高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103080332 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103080332 A *CN103080332A* (21)申请号 201180036040.6 (22)申请日 2011.07.22 2010-166317 2010.07.23 JP C12Q 1/60(2006.01) C12Q 1/42(2006.01) C12Q 1/44(2006.01) G01N 33/48(2006.01) G01N 33/92(2006.01) (71)申请人 电化生研株式会社 地址 日本东京都 (72)发明人 樋口麻衣子 伊藤康树 (74)专利代理机构 中国专。

2、利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 蔡晓菡 李炳爱 (54) 发明名称 高密度脂蛋白 3 中的胆固醇的定量方法 (57) 摘要 公开了不需要复杂的操作即可定量被检测试 样中的高密度脂蛋白 3(HDL3) 中的胆固醇的方 法。HDL3 中的胆固醇的定量方法包含使磷脂酶和 / 或鞘磷脂酶作用于被检测试样， 使胆固醇移动 至反应体系外的第 1 工序 ； 和定量残留在反应体 系内的胆固醇的第2工序。 可以不需要超离心、 前 处理等复杂的操作， 而通过自动分析装置特异性 地定量被检测试样中的 HDL3 胆固醇。此外， 也可 以根据通过作为现有技术的被测物中 HDL 总胆固 醇定量法而得到的总 。

3、HDL 胆固醇量， 计算 HDL3 胆 固醇量的差， 从而定量 HDL2 胆固醇量。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2013.01.23 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2011/066672 2011.07.22 (87)PCT申请的公布数据 WO2012/011554 JA 2012.01.26 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书13页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103080332 A CN 103080332 A *CN1。

4、03080332A* 1/1 页 2 1. 高密度脂蛋白 3 中的胆固醇的定量方法， 其包含使磷脂酶和 / 或鞘磷脂酶作用于被 检测试样， 使胆固醇移动至反应体系外的第 1 工序 ； 和定量残留在反应体系内的胆固醇的 第 2 工序。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中， 所述磷脂酶为磷脂酶 C 和 / 或磷脂酶 D。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其中， 在与高密度脂蛋白3以外的脂蛋白反应的表 面活性剂的存在下进行所述第 1 工序。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其中， 所述表面活性剂为作为聚氧乙烯二苯乙烯化苯 基醚的至少 1 种非离子表面活性剂。 5.根据权利要求3所述。

5、的方法， 其中， 所述表面活性剂为选自聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合 物、 酰胺醚硫酸盐和聚氧乙烯 - 硬脂胺中的至少 1 种阴离子表面活性剂。 6. 根据权利要求 3 所述的方法， 其中， 所述表面活性剂为选自椰子油脂肪酸酰胺丙 基二甲基 - 氨基醋酸内铵盐、 烷基二甲基 - 氨基醋酸内铵盐和月桂基甜菜碱中的至少 1 种 两性表面活性剂。 7. 根据权利要求 3 所述的方法， 其中， 所述表面活性剂为作为月桂基三甲基氯化铵的 阳离子表面活性剂。 8.根据权利要求17中任一项所述的方法， 其中， 在至少与高密度脂蛋白3反应的表 面活性剂的存在下进行所述第 2 工序。 9.根据权利要求8所述的方法， 其。

6、中， 第2工序中使用的表面活性剂为选自聚氧乙烯二 苯乙烯化苯基醚、 聚氧乙烯月桂基醚和对异辛基聚氧乙烯苯酚甲醛聚合物中的至少 1 种非 离子表面活性剂。 10. 根据权利要求 8 所述的方法， 其中， 第 2 工序中使用的表面活性剂为选自月桂基二 甲基 - 氨基醋酸内铵盐、 聚氧乙烯月桂基醚中的至少 1 种两性表面活性剂。 11. 根据权利要求 8 所述的方法， 其中， 第 2 工序中使用的表面活性剂为作为脂肪酸族 磷酸酯的至少 1 种阳离子表面活性剂。 12. 根据权利要求 8 所述的方法， 其中， 第 2 工序中使用的表面活性剂为选自聚氧乙烯 二苯乙烯化苯基醚、 聚氧乙烯三苄基苯基醚、 聚。

7、氧亚烷基烷基醚、 聚氧乙烯多环苯基醚和聚 氧乙烯枯基苯基醚中的至少 1 种的、 HLB 在 11 14 之间的非离子表面活性剂。 13. 根据权利要求 8 所述的方法， 其中， 第 2 工序中使用的表面活性剂为咪唑啉型的至 少 1 种两性表面活性剂。 14. 根据权利要求 8 所述的方法， 其中， 第 2 工序中使用的表面活性剂为选自聚氧乙烯 月桂基醚、 聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少 1 种非离子表面活性剂。 15. 根据权利要求 8 所述的方法， 其中， 第 2 工序中使用的表面活性剂为选自月桂醇烷 氧基化物和聚氧乙烯 - 烷基苯基醚硫酸酯钠盐中的至少 1 种阴离子表面活性剂。。

