日 2013.02.07 C12N 5/074(2010.01) (71)申请人 中国人民解放军总医院第一附属医 院 地址 100048 北京市海淀区阜成路 51 号解 放军总医院第一附属医院烧伤整形科 (72)发明人 柴家科 李东杰 申传安 孙天骏 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 一种定向诱导间充质干细胞分化的方法 (。

2、57) 摘要 本发明公开了一种定向诱导间充质干细胞分 化的方法。本发明提供的定向诱导间充质干细胞 分化的方法， 包括如下步骤 ： 将离体的诱导细胞 接种并吸附于聚碳酸酯膜的下表面， 将离体的间 充质干细胞接种至所述聚碳酸酯膜的上表面， 然 后将所述诱导细胞和所述间充质干细胞共培养， 促使所述间充质干细胞分化为目标细胞 ； 所述间 充质干细胞和所述诱导细胞均不能通过所述聚碳 酸酯膜的孔径。UCMSCs 向表皮细胞的分化在未 来能够为临床皮肤再生的研究的进展起到有益作 用。 本发明为增加MSCs多向分化的诱导方法开拓 思路， 为进一步采用 UCMSCs 为种子细胞构建组织 工程皮肤提供依据。 (5。

3、1)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103146642 A CN 103146642 A *CN103146642A* 1/1 页 2 1. 一种定向诱导干细胞分化的方法， 包括如下步骤 ： 将离体的诱导细胞接种并吸附于 聚碳酸酯膜的下表面， 将离体的间充质干细胞接种至所述聚碳酸酯膜的上表面， 然后将所 述诱导细胞和所述间充质干细胞共培养， 促使所述间充质干细胞分化为目标细胞 ； 所述间 充质干细胞和所述诱导细。

4、胞均不能通过所述聚碳酸酯膜的孔径。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述诱导细胞为表皮干细胞。 3. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述诱导细胞为人表皮干细胞。 4. 如权利要求 1 至 3 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述目标细胞为表皮干细胞。 5. 如权利要求 4 所述的方法， 其特征在于 ： 所述目标细胞为人表皮干细胞。 6. 如权利要求 1 至 5 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述间充质干细胞为脐带间充 质干细胞。 7. 如权利要求 6 所述的方法， 其特征在于 ： 所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。 8. 如权利要求 1 至 7。

5、 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述聚碳酸酯膜的孔径为 0.2m-2.0m， 优选为 0.4-1.0m， 更加优选为 0.4m 或 1.0m。 9. 如权利要求 1 至 8 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述共培养是在细胞培养板的 培养孔和放置于所述培养孔上的 Transwell 小室中进行的。 权 利 要 求 书 CN 103146642 A 2 1/7 页 3 一种定向诱导间充质干细胞分化的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种定向诱导间充质干细胞分化的方法。 背景技术 0002 在体内或体外特定的诱导条件下， 间充质干细胞 （MSCs） 不仅可以分化为成骨细 胞、 脂肪细胞。

6、、 肌肉细胞等中胚层间质组织细胞,还可跨越胚层界限,分化为外胚层的神经 元、 神经胶质细胞及内胚层的肝细胞等。所以近年来 MSCs 成为基础医学和临床医学组织器 官损伤修复以及再生领域研究的热点。而实现 MSCs 向表皮细胞的分化是利用其构建组织 工程皮肤的关键步骤之一。 0003 MSCs 分化的程序是可能存在于其生存的微环境中的指导信号， 通过相应的信号转 导通路， 启动并强化关键基因表达， 实现细胞分化。其实质就是 MSCs 的基因在时空上特异 性表达， 合成相应的蛋白质， 从而细胞在生化、 结构和功能方面发生改变， 细胞表型随之差 异表现。 0004 指导转录因子及启动基因表达的信号可。

