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1、(10)申请公布号 CN 103145779 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103145779 A *CN103145779A* (21)申请号 201110401510.6 (22)申请日 2011.12.07 CGMCC No.5410 2011.10.28 C07H 17/06(2006.01) C12P 19/60(2006.01) C12N 1/14(2006.01) A61K 31/7048(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 上海来益生物药物研究开发中心有 限责任公司 地址 201。
2、203 上海市浦东新区张江高科技园 区牛顿路 200 号 8 号楼 5 楼 申请人 上海交通大学 (72)发明人 杨志钧 钱秀萍 杨甲月 罗敏玉 殷瑜 饶敏 (74)专利代理机构 上海华工专利事务所 31104 代理人 应云平 (54) 发明名称 3， 5- 二甲基 -8-(3， 4， 5- 三羟基 -6-( 羟甲 基 ) 四氢 -2H- 吡喃 -2- 氧代 ) 异色原烷 -1- 酮及 其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种化合物， 具有以下结构式 ： 还提供了通 过发酵培养炭角菌属 (Xylarid sp.) 菌株 CGMCC No.5410 来制备该化合物的方法。该化合物对人 。
3、非小细胞肺癌细胞、 人乳腺癌细胞、 人胰腺癌细胞 等多种肿瘤细胞具有良好的抗肿瘤活性， 可用于 制备抗肿瘤药物。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103145779 A CN 103145779 A *CN103145779A* 1/1 页 2 1. 一种化合物， 其特征在于， 所述化合物的结构式如下 ： 2. 如权利要求 1 所述的化合物的制备方法， 其特征在于， 通过发酵培养炭角菌属 (Xylaria s。
4、p.) 菌株 CGMCC No.5410 而得到。 3. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养的条件如下 ： 发酵温度为 27 30， 时间为 28 35 天。 4. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 还包括对发酵产物进行分离纯化的步骤。 5. 如权利要求 4 所述的方法， 其特征在于， 所述分离纯化包括将发酵液经乙酸乙酯提 取的步骤。 6. 如权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 所述分离纯化还包括将乙酸乙酯提取样品 经减压硅胶柱分离的步骤。 7. 如权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 所述分离纯化还包括将减压硅胶柱分离样 品经戴安 P680 液相色谱。
5、仪分离的步骤。 8. 如权利要求 7 所述的方法， 其特征在于， 所述分离纯化还包括将戴安 P680 液相色谱 仪分离样品经半制备液相色谱纯化的步骤。 9. 如权利要求 1 所述的化合物的应用， 其特征在于， 用于制备抗肿瘤药物。 10. 如权利要求 9 所述的应用， 其特征在于， 所述肿瘤为肺癌、 乳腺癌和胰腺癌。 11. 一种炭角菌属 (Xylaria sp.) 菌株， 其特征在于， 所述菌株的保藏号为 CGMCC No.5410。 权 利 要 求 书 CN 103145779 A 2 1/4 页 3 3， 5-二甲基-8-(3， 4， 5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡 喃 -2-。
6、 氧代 ) 异色原烷 -1- 酮及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及新化合物， 具体地说， 是关于一种新的化合物及其制备方法和应用。 背景技术 0002 本申请的发明人通过自然筛选的方法获得了一株炭角菌属 (Xylaria sp.) 菌株， 命名为 HCCB03890， 该菌株的保藏号为 CGMCC No.5410。目前对于该菌株的代谢产物的研究 很少。 发明内容 0003 本申请的发明人在对炭角菌属(Xylaria sp.)菌株CGMCC No.5410的代谢产物的 研究过程中， 分离得到了一种化合物， 经结构鉴定为一种新的化合物。 0004 因此， 本发明的首要目的在于提供一。
7、种新的化合物。 0005 本发明的第二个目的在于提供一种炭角菌属(Xylaria sp.)菌株CGMCC No.5410。 0006 本发明的第三个目的在于提供所述化合物的制备方法。 0007 本发明的第四个目的在于提供所述化合物的应用。 0008 本发明的化合物， 化学中文名为 3， 5- 二甲基 -8-(3， 4， 5- 三羟基 -6-( 羟甲 基 ) 四 氢 -2H- 吡 喃 -2- 氧 代 ) 异 色 原 烷 -1- 酮， 英 文 名 为 3， 5-dimethyl-8-(3， 4， 5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2。
8、-yloxy)isochroman-1-one， 其 结构式如下 ： 0009 0010 本发明的化合物制备方法是通过发酵培养炭角菌属 (Xylaria sp.) 菌株 CGMCC No.5410 而获得。 0011 根据本发明， 所述制备方法包括对炭角菌属 (Xylaria sp.) 菌株 CGMCC No.5410 的代谢产物进行分离纯化的步骤。 0012 根据一个优选实施例， 所述发酵培养的条件如下 ： 0013 发酵温度为 27 30， 时间为 28 35 天。 0014 根据一个优选实施例， 所述分离纯化包括将发酵液经乙酸乙酯提取的步骤。 0015 根据一个优选实施例， 所述分离纯化。
9、还包括将乙酸乙酯提取样品经减压硅胶柱分 离的步骤。 0016 根据一个优选实施例， 所述分离纯化还包括将减压硅胶柱分离样品经戴安 P680 说 明 书 CN 103145779 A 3 2/4 页 4 液相色谱仪分离的步骤。 0017 根据一个优选实施例， 所述分离纯化还包括将戴安 P680 液相色谱仪分离样品经 半制备液相色谱纯化的步骤。 0018 本发明的化合物具有抗肿瘤的效果， 可用于制备抗肿瘤药物。 0019 根据本发明的优选实施例， 所述肿瘤包括肺癌、 乳腺癌和胰腺癌。 0020 本发明不仅提供了一种新的化合物， 而且该化合物可用于抗肿瘤， 因而具有广泛 的开发应用前景。 附图说明 。