8、 权 利 要 求 书 CN 103080332 A 2 1/13 页 3 高密度脂蛋白 3 中的胆固醇的定量方法 技术领域 0001 本发明涉及高密度脂蛋白 3（以下有时称为 “HDL3” ） 中的胆固醇 （HDL3 中的胆固 醇以下有时称为 “HDL3 胆固醇” ） 的定量方法。 背景技术 0002 高密度脂蛋白 （HDL） 胆固醇与由于从包括动脉硬化壁在内的各组织接收胆固醇而 蓄积在细胞内的胆固醇的去除作用有关， 因此也被称为胆固醇逆向转运体系。已知其与冠 状动脉硬化等动脉硬化疾病成负相关， 已知 HDL 为低值时作为血脂异常病的一种而设定有 低值界限， 作为动脉硬化的指标有用。 0003。

9、 HDL 由载脂蛋白和磷脂、 胆固醇、 中性脂肪构成。HDL 分类为比重为 d 1.063 1.210g/mL、 进一步 d 1.063 1.125g/mL 的 HDL2 和 d 1.125 1.210g/mL 的 HDL3 的 2 种组分。根据脂蛋白的分布曲线， 在 d 1.125 部分确认到凹口， 从这里开始比重重的部 分为 HDL3。此外， 还存在根据 HDL 中的载脂蛋白中的载脂蛋白 E 含量差， 将载脂蛋白 E 的含 量多的 HDL 作为载脂蛋白 E-rich HDL 的亚组分的分类法。 0004 已知不仅现有的所有 HDL 蛋白， 而且 HDL2 和 HDL3 各亚组分也显示出不同。

10、的作用。 已知在临床中， 由于 CETP 缺损， HDL 无法代谢成 LDL、 IDL， HDL 胆固醇量增加。由于 CETP 缺 损而增加的 HDL 为 HDL2。HDL2 被认为具有抗动脉硬化作用。此外， 也被认为由于 CETP 缺 损， 载脂蛋白 E-rich HDL 上升， 对于 Apo-Erichi HDL， 其胆固醇去除能强， 具有抗血小 板作用， 被认为是 HDL 中的有益蛋白。此外， 由于肝脂酶活性的降低， HDL3 不变化为 HDL2， HDL3 增加。启示了 HDL3 的增加导致冠动脉疾病的发病率增加。根据这些倾向， 推测分别测 定 HDL 亚组分有助于判断动脉硬化疾病的有。

11、无、 原因。此外， 现在各制造商都在进行基于这 些 HDL 亚组分的作用， 阻碍 CETP 作用， 使 LDL 胆固醇量减少， 使 HDL 胆固醇量增加的治疗药 的研发。 0005 确立 HDL 亚组分的简便的测定方法可能关系着详细的作用的解明、 它们的治疗效 果。 0006 作为到目前为止已知的 HDL 亚组分的测定方法， 已知有超离心法、 高效液相色谱 法 （HPLC） 法、 HDL3 沉淀法 （专利文献 1） 、 NMR 法等。 0007 超离心是利用脂蛋白的比重差通过离心进行分级的方法， 具有操作需要熟练、 花 费数日、 以及费用也高的缺点。对于冈崎等人的使用 HPLC 分离 HDL2。

12、 和 HDL3 的方法， 操作 需要时间， 需要特殊的设备。HDL3 沉淀法是通过含有 2 价金属离子和硫酸葡聚糖的试剂 使 HDL3 以外的物质凝集， 通过离心回收上清部分的 HDL3， 通过自动分析装置进行测定的方 法。 其也具有操作需要熟练、 被测物并且是手动方法而需要被测物的前处理操作、 到测定为 止需要花费一定的时间等缺点， 不通用。此外， NMR 法是通过核磁共振测量脂蛋白的粒子数 的方法， 需要特殊的设备， 不常用。 0008 需要说明的是， 存在HDL亚组分的分析方法(专利文献2)。 可以通过通用自动分析 装置测定， 使用通过使用表面活性剂阻碍 HDL3 以外的脂蛋白不受酶的作。