7、能存在于 MSCs 生存的微环境中， 研究表 明， 微环境中的各种因子表现类型、 浓度和应用次序则是影响 MSCs 分化的重要因素。细胞 局部的微环境包括细胞周围多种细胞因子、 激素、 基质细胞、 细胞外基质 （extracellular matrix， ECM） 等， 细胞因子的作用尤为重要， 不同的细胞因子作用下 MSCs 可分化为不同的 细胞类型。除了可溶性细胞信号分子外， 直接的细胞 - 细胞相互作用对于干细胞的分化也 是必要的。 Rangappa等利用接触培养和条件培养两种方法培养人骨髓间充质干细胞和心肌 细胞后， 发现混合培养组用 CMFDA 标记的骨髓间充质干细胞表达肌球蛋白重链。

8、、 -actin 和 cTnT， 而条件培养组只有 -actin 表达。体内外实验均显示， MSCs 与其他细胞 （蒲肯野 细胞、 心肌细胞和肝细胞等） 共培养时有自发的细胞融合， 且MSCs在没有诱导剂的情况下分 化成其他细胞， 提示细胞融合可能是促使 MSCs 分化的原因之一。 0005 MSCs 的分化与其生长的微环境有密切关系， 因此， 体外诱导 MSCs 分化是通过采取 不同的方法模拟体内相应组织细胞生长的真实环境和必要条件。 0006 利用目标细胞参与进行共培养诱导的方法往往比较简便易行。 直接接触式共培养 利用 MSCs 与其他细胞共培养时有自发的细胞融合， 或细胞的自分泌与旁分。

9、泌必要的细胞 因子， MSCs 在没有诱导剂的情况下分化成其他细胞。但这种诱导方法存在两种细胞的分离 比较困难的最大缺点， 为后续的鉴定或应用带来障碍。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种定向诱导间充质干细胞分化的方法。 0008 本发明提供了一种定向诱导间充质干细胞分化的方法， 包括如下步骤 ： 将离体的 诱导细胞接种并吸附于聚碳酸酯膜的下表面， 将离体的间充质干细胞接种至所述聚碳酸酯 膜的上表面， 然后将所述诱导细胞和所述间充质干细胞共培养， 促使所述间充质干细胞分 化为目标细胞 ； 所述间充质干细胞和所述诱导细胞均不能通过所述聚碳酸酯膜的孔径。所 说 明 书 CN 1031466。

10、42 A 3 2/7 页 4 述目标细胞为非胚胎干细胞。 0009 所述诱导细胞可为表皮干细胞， 具体可为人表皮干细胞。所述目标细胞可为表皮 干细胞， 具体可为人表皮干细胞。 所述间充质干细胞可为脐带间充质干细胞， 具体可为人脐 带间充质干细胞。 0010 所述聚碳酸酯膜的孔径可为 0.2m-2.0m， 优选为 0.4-1.0m， 更加优选为 0.4m 或 1.0m。 0011 所述共培养具体可在细胞培养板的培养孔和放置于所述培养孔上的 Transwell 小室中进行。所述共培养时， 所述诱导细胞的培养在细胞培养板的培养孔进行。所述间充 质干细胞的培养在 Transwell 小室中进行。所述聚。

11、碳酸酯膜可以阻断细胞通过， 所述诱导 细胞分泌的诱导因子通过所述聚碳酸酯膜后诱导间充质干细胞定向分化为具有所述诱导 细胞属性的目标细胞。 0012 所述表皮干细胞表现为表达 P63、 CK19 和 1-integrin 的细胞。P63、 CK19 和 1-integrin 是三种早期表皮细胞的标志物， P63 经常用来鉴定表皮干细胞， 而 CK19 和 1-integrin 是表皮干细胞相对特异的标志物。缺乏 1-integrin 会显著影响体外角质 细胞的分化， 而持续表达的 1-integrin 对于维持表皮干细胞的特性是重要的。 0013 近年来利用 Transwell 技术通过共培养对。

