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1、(10)申请公布号 CN 103160497 A (43)申请公布日 2013.06.19 CN 103160497 A *CN103160497A* (21)申请号 201310116785.4 (22)申请日 2013.04.07 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 北京市水产科学研究所 地址 100068 北京市丰台区角门 18 号 (72)发明人 张升利 梁拥军 张欣 孙向军 (74)专利代理机构 天津市鼎和专利商标代理有 限公司 12101 代理人 崔继民 (54) 发明名称 一种快速提取鱼类总 RNA 的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种快速提取鱼类总 RN。
2、A 的 方法， 它是将鱼类软组织经液氮速冻、 研钵研磨、 TRNzol 裂解液处理后低温高速离心， 再经氯仿萃 取后异丙醇沉淀并经预冷的 75% 乙醇洗涤而获得 鱼类 RNA 的方法。本发明针对 RNA 易降解的特性 而开发， 成本低、 稳定性高、 速度快， 优于原提取鱼 类总 RNA 的方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103160497 A CN 103160497 A *CN103160497A* 1/1 页 2 1.。
3、 一种快速提取鱼类总 RNA 的方法， 其特征在于， 将鱼类软组织经液氮速冻、 研钵研 磨、 TRNzol 裂解液处理后低温高速离心， 再经氯仿萃取后异丙醇沉淀并经预冷的乙醇溶液 洗涤而获得鱼类 RNA。 2. 根据权利要求 1 所述的快速提取鱼类总 RNA 的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 取鱼类软组织， 迅速投入装有液氮的保温桶内， 经液氮速冻 ； （2） 将速冻的鱼类软组织迅速置于装有液氮的研钵内， 充分研磨成细粉， 研磨过程中反 复补充研钵内的液氮， 将研磨成细粉的鱼类软组织收集至一处， 并迅速用 TRNzol 裂解液均 匀覆盖， 室温静置至融化， 待完全融化后再研磨，。
4、 保证研磨充分并混合均匀， 并转移至的离 心管中静置 ； （3） 4， 11000-13000r/min， 离心， 取上清， 加入氯仿， 剧烈震荡， 室温静止 ； （4） 4， 11000-13000r/min， 离心， 取上清， 加入异丙醇， 颠倒混匀， 室温放置， 4， 11000-13000r/min， 离心， 弃上清 ； （5） 用预冷的乙醇溶液洗涤沉淀， 4， 7000-8000r/min， 离心， 吸掉乙醇， 干燥后用无核 酸酶水溶解 ； （6） 经琼脂糖凝胶电泳检测后直接进行反转录或置于 -80冰箱内保存。 3. 根据权利要求 2 所述的快速提取鱼类总 RNA 的方法， 其特征在。
5、于， 包括以下步骤 ： （1） 取 0.1g 鱼类软组织， 迅速投入装有液氮的保温桶内， 经液氮速冻 ； （2） 将速冻的鱼类软组织迅速置于装有液氮的研钵内， 充分研磨成细粉， 研磨过程中反 复补充研钵内的液氮， 将研磨成细粉的鱼类软组织收集至一处， 并迅速用 1mLTRNzol 裂解 液均匀覆盖， 室温静置至融化， 待完全融化后再研磨一遍， 以保证研磨充分并混合均匀， 并 转移至 1.5ml 的离心管中静置 5min ； （3） 4， 11000-13000r/min， 离心 10min， 小心吸取上清至一新离心管中， 加入 200uL 氯 仿， 剧烈震荡 15s， 室温静止 5min ； 。
6、（4） 4， 11000-13000r/min， 离心 15min， 取上清， 移入一新的 1.5mL 离心管中， 加入 500uL 异丙醇， 颠倒混匀， 室温放置 10min， 4， 11000-13000r/min， 离心 10min， 弃上清 ； （5） 用预冷的质量百分比浓度 75% 乙醇洗涤沉淀， 4， 7000-8000r/min， 离心 5min， 小 心吸掉乙醇， 超净工作台干燥 2-3min 后用 30uL 无核酸酶水溶解 ； （6） 经琼脂糖凝胶电泳检测后直接进行反转录或置于 -80冰箱内保存。 4.根据权利要求1、 2或3所述的快速提取鱼类总RNA的方法， 其特征在于， 。
7、所述鱼类软 组织为新鲜的肌肉、 肝脏、 性腺和大脑。 权 利 要 求 书 CN 103160497 A 2 1/3 页 3 一种快速提取鱼类总 RNA 的方法 技术领域 0001 本发明涉及提取鱼类总RNA的方法， 特别是涉及一种快速提取鱼类总RNA的方法。 背景技术 0002 提取鱼类总 RNA 是鱼类分子生物学研究的一种基础手段， 近年来研究人员发明了 多种提取鱼类总 RNA 的方法， 但这些方法均存在提取时间长、 RNA 容易降解等问题， 增加了 试验的难度， 提高了试验成本。 发明内容 0003 本发明的目的在于克服上述技术的不足， 提供一种快速提取鱼类总 RNA 的方法。 0004 。