13、用的方法， 在 HDL3 说 明 书 CN 103080332 A 3 2/13 页 4 反应中， 存在目标以外的脂蛋白， 在对测定产生影响， 或者在未阻碍完全的情况下， 有测量 到 HDL3 以外的脂蛋白的可能。 0009 需要发明代替这样的方法、 能够简便且更选择性地定量胆固醇量的试剂。 0010 现有技术文献 专利文献 专利文献 1 : 日本特开 2009-207463 号公报 专利文献 2 : 日本特开 2001-346598 号公报。 发明内容 0011 发明要解决的问题 本发明的目的在于提供一种不需要复杂的操作即可定量被检测试样中的 HDL3 的方 法。 0012 解决问题的技术手。

14、段 本申请发明人经过深入研究， 结果发现磷脂酶和鞘磷脂酶作用于脂蛋白， 但几乎不作 用于 HDL3。于是想到， 使磷脂酶或鞘磷脂酶作用于被检测试样， 消除胆固醇， 然后定量残留 的HDL3中的胆固醇， 从而可以定量被检测试样中的HDL3胆固醇， 并实验性地确认了上述想 法可以实现， 完成了本发明。 0013 即， 本发明提供一种高密度脂蛋白 3 中的胆固醇的定量方法， 其包含使磷脂酶和 / 或鞘磷脂酶作用于被检测试样， 使胆固醇移动至反应体系外的第 1 工序 ； 和定量残留在反 应体系内的胆固醇的第 2 工序。 0014 发明效果 根据本发明， 可以不需要超离心、 前处理等复杂的操作， 而通过。

15、自动分析装置特异性地 定量被检测试样中的 HDL3 胆固醇。此外， 也可以根据通过作为现有技术的被测物中 HDL 总 胆固醇定量法而得到的总 HDL 胆固醇量， 计算出 HDL3 胆固醇量的差， 从而定量 HDL2 胆固醇 量。 附图说明 0015 图 1 是表示在本发明的实施例中进行的、 添加第 2 工序的试剂 D 后的各组分的 吸光度变化的结果的图。 0016 图 2 是表示在本发明的实施例中进行的、 添加第 2 工序的试剂 G 后的各组分的 吸光度变化的结果的图。 0017 图 3 是表示在本发明的实施例中进行的、 添加第 2 工序的试剂 H 后的各组分的 吸光度变化的结果的图。 001。

16、8 图 4 是表示在本发明的实施例中进行的、 添加第 2 工序的试剂 I 后的各组分的 吸光度变化的结果的图。 0019 图 5 是表示在本发明的实施例中进行的、 添加第 2 工序的试剂 K 后的各组分的 吸光度变化的结果的图。 0020 图 6 是表示在本发明的实施例中进行的、 添加第 2 工序的试剂 L 后的各组分的 吸光度变化的结果的图。 说 明 书 CN 103080332 A 4 3/13 页 5 具体实施方式 0021 作为供于本发明的方法的被检测试样， 只要是要定量所述试样中的 HDL3 胆固醇 的被检测试样就没有特别限定， 优选为血清或血浆或它们的稀释物， 特别优选血清或其稀 。

17、释物。 0022 本发明的第1工序中， 使磷脂酶和/或鞘磷脂酶 （以下， 有时将两者统称为 “磷脂酶 等” ） 作用于被检测试样。 作为磷脂酶， 是至少作用于磷脂酰胆碱的磷脂酶即可， 优选磷脂酶 A、 磷脂酶 C 和磷脂酶 D， 特别优选磷脂酶 C 和磷脂酶 D。由于磷脂酶等市场上有售， 因而可 以优选使用市售品。磷脂酶等可以单独使用， 也可以组合 2 种以上使用。 0023 磷脂酶等的最终浓度 （使用2种以上时为其总浓度， 以下相同） 优选为0.1100U/ mL 左右， 更优选为 0.2 50U/mL 左右。 0024 若使磷脂酶等作用于被检测试样， 则HDL3几乎不受到作用， 而HDL3。

18、以外的脂蛋白 受到作用， 其胆固醇移动至反应体系外。 0025 在本发明的方法的第 1 工序中， 受到磷脂酶等的作用而使胆固醇移动至反应体系 外。这里，“移动至反应体系外” 是指， 通过消除或保护胆固醇及其酯， 使在之后的工序中胆 固醇及其酯不参与。 0026 这里 “消除” 是指， 将被检测试样中的脂蛋白的胆固醇分解， 使其在之后的工序中 不作用于测定胆固醇的反应。作为用于消除脂蛋白胆固醇的方法， 可以列举出使用过氧化 氢酶将使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用而产生的过氧化氢分解成水和氧的方法。此外， 也可以使用过氧化酶使供氢体与产生的过氧化氢反应转化为无色醌， 但不限定于这些。消 除胆固醇的方。