12、间充质干细胞进行非直接接触式 共培养诱导分化越来越多的得到应用， 通常是将间充质干细胞与诱导细胞分别接种于 Transwell 上下室之中， 通过诱导细胞生长为间充质干细胞创造适宜分化的微环境， 通过旁 分泌等方式诱导间充质干细胞发生分化以及表型的转变。 而间充质干细胞与诱导细胞不直 接接触是 Transwell 技术的特点之一， 能够使得诱导后的细胞成分相对单一， 避免了分选、 纯化或标记等繁琐步骤， 为方便诱导后细胞的鉴定及应用奠定基础。 0014 本发明中先通过对 UCMSCs 在不同孔径常用 Transwell 插件聚碳酸酯膜生长以及 迁移情况进行观察， 确定0.4m的孔径和1.0m的。

13、孔径可以阻断细胞迁移， 为进一步采用 合适孔径的聚碳酸酯膜正反两面培养细胞提供前期实验准备。根据上述实验结果， 本发明 建立了预培养目标细胞的新型间接接触式共培养方法， 将脐带间充质干细胞与表皮干细胞 于聚碳酸酯膜正反两面进行共培养， 提供了双层 ESCs 生长的环境， 尤其是膜底面的 hESCs 能够近距离的提供稳定的局部微环境， 并不排除 UCMSCs 与 ESCs 通过聚碳酸酯膜微孔有直 接接触， 扫描电镜发现细胞伪足能够探入微孔， 大大提高了诱导效率， 而同时， 聚碳酸酯膜 物理性地隔开了两种细胞。使用这种系统诱导 UCMSCs 分化 并不需要将干细胞与目标细胞 进行混合， 也不需要特。

14、定的诱导液。而这种隔离能够简化鉴定诱导后细胞的步骤。UCMSCs 能够在本发明提供的新型的非直接接触式共培养系统内诱导分化为表皮样细胞。 0015 本发明为新型非直接接触式共培养在 UCMSCs 分化为表皮样细胞中的应用提供了 实验依据。 同样， 该共培养系统也可应用于其它类型细胞的分化研究， 在基础课题以及临床 研究中具有潜在的重要价值。而 UCMSCs 向表皮细胞的分化在未来能够为临床皮肤再生的 研究的进展起到有益作用。本发明为增加 MSCs 多向分化的诱导方法开拓思路， 为进一步采 用 UCMSCs 为种子细胞构建组织工程皮肤提供依据。 附图说明 0016 图 1 为实施例 1 中扫描电。

15、镜下 UCMSCs 在不同孔径聚碳酸酯膜的生长、 迁移情况 说 明 书 CN 103146642 A 4 3/7 页 5 （1500） 。 0017 图 2 为实施例 2 中的分组处理的流程示意图。 0018 图 3 为实施例 2 中扫描电镜观察的照片。 0019 图 4 为实施例 2 中相差显微镜观察的照片。 0020 图 5 为实施例 2 中免疫荧光检测的结果。 0021 图 6 为实施例 2 中 Western Blotting 图谱。 0022 图 7 为实施例 2 中实时定量 PCR 检测结果。 0023 图 8 为实施例 2 中流式细胞术检测结果。 具体实施方式 0024 以下的实。

16、施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。实施例中， 应用 SPSS13.0 统计分析软件进行统计学分析， 数据以表示， 采用单因 素方差分析比较， 以 P 0.01 为统计学差异有显著意义。1 整合素 (1-integrin)、 角 蛋白 19（CK19） 和 P63 均为表皮干细胞的主要标志物。 0025 人表皮干细胞 （Epidermal Stem Cells,ESCs） ： 杨。

17、亚东,伍津津,朱堂友,毕建军， 表皮干细胞的分选鉴定及培养， 重庆医学 2008 年 2 月第 37 卷第 3 期， 275-281 ； 马英智 , 王 心蕊 , 何旭 , 牛云 , 李玉林， 人表皮干细胞的分离、 纯化培养及鉴定， 中国实验诊断学 2009 年2月第13卷第2期， 143-145 ； Zeng Yuan-lin1,Xin Guo-hua1,Qiu Ze-liang2， In vitro isolation and culture of human epidermal stemCells， 中国组织工程研究与临床康复 第 12 卷第 43 期 20081021 出版， 8597。