10、0021 图 1 为本发明获得的化合物的质谱图。 0022 图 2 为本发明获得的化合物的氢谱图。 0023 图 3 为本发明获得的化合物的碳谱图。 具体实施方式 0024 以下通过具体实施例， 对本发明做进一步详细说明。 应理解， 以下实施例仅用于说 明本发明而非用于限定本发明的范围。 0025 本发明所用的菌种为炭角菌属 (Xylaria sp.)HCCB03890， 于 2011 年 10 月 28 日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地址为北京市朝阳 区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏号 CGMCC No.5410。 0026 以下实施例中所使。
11、用的大米培养基的配方为 ： 大米 800g， 纯净水 1000ml， pH 自然 ； 115灭菌 20min。 0027 实施例 1、 化合物的制备 0028 1.1、 发酵 0029 采用大米培养基固体发酵炭角菌属 (Xylaria sp.) 菌株 HCCB03890， 发酵温度为 27 30， 时间为 28 35 天。 0030 1.2、 分离纯化 0031 将 1.1 获得的大米发酵物用乙酸乙酯提取后用减压硅胶进行柱分离， 采用乙酸乙 酯进行洗脱， 浓缩得粗样。 0032 然后， 用戴安 P680 液相色谱仪 ( 制备柱 YMC-ODS C-18， 5m， 20250mm) 进行分 离 。
12、(0 40min 用 20 100甲醇洗脱， 流速 8ml/min)， 得到粗样。 0033 对得到的粗样进一步用半制备液相色谱 ( 半制备柱为 Agilent ZORBAX SB-C18， 5m， 9.4mm250mm) 分离 (0 25min 用 18乙腈等度洗脱， 25 45min 用 18 35乙 腈梯度洗脱， 流速 2ml/min)， 截取保留时间为 34.5min 的物质， 最终获得化合物纯品， 用于 以下结构鉴定。 0034 实施例 2、 化合物的结构鉴定 0035 将实施例1中获得的化合物经正离子电喷雾质谱检测， 图谱如图1所示， 显示其准 分子离子峰为 ： 为m/z 355.。
13、1406M+H+， 对应分子式为C17H23O8， 采用Bruker Avance II-400 型超导核磁共振仪测定了样品的氢谱 ( 图 2)、 碳谱 ( 图 3) 和核磁 (MeOH-d6， 400MHz)， 核磁 数据如表 1 所示。 说 明 书 CN 103145779 A 4 3/4 页 5 0036 表 1、 化合物的 NMR 数据 0037 0038 0039 通过解析， 确定了该化合物所有碳原子和氢原子的归属， 得到了该化合物的结构 如下 ： 0040 0041 该化合物分子式为 C17H22O8， 分子量为 354， 化学中文名为 3， 5- 二甲基 -8-(3， 4， 5-。
14、 三羟基 -6-( 羟甲基 ) 四氢 -2H- 吡喃 -2- 氧代 ) 异色原烷 -1- 酮， 英文名为 3， 5-dimethyl-8-(3， 4， 5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-2-yloxy) isochroman-1-one。 0042 经检索， 现有技术中未见有报道过， 是一种新的化合物。 0043 实施例 3、 化合物的生物活性 0044 本实施例中使用的细胞 ( 均来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞 库， 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心 ) 为 ： A549( 人非小细胞肺癌细胞 )， MDA-。
15、MB-231( 人乳腺癌细胞 )， PANC-1( 人胰腺癌细胞 )。 0045 对实施例 1 中获得的化合物进行生物活性检测， 具体方法如下 ： 0046 将对数生长期肿瘤细胞， 用微量移液器吸取去除上清， 用适量的 PBS 缓冲 液清洗 说 明 书 CN 103145779 A 5 4/4 页 6 去除表层衰老的细胞， 用胰蛋白酶消化细胞， 1000rpm 离心 5min， 去除上清液。加入营养液 ( 含有 10小牛血清， 100U/ml 青霉素和 100U/ml 链霉素 )， 做成单细胞悬浮液， 用血球计数 板计数后， 按照 50,000 个 /ml 接种， 取 100l/ 孔于 96 。
16、孔板中， 将 96 孔板置于 37的 5 CO2培养箱中培养24h。 将DMSO溶解的终浓度为50g/ml的化合物(DMSO的终浓度为1) 加入到培养好的 96 孔板细胞中， 置于 37的 5 CO2培养箱中培养 48h。采用 MTT 染料对 活细胞染色， 次日用 Bio-Rad680 酶标仪在波长 570nm 下测定 OD 值， 来研究化合物对肿瘤细 胞抑制能力。阴性对照为 1的 DMSO， 阳性对照为 5- 氟尿嘧啶 ( 终浓度为 50g/ml) ； 每 个实验重复 3 次， 计算平均值。其中， 肿瘤细胞生长的抑制率的计算公式如下 ： 0047 0048 化合物对肿瘤细胞的抑制率结果如表 。
17、2 所示。 0049 表 2、 化合物对肿瘤细胞的抑制率 ( ) 0050 检测对象 A549 MDA-MB-231 PANC-1 本发明化合物 12.1 6.4 3.6 5- 氟尿嘧啶 44.1 57.2 42.9 0051 由表 2 的结果可知， 本发明的化合物对人肺癌、 乳腺癌和胰腺癌等肿瘤细胞均具 有良好的抗肿瘤活性， 因而可以用于制备治疗肿瘤的药物， 这对于本领域的技术人员来说 是显而易见的。 说 明 书 CN 103145779 A 6 1/3 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 103145779 A 7 2/3 页 8 图 2 说 明 书 附 图 CN 103145779 A 8 3/3 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 103145779 A 9 。