19、法本身是该领域中公知的， 下述实施例中也有具体的记载。 0027 “保护” 是指， 为了使被检测试样中的脂蛋白在之后的工序中不在胆固醇测定中反 应而进行保护。 保护脂蛋白可以列举出使用特异性地保护各脂蛋白的表面活性剂以使胆固 醇酯酶和胆固醇氧化酶不作用于其的方法， 但不限定于这些。 0028 第 1 工序也可以通过预先同时添加用于移动至反应体系外的酶系、 表面活性剂， 将两工序以单一工序的形式同时进行。 0029 第 1 工序中， 在使用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的情况下， 胆固醇酯酶的浓度 （本 说明书中， 浓度在无特别说明时表示最终浓度）优选为 0.1 10.0U/mL 左右， 更优选为 0。

20、.2 2.0U/mL 左右。胆固醇氧化酶的浓度优选为 0.05 10.0U/mL 左右， 更优选为 0.1 1.0U/mL 左右。需要说明的是， 对于胆固醇酯酶， 只要是作用于酯型胆固醇的就没有特别 限制， 例如可以使用旭化成公司制的胆固醇酯酶 (CEBP、 CEN)、 东洋纺公司制的胆固醇酯酶 (COE-311、 COE-312) 等市售品。此外， 对于胆固醇氧化酶， 只要是作用于游离型胆固醇的就 没有特别限制， 例如可以使用旭化成公司制的胆固醇氧化酶 (CONII)、 东洋纺公司制的胆固 醇氧化酶 （COO-311、 COO-321、 COO-331） 等市售品。 0030 第 1 工序中。

21、， 在使用过氧化酶的情况下， 过氧化酶的浓度优选为 2.0 5.0 单位 / mL 左右， 进一步优选为 3.0 4.0 单位 /mL 左右。此外， 在使用转化为无色醌的化合物的情 况下， 其浓度优选为 0.4 0.8mm0l/L 左右。 0031 第一工序中使用的反应液可以使用能够在通常的生物化学反应中使用的各种缓 冲液， 优选 pH 在 5 8 之间的缓冲液。作为溶液， 优选 Good、 Tris、 磷酸、 甘氨酸的缓冲 说 明 书 CN 103080332 A 5 4/13 页 6 溶液， 优选作为 Good 缓冲液的双 （2- 羟基乙基）亚氨基三 （羟基乙基）甲烷 （Bis-Tris）。

22、 、 哌 嗪 -1,4- 二 （2- 乙 磺 酸） （PIPES） 、 哌 嗪 -1,4- 二 （2- 乙 磺 酸） 、 1.5 钠 盐、 一 水 合 物 （PIPES1.5Na） 、 3- 吗啉代丙磺酸 （MOPSO） 、 N,N- 双 （2- 羟基乙基） -2- 氨基乙磺酸 （BES） 、 2-4-（2- 羟基乙基） -1- 哌嗪基 乙磺酸 （HEPES） 和哌嗪 -1,4- 双 （2- 羟基 3- 丙磺酸） （POPSO） 。 0032 第一工序的反应温度优选为 25 40左右， 进一步优选为 35 38， 最优选为 37。反应时间没有特别限定， 通常为 2 10 分钟左右。 0033 。

23、本申请发明人进一步发现了与 HDL3 以外的脂蛋白反应的表面活性剂。对于第 1 工序， 可以在不存在表面活性剂的条件下进行， 但通过在与 HDL 或 HDL3 以外的脂蛋白反应 的表面活性剂的共存下进行， 可以更准确地定量 HDL3 胆固醇， 因而优选。 0034 本发明中对表面活性剂使用 “反应” 这一词时， 表示表面活性剂使酶容易对脂蛋白 进行作用以导出至反应体系外， 或者进行保护使酶无法作用于脂蛋白。 0035 作为与 HDL 以外的脂蛋白反应的表面活性剂， 可以列举出聚氧乙烯 - 聚氧丙烯缩 合物、 聚氧乙烯烷基醚硫酸钠酰胺非离子、 聚氧乙烯壬基苯基醚和酰胺非离子这样的阴离 子表面活性。

24、剂 ； 和 / 或 HLB 值为 14 17 的聚氧乙烯多环苯基醚这样的非离子系表面活性 剂， 但不限定于这些。更具体而言， 可以列举出、 P123 （旭电化） F88（旭电化） 、 WX（花王 ) HS220( 日本油脂 ) 、 MT-215（日本油脂） 、 Newcol-723（日本油脂） 、 Newcol-2614（日本乳化剂） 、 Newcol-714 （日本乳化剂） 。 0036 作为与 HDL3 以外的脂蛋白反应的表面活性剂， 可以列举出聚氧乙烯二苯乙烯化 苯基醚等非离子表面活性剂 ； 聚氧乙烯 - 聚氧丙烯缩合物、 酰胺醚硫酸盐和聚氧乙烯 - 硬 脂胺等阴离子表面活性剂 ； 椰子。