18、-8600。 0026 人脐带间充质干细胞 （UCMSCs， 脐带 MSCs） ： 侯克东卢世璧张莉袁玫孙明学彭江赵 斌眭翔许文静， 人脐带 Wharton 胶中间充质干细胞的分离、 培养与鉴定， 解放军 医学杂志 2008 年 4 月第 33 卷第 4 期， 375-378。 0027 Dispease 酶 ： Gibco（美国） 。HKGS（人角质化细胞培养因子） ： Gibco（美国） 。 Trypsin-EDTA ： Gibco（美国） 。人胎盘型胶原 ： Sigma（美国） 。青霉素 - 链霉素 ： PAA（德 国） 。两性霉素 B ： PAA（德国） 。TE ： Gibco（美国）。

19、 。DTI ： Gibco（美国） 。Eplife 培养基 ： Gibco （美国） 。DMEM 培养基 ： Gibco （美国） 。DMSO ： Amresco （美国） 。丝裂霉素 C ： Roche （美 国） 。FBS ： Gibco（美国） 。 0028 针对 CK19 的一抗为兔抗人 CK19 单克隆抗体 ： Abcam（美国） 。针对 P63 的一抗为 兔抗人 P63 单克隆抗体 ： Abcam （美国） 。针对 1-integrin 的一抗为鼠抗人 1-integrin 单克隆抗体 ： Abcam （美国） 。FITC 标记的羊抗兔 IgG ： Abcam （美国） 。PE 标。

20、记的羊抗兔 IgG ： Abcam（美国） 。鼠抗人 GAPDH 单克隆抗体 ： 北京中杉金桥。HRP 标记羊抗鼠 IgG ： 北京中杉 金桥。HRP 标记羊抗兔 IgG ： 北京中杉金桥。 0029 间充质干细胞培养基 ： 含 100U/ml 青霉素、 0.1mg/ml 链霉素和 2.5g/ml 两性霉 素 B 的 DMEM/F12 培养基。 0030 表皮干细胞培养基 ： 含100U/ml青霉素、 0.1mg/ml链霉素和2.5g/ml两性霉素B 的 Eplife 培养基。 说 明 书 CN 103146642 A 5 4/7 页 6 0031 PBS 缓冲液 （pH7.4） ： NaCl。

21、8.0g、 KCl0.2g、 Na2HPO41.44g、 KH2PO40.24g、 蒸馏水定容 至 1000ml， 用 Na2HPO4或 KH2PO4调节 pH 至 7.4。 0032 实施例 1、 脐带间充质干细胞在不同孔径聚碳酸酯膜的生长及迁移 0033 一、 分组处理 0034 1、 将脐带间充质干细胞用含10mg/L丝裂霉素C的间充质干细胞培养基处理3h， 然 后用间充质干细胞培养基洗涤细胞并悬浮细胞。 0035 2、 分组处理 ： 0036 第一组 ： 将 6 个 Transwell 小室 （底部的聚碳酸酯膜的直径为 24mm、 孔径为 0.4m、 厚度为 10m） 放置于 6 孔细。

22、胞培养板上 ； 0037 第二组 ： 将 6 个 Transwell 小室 （底部的聚碳酸酯膜的直径为 24mm、 孔径为 1.0m、 厚度为 10m） 放置于 6 孔细胞培养板上 ； 0038 第三组 ： 将 6 个 Transwell 小室 （底部的聚碳酸酯膜的直径为 24mm、 孔径为 3.0m、 厚度为 10m） 放置于 6 孔细胞培养板上 ； 0039 第四组 ： 将 6 个 Transwell 小室 （底部的聚碳酸酯膜的直径为 24mm、 孔径为 8.0m、 厚度为 10m） 放置于 6 孔细胞培养板上。 0040 3、 将步骤 1 得到的细胞接种于步骤 2 得到的细胞培养板上的 。