8、为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是 ： 一种快速提取鱼类总 RNA 的 方法， 将鱼类软组织经液氮速冻、 研钵研磨、 TRNzol 裂解液处理后低温高速离心， 再经氯仿 萃取后异丙醇沉淀并经预冷的乙醇溶液洗涤而获得鱼类 RNA。 0005 包括以下步骤 ： 0006 （1） 取鱼类软组织， 迅速投入装有液氮的保温桶内， 经液氮速冻 ； 0007 （2） 将速冻的鱼类软组织迅速置于装有液氮的研钵内， 充分研磨成细粉， 研磨过程 中反复补充研钵内的液氮， 将研磨成细粉的鱼类软组织收集至一处， 并迅速用 TRNzol 裂解 液均匀覆盖， 室温静置至融化， 待完全融化后再研磨， 保证研磨充。
9、分并混合均匀， 并转移至 的离心管中静置 ； 0008 （3） 4， 11000-13000r/min， 离心， 取上清， 加入氯仿， 剧烈震荡， 室温静止 ； 0009 （4） 4， 11000-13000r/min， 离心， 取上清， 加入异丙醇， 颠倒混匀， 室温放置， 4， 11000-13000r/min， 离心， 弃上清 ； 0010 （5） 用预冷的乙醇溶液洗涤沉淀， 4， 7000-8000r/min， 离心， 吸掉乙醇， 干燥后用 无核酸酶水溶解 ； 0011 （6） 经琼脂糖凝胶电泳检测后直接进行反转录或置于 -80冰箱内保存。 0012 具体包括以下步骤 ： 0013 （。
10、1） 取 0.1g 鱼类软组织， 迅速投入装有液氮的保温桶内， 经液氮速冻 ； 0014 （2） 将速冻的鱼类软组织迅速置于装有液氮的研钵内， 充分研磨成细粉， 研磨过程 中反复补充研钵内的液氮， 将研磨成细粉的鱼类软组织收集至一处， 并迅速用 1mLTRNzol 裂解液均匀覆盖， 室温静置至融化， 待完全融化后再研磨一遍， 以保证研磨充分并混合均 匀， 并转移至 1.5ml 的离心管中静置 5min ； 0015 （3） 4， 11000-13000r/min， 离心 10min， 小心吸取上清至一新离心管中， 加入 200uL 氯仿， 剧烈震荡 15s， 室温静止 5min ； 0016 。
11、（4） 4， 11000-13000r/min， 离心 15min， 取上清， 移入一新的 1.5mL 离心管中， 加 入 500uL 异丙醇， 颠倒混匀， 室温放置 10min， 4， 11000-13000r/min， 离心 10min， 弃上清 ； 0017 （5）用预冷的质量百分比浓度 75% 乙醇洗涤沉淀， 4， 7000-8000r/min， 离心 说 明 书 CN 103160497 A 3 2/3 页 4 5min， 小心吸掉乙醇， 超净工作台干燥 2-3min 后用 30uL 无核酸酶水溶解 ； 0018 （6） 经琼脂糖凝胶电泳检测后直接进行反转录或置于 -80冰箱内保存。。
12、 0019 所述鱼类软组织为新鲜的肌肉、 肝脏、 性腺和大脑。 0020 本发明的有益效果是 ： 0021 1、 能在1小时内就可以获得用于反转录的鱼类总RNA样品， 比原来提取鱼类总RNA 的方法大大的缩短的时间， 提高了工作效率。 0022 2、 成本低， 其稳定性、 准确性优于原来提取鱼类总 RNA 的方法。 0023 3、 用研钵配合液氮对组织进行研磨， 避免了 RNA 在研磨过程中的降解， 同时也避 免了研磨不充分的问题， 另外直接用 TRNzol 裂解液覆盖组织粉末避免了组织粉末在转移 过程中造成的 RNA 不必要的降解。 0024 4、 用预冷的 75% 乙醇洗涤沉淀， 能够获得。
13、更好的实验结果。 0025 5、 本发明提取的鱼类的总 RNA 既可以直接进行反转录， 还可以 -80保存备用。 附图说明 0026 图 1 是现有技术所得 RNA 样品经电泳检测拍照效果。 0027 图 2 是本发明方法所得 RNA 样品经电泳检测拍照效果。 具体实施方式 0028 下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明 ： 0029 本发明的快速提取鱼类总 RNA 的方法， 将鱼类软组织经液氮速冻、 研钵研磨、 TRNzol 裂解液处理后低温高速离心， 再经氯仿萃取后异丙醇沉淀并经预冷的乙醇溶液洗涤 而获得鱼类 RNA。 0030 包括以下步骤 ： 0031 （1） 取鱼类软组织， 。
14、迅速投入装有液氮的保温桶内， 经液氮速冻 ； 0032 （2） 将速冻的鱼类软组织迅速置于装有液氮的研钵内， 充分研磨成细粉， 研磨过程 中反复补充研钵内的液氮， 将研磨成细粉的鱼类软组织收集至一处， 并迅速用 TRNzol 裂解 液均匀覆盖， 室温静置至融化， 待完全融化后再研磨， 保证研磨充分并混合均匀， 并转移至 的离心管中静置 ； 0033 （3） 4， 11000-13000r/min， 离心， 取上清， 加入氯仿， 剧烈震荡， 室温静止 ； 0034 （4） 4， 11000-13000r/min， 离心， 取上清， 加入异丙醇， 颠倒混匀， 室温放置， 4， 11000-1300。