25、油脂肪酸 - 酰胺丙基二甲基 - 氨基醋酸内铵盐、 烷基二甲 基 - 氨基醋酸内铵盐和月桂基甜菜碱等两性表面活性剂 ； 以及月桂基三甲基氯化铵这样的 阳离子表面活性剂， 但不限定于这些。更具体而言， 作为非离子表面活性剂， 可以列举出作 为聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的 A500（商品名、 花王公司制， 以下， 公司名为制 造公司， 与公司名一起记载的全部为商品名） ； 作为阴离子可以列举出作为聚氧乙烯 - 聚氧 丙烯缩合物的 F127 （旭电化） 、 F68 （旭电化） P103 （旭电化） 、 作为酰胺醚硫酸盐的 CF-10（日本油脂） 、 作为聚氧乙烯 - 硬脂胺的 S210（日本油脂） ；。

26、 作为两性表面活性剂可以列举出作为椰子油脂肪酸 - 酰胺丙基 二甲基 - 氨基醋酸内铵盐的 BDF-SF （日本油脂） 、 作为烷基二甲基 - 氨基醋 酸内铵盐的 BF （日本油脂） 、 作为月桂基甜菜碱的 24B （花王） ； 作为阳离子表面活性剂可以列举出作为月桂基三甲基氯化铵的 24P （花王） 。这 些可以单独使用， 也可以组合 2 种以上使用。 0037 与HDL3以外的脂蛋白反应的表面活性剂的浓度优选为0.015.0重量%， 更优选 为 0.03 3.0 重量 % 左右。 0038 需要说明的是， 在第 1 工序中共存表面活性剂的情况下， 反应条件 （反应温度、 时 间、 缓冲液等。

27、） 也如上面所述。 0039 在接下来的第 2 工序中， 定量残留在反应体系内的胆固醇。其可以通过使至少与 HDL3 反应的表面活性剂进行反应， 定量胆固醇从而来进行。 “至少与 HDL3 反应的表面活性 说 明 书 CN 103080332 A 6 5/13 页 7 剂” 包括与 HDL3 进行特异性反应的表面活性剂、 与 HDL 进行特异性反应的 （即与 HDL2 和 HDL3 反应） 表面活性剂和与所有的脂蛋白进行反应的表面活性剂。 0040 作为可以在第 2 工序中使用的表面活性剂， 可以列举出聚氧乙烯二苯乙烯化苯基 醚、 聚氧乙烯月桂基醚和对异辛基聚氧乙烯苯酚甲醛聚合物等非离子表面活。

28、性剂 ； 月桂基 二甲基 - 氨基醋酸内铵盐和聚氧乙烯月桂基醚等两性表面活性剂 ； 脂肪酸族磷酸酯等阳离 子表面活性剂 ； 聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚、 聚氧乙烯三苄基苯基醚、 聚氧亚烷基烷基醚、 聚氧乙烯多环苯基醚和聚氧乙烯枯基苯基醚等 HLB 在 11 14 之间的非离子表面活性剂 ； 咪唑啉型的两性表面活性剂 ； 聚氧乙烯月桂基醚、 聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯烷基苯基醚 等非离子表面活性剂 ； 月桂醇烷氧基化物和聚氧乙烯 - 烷基苯基醚硫酸酯钠盐这样的阴离 子表面活性剂。这些可以单独使用， 也可以组合 2 种以上使用。 0041 更具体而言， 作为与 HDL3 进行特异性反应的表面活性剂的例。

29、子， 作为非离子表 面活性剂， 可以列举出作为聚氧乙烯二苯乙烯化苯基醚的 A90（花王） 、 作为 聚氧乙烯月桂基醚的 120（花王） 、 作为对异辛基聚氧乙烯苯酚甲醛聚合物的 Triton-WR-1339（） ； 作为两性表面活性剂， 可以列举出作为月桂基二甲基 - 氨基 醋酸内铵盐的 BL-SF（日本油脂） 、 作为聚氧乙烯月桂基醚的 NK-100（日本油脂） ； 作为阳离子表面活性剂， 可以列举出作为脂肪酸族磷酸酯的 PS-440E（旭电化） 。 0042 作为与 HDL 进行特异性反应的表面活性剂， 可以使用作为 HLB 在 11 14 之间的 非离子表面活性剂的聚氧乙烯二苯乙烯化苯基。