23、Transwell 小室中， 每个小室接种 1.5105个细胞， 细胞贴壁后， 在 Transwell 小室中加入间充质干细胞培养 基， 在 Transwell 小室下的培养孔中加入间充质干细胞培养基， 在 37、 5%CO2培养箱内培 养 7 天， 每天将 Transwell 小室和培养孔中的培养基更换为新鲜培养基。 0041 二、 统计细胞迁移率 0042 完成步骤一后在相差显微镜下观察、 计数迁移至膜底面的细胞数， 高倍镜 （400） 下视野直径为 560m， 随机选取 6 个视野计数。重复实验 3 次， 计算每个视野下平均细胞 数。 根据视野面积与聚碳酸酯膜面积的比率， 计算不同孔径聚。

24、碳酸酯膜背面 （朝向培养孔的 面） 上 UCMSCs 的总数， 并根据计算迁移率。 0043 0044 第一组 （0.4m 组） 的细胞迁移率为 0%。第二组 （1.0m 组） 的细胞迁移率为 0%。 第三组 （3.0m组） 的细胞迁移率为1.8%。 第四组 （8.0m） 组的细胞迁移率为8.0%。 3.0m 组和 8.0m 组 UCMSCs 迁移率与 0.4m 组相比， 差异均有统计学意义 （均 P 0.01） 。 0045 三、 扫描电镜观察 0046 完成步骤一后， 取聚碳酸酯膜， 用4预冷3%戊二醛固定12小时， 然后用PBS缓冲 液浸洗， 然后用 4预冷的 1% 锇酸固定 1h， 然。

25、后依次用体积分数为 0.70、 0.85、 0.95、 1.00 的乙醇梯度脱水， 每次 15min， 临界点干燥， 将聚碳酸酯膜的正面 （朝向 Transwell 小室的 面） 、 背面 （朝向培养孔的面） 以及断面分别粘台后行真空纯金镀膜， 在 HITACHI S-3400N 型 扫描电镜下观察 UCMSCs 在其上生长的情况， 拍摄图像。 0047 扫描电镜下 UCMSCs 在不同孔径聚碳酸酯膜的生长、 迁移情况 （1500） 见图 1。图 1 中 ： A-1 为 0.4m 孔径组正面， A-2 为 0.4m 孔径组背面， A-3 为 0.4m 孔径组断面， 可 以观察到0.4m孔径组正。

26、面有较多的UCMSCs贴壁生长， 背面未发现明显的贴壁细胞， 断面 说 明 书 CN 103146642 A 6 5/7 页 7 可见 UCMSCs 向微孔变形探入 ； B-1 为 3.0m 孔径组正面， B-2 为 3.0m 孔径组背面， B-3 为 3.0m 孔径组断面， 可以观察到 3.0m 孔径组背面出现贴壁生长的 UCMSCs， 断面可见 微孔孔径明显增大， UCMSCs 向微孔变形探入程度增加 ； C-1 为 8.0m 孔径组正面， C-2 为 8.0m 孔径组背面， C-3 为 8.0m 孔径组断面， 可以观察到 8.0m 孔径组正面贴壁生长的 UCMSCs 多有部分探入微孔， 。

27、背面微孔可见较多细胞探出生长或对侧细胞伪足， 断面可见微 孔孔径明显增大， UCMSCs 向微孔探入生长。1.0m 孔径组的照片与 0.4m 孔径组的照片 基本一致， 无显著差异。 0048 结果表明 ： 0.4m 孔径组和 1.0m 孔径组聚碳酸酯膜正面细胞贴壁生长， 底面未 见有细胞出现， 断面可见微孔狭小， 无明显细胞穿越 ； 与0.4m组相比， 3.0m组和8.0m 组聚碳酸酯膜孔径明显增大， 底面均有 UCMSCs 迁移生长， 8.0m 组细胞部分探出微孔生长 较为明显， 两种膜断面微孔粗大， 均可发现细胞变形探入孔内， 细 胞穿越迁移机会增大， 与 相差显微镜下观察计算的迁移率趋势。