15、0r/min， 离心， 弃上清 ； 0035 （5） 用预冷的乙醇溶液洗涤沉淀， 4， 7000-8000r/min， 离心， 吸掉乙醇， 干燥后用 无核酸酶水溶解 ； 0036 （6） 经琼脂糖凝胶电泳检测后直接进行反转录或置于 -80冰箱内保存。 0037 具体包括以下步骤 ： 0038 （1） 取 0.1g 鱼类软组织， 迅速投入装有液氮的保温桶内， 经液氮速冻 ； 0039 （2） 将速冻的鱼类软组织迅速置于装有液氮的研钵内， 充分研磨成细粉， 研磨过程 中反复补充研钵内的液氮， 将研磨成细粉的鱼类软组织收集至一处， 并迅速用 1mLTRNzol 裂解液均匀覆盖， 室温静置至融化， 待。
16、完全融化后再研磨一遍， 以保证研磨充分并混合均 说 明 书 CN 103160497 A 4 3/3 页 5 匀， 并转移至 1.5ml 的离心管中静置 5min ； 0040 （3） 4， 11000-13000r/min， 离心 10min， 小心吸取上清至一新离心管中， 加入 200uL 氯仿， 剧烈震荡 15s， 室温静止 5min ； 0041 （4） 4， 11000-13000r/min， 离心 15min， 取上清， 移入一新的 1.5mL 离心管中， 加 入 500uL 异丙醇， 颠倒混匀， 室温放置 10min， 4， 11000-13000r/min， 离心 10min，。
17、 弃上清 ； 0042 （5）用预冷的质量百分比浓度 75% 乙醇洗涤沉淀， 4， 7000-8000r/min， 离心 5min， 小心吸掉乙醇， 超净工作台干燥 2-3min 后用 30uL 无核酸酶水溶解 ； 0043 （6） 经琼脂糖凝胶电泳检测后直接进行反转录或置于 -80冰箱内保存。 0044 所述鱼类软组织为新鲜的肌肉、 肝脏、 性腺和大脑。 0045 实施例 1 0046 本发明需要的主要材料包括 ： 活体解剖获得的新鲜的肌肉、 肝脏、 性腺、 大脑等鱼 类软组织、 液氮、 TRNzol 裂解液、 异丙醇、 氯仿、 75% 的酒精。 0047 （1） 取 0.1g 活体解剖的草。
18、金鱼背部肌肉组织， 迅速投入装有液氮的保温桶内， 经 液氮速冻。 0048 （2） 将速冻的鱼类组织迅速置于装有液氮的研钵内， 充分研磨成细粉， 研磨过程中 反复补充研钵内的液氮。 0049 （3） 用药匙将研磨成细粉的鱼类组织收集至一处， 并迅速用 1mLTRNzol 裂解液均 匀覆盖， 室温静置至融化。 0050 （4） 待完全融化后再研磨一遍， 以保证研磨充分并混合均匀， 并转移至 1.5ml 的离 心管中静置 5min。 0051 （5） 4， 12000r/min， 离心 10min， 小心吸取上清至一新离心管中。 0052 （6） 加入 200uL 氯仿， 剧烈震荡 15s， 室温。
19、静止 5min。 0053 （7） 4， 12000r/min， 离心 15min， 取上清， 移入一新的 1.5mL 离心管中。 0054 （8） 加入 500uL 异丙醇， 颠倒混匀， 室温放置 10min， 4， 12000r/min， 离心 10min， 弃上清。 0055 （9） 用预冷的质量百分比浓度 75% 乙醇洗涤沉淀， 4， 7500r/min， 离心 5min。 0056 （10） 小心吸掉乙醇， 超净工作台干燥 2-3min 后用 30uL 无核酸酶水溶解。 0057 （11） 经琼脂糖凝胶电泳检测后直接进行反转录或置于 -80冰箱内保存。 0058 本发明与现有方法相比。
20、 ： 0059 （1） 本发明方法试验过程所需时间为 58min， 比原来提取鱼类总 RNA 的方法大大的 缩短。 0060 （2） 本发明方法试验仅用到液氮、 TRNzol 裂解液、 异丙醇、 氯仿、 75% 的酒精， 成本 较低。 0061 （3） 本发明方法试验所得 RNA 样品经电泳检测、 拍照效果明显优于原来提取方法， 图 1、 2。 0062 以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点， 其目的在于使本领域内 的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施， 不能仅以本实施例来限定本发明的专利范 围， 即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰， 仍落在本发明的专利范围内。 说 明 书 CN 103160497 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103160497 A 6 。