30、醚、 聚氧乙烯三苄基苯基醚、 聚氧亚烷基烷 基醚、 聚氧乙烯多环苯基醚、 聚氧乙烯枯基苯基醚、 或者两性表面活性剂的咪唑啉型。具体 而言、 可以使用例如 A60（花王） 、 B66（花王） 、 LS110（花 王） 、 Newcol-CMP-11（日本乳化剂） 、 Newcol-710（日本乳化剂） 、 Newcol-610（日本乳化剂） 、 Newcol-2609（日本乳化剂） 、 GLM-R-LV（日本油脂） 。 0043 作为与所有的脂蛋白进行特异性反应的表面活性剂， 作为非离子表面活性剂， 可 以使用聚氧乙烯月桂基醚、 聚氧乙烯烷基醚、 聚氧乙烯烷基苯基醚。作为阴离子表面活性 剂， 可。

31、以使用月桂醇烷氧基化物、 聚氧乙烯 - 烷基苯基醚硫酸酯钠盐。具体而言， 可以使用 例如 707（花王） 、 909（花王） 、 108（花王） 、 L207 （日本油脂） 、 LB83 （旭电化） 、 LB103 （旭电化） 、 Newcol-707 （日本乳化剂） 。 0044 第二工序中的表面活性剂的浓度优选为0.015.0% （w/v） ， 进一步优选为0.05 2.0%（w/v） 。 0045 第 2 工序中， 通过这些表面活性剂的反应来定量胆固醇。需要说明的是， 第 1 工 序和第 2 工序中使用不同的表面活性剂。胆固醇的定量方法本身是公知的， 可以采用公知 的任一种方法， 下述实。

32、施例中也有具体的记载。例如， 对脂蛋白中的酯型胆固醇， 使用胆固 醇酯酶水解， 生成游离型胆固醇和脂肪酸， 使用胆固醇氧化酶使生成的游离型胆固醇和原 本存在于脂蛋白中的游离胆固醇产生胆甾烯酮和过氧化氢， 使其在过氧化酶的存在下形成 醌色素进行定量。作为产生醌色素的化合物， 可以列举出， 例如 HDAOS(N-(2- 羟基 -3- 磺丙 基 )-3,5- 二甲氧基苯胺、 DAOS(N- 乙基 -N(-2- 羟基 -3- 磺丙基 )-3,5- 二甲氧基苯胺钠 ) 或 TOOS(N- 乙基 -N(-2- 羟基 - 3- 磺丙基 )-3- 甲基苯胺钠二水合物） 和 4- 氨基安替比林， 说 明 书 C。

33、N 103080332 A 7 6/13 页 8 只要是可以产生醌色素的组合即可， 不限定于这些。在第 1 工序中使用胆固醇酯酶和胆固 醇氧化酶的情况下， 第2工序可以直接使用第1工序中使用的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶， 不需要重新添加。 0046 对于产生醌色素的化合物的浓度， 例如， 为HDAOS时， 浓度优选为0.52.0mmol/L 左右， 为 4- 氨基安替比林时优选为 0.1 2.0mmol/L， 此外， 过氧化酶的浓度优选为 0.4 5.0U/mL。此外， 在用过氧化氢酶分解第一工序产生的过氧化氢的工序中， 使用作为过氧化 氢酶的抑制剂的叠氮化钠， 添加到第二工序的反应液中。此时的。

34、叠氮化钠的浓度通常为 0.1g/L 1.0g/L 左右。 0047 第 2 工序的其它反应条件 （反应温度、 时间、 缓冲液、 PH 等） 可以与上述第 1 工序的 反应条件相同。 0048 进一步地， 也可以从被检测试样中的 HDL 胆固醇量计算出由第一工序和第二工序 得到的HDL3胆固醇量的差， 求出被检测试样中的HDL2胆固醇量。 求出被检测试样中的HDL 胆固醇量的方法为公知 （例如日本特开 2001-103998 号公报） ， 用于其的试剂盒市场上也有 售， 因而可以使用其容易地进行定量。 0049 以下基于实施例更具体地说明本发明。但是本发明不受下述实施例的限定。 实施例 0050。

35、 参考例 1 制备以下试剂组成的试剂 A 和试剂 B， 分别制备在试剂 A 中添加 0.1%（w/v） 或 1.0% （W/V） 浓度的各种表面活性剂而成的试剂。即将要测定之前以 1 ： 3 的比例混合加入有各种 表面活性剂的下述试剂 A 与试剂 B， 使 HDL2 组分和 HDL3 组分的胆固醇反应， 测定在主波长 700nm、 副波长 600nm 下的最终吸光度， 并进行比较。 0051 HDL2 组分和 HDL3 组分如以下那样操作进行分级。使用含有 HDL 的被检测试样即 血清中使用氯化钠和溴化钠而成的溶液， 通过超离心进行分级使得 HDL2 和 HDL3 在分界线 比重 (1.125。