28、相一致。 0049 结果表明 ： 0.4m 孔径聚碳酸酯膜和 1.0m 孔径聚碳酸酯膜能够有效地阻止细 胞的穿越和迁移， 发明人设想， 如果能在0.4m聚碳酸酯膜或1.0m孔径聚碳酸酯膜的双 侧接种不同细胞的进行近距离非直接接触式共培养可以显著地拉近两种细胞的距离， 局部 可溶性细胞因子浓度显著增高， 得到接近于直接接触式共培养的效果， 或许能够提高共培 养诱导间充质干细胞分化的效率。 0050 实施例 2、 新型 Transwell 共培养诱导 UCMSCs 向表皮样细胞分化 0051 一、 分组处理 0052 1、 将人表皮干细胞用含 10mg/L 丝裂霉素 C 和 10% 小牛血清的表皮。

29、干细胞培养基 处理 3h， 然后用表皮干细胞培养基洗涤细胞并悬浮细胞。 0053 2、 将脐带间充质干细胞用含 10% 小牛血清的间充质干细胞培养基处理 3h， 然后用 间充质干细胞培养基洗涤细胞并悬浮细胞。 0054 3、 分组处理 0055 第一组 （流程示意图见图 2A， Transwell 小室底部聚碳酸酯膜正反两面共培养） ： 无 菌条件下， 取 6 个 Transwell 小室 （底部的聚碳酸酯膜的直径为 24mm、 孔径为 0.4m、 厚度 为 10m） ， 倒扣于盛有少量生理盐水的无菌 15cm 培养皿中， 将步骤 1 得到的细胞悬液逐滴 滴于聚碳酸酯膜的背面 （每个聚碳酸酯膜。

30、滴加 0.75mL 浓度为 2105个细胞 /mL 的细胞悬 液） ， 注意避免液体流下， 依靠液体表面张力铺满整个聚碳酸酯膜背面而不致流散。盖好皿 盖后置于 5%CO2培养箱 37条件下静置 6h（此时在显微镜下观察可见 ESCs 贴壁展开） ， 然 后将 Transwell 小室放置于 6 孔细胞培养板上， 每个 Transwell 小室的聚碳酸酯膜正面接 种1105个脐带间充质干细胞 （步骤2得到的细胞悬液） ， 在37、 5%CO2培养箱内培养10天 （每两天用新鲜的间充质干细胞培养基更换Transwell小室中的培养基， 每两天用新鲜的表 皮干细胞培养基更换培养孔中的培养基） 。 0。

31、056 第二组 （流程示意图见图 2B， 传统 Transwell 小室非接触式共培养） ： 无菌条件下， 取 6 孔细胞培养板， 将步骤 1 得到的细胞悬液接种于培养孔底部 （每个孔接种 0.75mL 浓度 为2105个细胞/mL的细胞悬液） ， 细胞贴壁展开后， 在细胞培养板上放置6个Transwell小 室 （底部的聚碳酸酯膜的直径为 24mm、 孔径为 0.4m、 厚度为 10m） ， 向每个 Transwell 小 室的聚碳酸酯膜正面接种 1105个脐带间充质干细胞 （步骤 2 得到的细胞悬液） ， 在 37、 说 明 书 CN 103146642 A 7 6/7 页 8 5%CO2。

32、培养箱内培养 10 天 （每两天用新鲜的间充质干细胞培养基更换 Transwell 小室中的 培养基， 每两天用新鲜的表皮干细胞培养基更换培养孔中的培养基） 。 0057 第三组 ： 无菌条件下， 在 6 孔细胞培养板上放置 6 个 Transwell 小室， 向每个 Transwell小室 （底部的聚碳酸酯膜的直径为24mm、 孔径为0.4m、 厚度为10m） 的聚碳酸 酯膜正面接种 1105个脐带间充质干细胞 （步骤 2 得到的细胞悬液） ， 在 37、 5%CO2培养箱 内培养 10 天在 37、 5%CO2培养箱内培养 10 天 （每两天用新鲜的含 10% 小牛血清间充质干 细胞培养基。

33、更换 Transwell 小室中的培养基） 。 0058 二、 扫描电镜观察 0059 将第一组处理中的聚碳酸酯膜的膜断面进行扫描电镜观察， 结果见图 3。图 3 中， A 为 1500 倍放大， B 为 5000 倍放大。可见某些 UCMSCs 向膜微孔内轻度变形探入， 两种细胞 间的距离进一步拉近， 未观察到细胞有迁移穿越的情况， 从而表明两种细胞的距离减小到 尽可能小， 但细胞却没有混杂。 0060 三、 采用相差显微镜观察 0061 步骤一结束后， 消化并收集聚碳酸酯膜正面的细胞， 接种于新的培养皿后通过相 差显微镜观察， 照片见图 4。图 4 中， A 为第一组 ,B 为第三组。采用。

34、聚碳酸酯膜双面非直接 接触的共培养 10d 后， UCMSCs 细胞外形呈现扁圆的多角形， 杂乱生长， 而未经诱导的细胞外 观仍为梭形或长多角形， 呈漩涡状生长。 0062 四、 免疫荧光检测 0063 步骤一结束后， 消化并收集聚碳酸酯膜正面的细胞， 进行细胞爬片 ； 在 5%CO2培 养箱 37条件下培养 48h 后取出细胞爬片， 用 PBS 缓冲液冲洗 2 次 ； 用 4% 多聚甲醛固定 10min， 晾干， 用 PBS 缓冲液漂洗 3 次 （每次 5min） ； 用 0.3%Triton X-100 破膜 20min， 用 PBS 缓冲液漂洗 3 次 （每次 5min） ； 用非免疫血。

35、清室温封闭 10min， 滴加特异性一抗 （针对 CK19 的一抗、 针对 P63 的一抗或针对 1-integrin 的一抗） ， 37孵育 60min， 用 PBS 缓冲液漂 洗 3 次 （每次 5min） ； 滴加荧光素标记的二抗 （FITC 标记抗体， 稀释度 1:100） ， 37避光孵育 30min， 用 PBS 缓冲液漂洗 3 次 （每次 5min） ； DAPI 溶液复染细胞核 15min， 用 PBS 缓冲液漂 洗 3 次 （每次 5min） ； 用抗荧光淬灭剂封片后荧光显微镜下观察细胞表达早期表皮细胞标志 物的情况并照相， 采用 Image-Pro Plus v6.0 软件。

36、分析并 Merge 图像。 0064 照片 （100） 见图 5。图 5 中 ： -1 代表第一组， -2 代表第三组 ； A 代表 P63， B 代表 CK19， C 代表 1-integrin。采用聚碳酸酯膜双面非直接接触的共培养 10d 后 （即第一组） ， 细胞三种抗体均呈现绿色荧光表达， 表明经过诱导后细胞出现了早期表皮细胞的表型。未 诱导组 （即第三组） 的 CK19 和 P63 未显色， 呈阴性表达。 0065 五、 Western Blotting 检测 0066 步骤一结束后， 消化并收集聚碳酸酯膜正面的细胞， 采用 RIPA 法裂解细胞， 收集 总蛋白。将总蛋白进行 Wes。

37、tern Blotting 检测， 分别采用针对 CK19 的一抗、 针对 P63 的一 抗或针对 1-integrin 的一抗。采用 GAPDH 蛋白作为内参蛋白。 0067 Western Blotting 图谱见图 6。采用聚碳酸酯膜双面非直接接触的共培养 10d 后 （即第一组） ， 细胞中 P63 和 CK19 呈现阳性。未诱导组 （即第三组） 的 P63 和 CK19 为阴性。 0068 六、 实时定量 PCR 检测 0069 步骤一结束后， 消化并收集聚碳酸酯膜正面的细胞， 提取总 RNA 并反转录为 cDNA， 说 明 书 CN 103146642 A 8 7/7 页 9 以 。