36、) 处分离， 回收各组分。 0052 下述表 1 中示出了 HDL2/HDL3 的比率为 0.75 以下、 CM IDL/HDL3、 LDL/HDL3 为 0.75 以下的表面活性剂， 将它们作为与 HDL3 反应的表面活性剂。表 2 中示出了 HDL2/HDL3 的比率为 1.25 以上、 CM IDL/HDL2、 LDL/HDL2 的比率为 1.25 以上的表面活性剂， 将它们 作为与 HDL3 以外的脂蛋白反应的表面活性剂。表 3 中示出了 HDL2/HDL3 的比率在 0.75 1.25 之间、 CM IDL/HDL2、 LDL/HDL2、 CM IDL/HDL3、 LDL/HDL3 。

37、的比率为 0.75 以下的表面 活性剂， 将它们作为与 HDL 反应的表面活性剂。表 4 中示出了 HDL2/HDL3 的比率在 0.75 1.25 之间、 CM IDL/HDL2、 LDL/HDL2、 CM IDL/HDL3、 LDL/HDL3 的比率为 0.75 以上的表 面活性剂， 将它们作为与所有的脂蛋白进行反应的表面活性剂。表 5 中示出了不符合上述 条件的表面活性剂， 将它们作为与 HDL 以外的脂蛋白反应的表面活性剂。 0053 试剂 A BES 缓冲液 (pH7.0） 100mmol/L HDAOS 0.7mmol/L 过氧化氢酶 600U/L 胆固醇氧化酶 1.4U/mL 说。

38、 明 书 CN 103080332 A 8 7/13 页 9 胆固醇酯酶 0.8U/mL。 0054 试剂 B BES 缓冲液 （pH6.6） 100mmol/L 叠氮化钠 0.1% 4- 氨基安替比林 4.0mmol/L 过氧化酶 2.4U/mL。 0055 表 1 （单位 ： Abs10000） A90、 120、 BL-SF、 Triton-WR-1339、 NK-100、 PS440E 是与 HDL3 进行特异性反应的表面活性剂。 0056 表 2 说 明 书 CN 103080332 A 9 8/13 页 10 （单位 ： Abs10000） A500、 BDF-SF、 BF、 S2。

39、10、 P103、 24P、 CF-10、 24B、 F68、 F127 是与 HDL3 以外的脂蛋白进行反应的表面活性剂。 0057 表 3 说 明 书 CN 103080332 A 10 9/13 页 11 （单位 ： Abs10000） B66、 A60、 LS110、 Nowol610、 Newcol2609、 Newcol-CMP-11、 GLM-RLV、 Newcol-710 是与 HDL 进行特异性反应的表面活 性剂。 0058 表 4 （单位 ： Abs10000） 108、 707、 Newcol707、 LB83、 LB103、 909 是与所有的脂蛋白进行特异性反应的表面。

40、活性剂。 0059 表 5 说 明 书 CN 103080332 A 11 10/13 页 12 （单位 ： Abs10000） Newcol-714、 Newcol-723、 Newcol-2614、 S215、 P123、 WX、 MT215、 HS220、 F88是与HDL以外的脂蛋白进行 特异性反应的表面活性剂。 0060 实施例 1 使用超离心将 CM LDL 组分、 HDL2 组分、 HDL3 组分分级， 使其与在参考例 1 中使用的 试剂 A 中加入磷脂酶 D （PLDP） 而成的试剂 E 反应， 进一步添加下述试剂 D， 进行测定。关于 测定， 在血清2L中添加150L的试剂E。

41、， 加热反应5分钟后， 添加试剂D进一步加热反应 5 分钟， 测定主波长 700nm、 副波长 600nm 下的吸光度。 0061 试剂 E BES 缓冲液 （pH7.0） 100mmol/L HDAOS 0.7mmol/L 过氧化氢酶 600U/L 胆固醇氧化酶 1.4U/mL 胆固醇酯酶 0.8U/mL 磷脂酶 D 5.0U/mL。 0062 试剂 D BES 缓冲液 （pH6.6） 100mmol/L 叠氮化钠 0.1% B66 1.5% 4- 氨基安替比林 4.0mmol/L 过氧化酶 2.4U/mL。 说 明 书 CN 103080332 A 12 11/13 页 13 0063 添。

42、加试剂 D 后的各组分的吸光度的经时变化的结果示于图 1。可以观察得知对 HDL3 进行特异性反应。 0064 实施例 2 按照以下组成制备在参考例1使用的试剂A中加入表面活性剂和鞘磷脂酶而成的试剂 F、 和测定试剂 F 反应后的产物中的 HDL3 的工序的试剂 G， 使用超离心将 CM IDL 间的组 分、 LDL 组分、 HDL2 组分、 HDL3 组分进行分级， 进行测定。试剂的测定顺序与实施例 1 同样 地实施， 测定各测定时间的吸光度。 0065 试剂 F BES 缓冲液 （pH7.0） 100mmol/L HDAOS 0.7mmol/L F68 0.03w/v% 过氧化氢酶 600。

43、U/L 胆固醇氧化酶 1.4U/mL 胆固醇酯酶 0.8U/mL 鞘磷脂酶 0.5U/mL。 0066 试剂 G BES 缓冲液 （pH6.6） 100mmol/L 叠氮化钠 0.1% A90 2.0% 4- 氨基安替比林 4.0mmol/L 过氧化酶 2.4U/mL。 0067 添加试剂 G 后的各组分的吸光度的经时变化的结果示于图 2。可以观察得知对 HDL3 进行特异性反应。 0068 实施例 3 使用与实施例 2 相同的方法， 使用将实施例 1 中使用的试剂 E 的磷脂酶变更为磷脂酶 C， 添加表面活性剂而成的试剂 H， 测定吸光度。 0069 试剂 H BES 缓冲液 （pH7.0）。

44、 100mmol/L HDAOS 0.7mmol/L F68 0.03w/v% 过氧化氢酶 600U/L 胆固醇氧化酶 1.4U/mL 胆固醇酯酶 0.8U/mL 磷脂酶 C 5.0U/mL。 0070 添加试剂 H 后的各组分的吸光度的经时变化的结果示于图 3。可以观察得知对 HDL3 进行特异性反应。 0071 实施例 4 使用与实施例 2 相同的方法， 使用将实施例 3 中使用的试剂 H 的磷脂酶变更为磷脂酶 D（PLDP） ， 添加表面活性剂而成的试剂 I， 测定吸光度。 说 明 书 CN 103080332 A 13 12/13 页 14 0072 试剂 I BES 缓冲液 （pH7。

45、.0） 100mmol/L HDAOS 0.7mmol/L F68 0.03w/v% 过氧化氢酶 600U/L 胆固醇氧化酶 1.4U/mL 胆固醇酯酶 0.8U/mL 磷脂酶 D 5.0U/mL。 0073 添加试剂 I 后的各组分的吸光度的经时变化的结果示于图 4。可以观察得知对 HDL3 进行特异性反应。 0074 实施例 5 使用与实施例 2 相同的方法， 使用下述记载的组成的试剂 J 和试剂 K， 测定吸光度。 0075 试剂 J BES 缓冲液 （pH7.0） 100mmol/L HDAOS 0.7mmol/L P103 0.03w/v% 过氧化氢酶 600U/L 胆固醇氧化酶 1。

46、.4U/mL 胆固醇酯酶 0.8U/mL 磷脂酶 D 5.0U/mL。 0076 试剂 K BES 缓冲液 （pH6.6） 100mmol/L 叠氮化钠 0.1% 120 1.0% 4- 氨基安替比林 4.0mmol/L 过氧化酶 2.4U/mL。 0077 添加试剂 K 后的各组分的吸光度的经时变化的结果示于图 5。可以观察得知对 HDL3 进行特异性反应。 0078 实施例 6 使用与实施例 2 相同的方法， 使用实施例 5 中使用的试剂 J 和下述记载的组成的试剂 L， 测定吸光度。 0079 试剂 L BES 缓冲液 （pH6.6） 100mmol/L 叠氮化钠 0.1% 909 1.。

47、0% 4- 氨基安替比林 4.0mmol/L 过氧化酶 2.4U/mL。 0080 添加试剂 L 后的各组分的吸光度的经时变化的结果示于图 6。可以观察得知对 HDL3 进行特异性反应。 说 明 书 CN 103080332 A 14 13/13 页 15 0081 实施例 7 制备以下试剂 M， 通过与试剂 D 组合， 测定被检测试样中的 HDL-C（C 为胆固醇， 以下 相同） ， 用该值减去使用实施例 4 的试剂 I、 试剂 D 测定 HDL3-C 而得到的值， 从而计算出 HDL2-C。各个被测物的 HDL-C、 HDL3-C、 HDL2-C 值示于表 6。 0082 试剂 M BES 缓冲液 （pH7.0） 100mmol/L HDAOS 0.7mmol/L P88 0.1w/v% 过氧化氢酶 600U/L 胆固醇氧化酶 1.4U/mL 胆固醇酯酶 0.8U/mL 磷脂酶 D 5.0U/mL。 0083 表 6 （单位 ： mAbs） 说 明 书 CN 103080332。