38、cDNA 为模板， 分别实时定量 PCR 检测 P63 基因、 CK19 基因和 1-integrin 基因的表达 量。将 actin 基因作为内参基因。 0070 用于鉴定 actin 基因的引物对如下 （靶序列约 205bp） ： 0071 F（序列表的序列 1） ： 5-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ； 0072 R（序列表的序列 2） ： 5-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3。 0073 用于鉴定 CK19 基因的引物对如下 （靶序列约 150bp） ： 0074 F ： 5-TGAAAGCTGCCTTGGAAGACA-3 ； 0075 R ： 5-GCCG。

39、CTGGTACTCCTGATTCT-3。 0076 用于鉴定 P63 基因的引物对如下 （靶序列约 174bp） ： 0077 F ： 5-CCTCGTCCACCAGTCCCTATAAC-3 ； 0078 R ： 5-TGCTCGACTGCTGGAAGGA-3。 0079 用于鉴定 1-integrin 基因的引物对如下 （靶序列约 170bp） ： 0080 F ： 5-AGTGCTCCCACTTCAATCTCACCA-3 ； 0081 R ： 5-TCTCCTTGCAATGGGTCACAGGAT-3。 0082 数据分析软件为 7500Fast System SDS Software。mR。

40、NA 表达的相对量数据以 RQ 值表示， 其计算方式如下 ： 0083 RQ 值 =2(-ddCt)。 0084 以 Actin 做为内参， 设置第三组目的基因的表达量为 1， 以倍比关系分析第一组和 第二组目的基因的相对表达量。 0085 结果见图 7。与未诱导组 （即第三组） 相比， 采用聚碳酸酯膜双面非直接接触的共 培养 10d 后 （即第一组） ， 细胞中 P63 和 CK19 两种基因的表达水平显著升高 （p 0.01） ， 1integrin 基因表达水平没有明显变化， 正常 UCMSCs 即有 1-integrin 基因表达， 因此 诱导后 1-integrin 基因仍然表达。 。

41、0086 七、 流式细胞术检测 0087 以 CK19 为参考标志物， 应用流式细胞术对比分析第一组 （改进后的 Transwell 共 培养方法） 与第二组 （传统 Transwell 共培养方法） 相比诱导效率的差别。步骤如下 ： 0088 1、 步骤一结束后， 消化并收集聚碳酸酯膜正面的细胞， 用间充质干细胞培养基制 成细胞浓度为 1106/ml 的细胞悬液。 0089 2、 取细胞悬液， 加入山羊血清反应 10min， 阻断非特异抗体结合位点。 0090 3、 加入针对 CK19 的一抗， 作用 1h。 0091 4、 用 PBS 缓冲液充分洗去未结合的一抗。 0092 5、 加入荧光。

42、素标记的二抗， 避光反应 30min。 0093 6、 用 PBS 缓冲液充分洗去未结合的二抗。 0094 7、 用 1% 多聚甲醛固定后上流式细胞仪检测。 0095 照片见图 8A， 阳性率 （CK19 阳性细胞占计数细胞的比例） 统计结果见图 8B。 0096 与传统共培养对照组 （即第二组） 相比， UCMSCs 经新型共培养 10d 后 （即第一组） ， 细胞中 CK19 表达阳性率显著升高 （P 0.01） 。 0097 用1.0m孔径聚碳酸酯膜代替0.4m孔径聚碳酸酯膜进行实施例2， 结果与采用 0.4m 孔径聚碳酸酯膜的结果一致。 说 明 书 CN 103146642 A 9 1/1 页 10 0001 序 列 表 CN 103146642 A 10 1/5 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103146642 A 11 2/5 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103146642 A 12 3/5 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 103146642 A 13 4/5 页 14 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103146642 A 14 5/5 页 15 图 8 说 明 书 附 图 CN 103146642 A 15 。