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1、(10)申请公布号 CN 103074347 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103074347 A *CN103074347A* (21)申请号 201310025915.3 (22)申请日 2013.01.23 C12N 15/12(2006.01) A01K 67/027(2006.01) (71)申请人 南京华贞生物医药科技有限公司 地址 211100 江苏省南京市江宁区科学园天 元东路 118 号 (72)发明人 戴一凡 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 肖明芳 (54) 发明名称 适用于哺乳动物表达的人源化 mf。
2、at1 基因及 其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种适用于哺乳动物表达的 人源化 mfat1 基因， 其全序列如 SEQ ID No ： 1 所 示。本发明还公开了上述人源化 mfat1 基因在提 高转基因哺乳动物品质中的应用。本发明的人源 化 mfat1 基因可以在哺乳动物中高效表达， 从而 可以有效改善转基因动物的品质。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图6页 (10)申请公布号 CN 103074347 A CN 103074。
3、347 A *CN103074347A* 1/1 页 2 1. 适用于哺乳动物表达的人源化 mfat1 基因， 其全序列如 SEQ ID No ： 1 所示。 2.权利要求1所述的适用于哺乳动物表达的人源化mfat1基因在提高转基因哺乳动物 品质中的应用。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述的哺乳动物为小鼠。 4. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述的提高转基因哺乳动物品质， 为人源 化 mfat1 基因在哺乳动物体内完成转化为 Omega-3 多不饱和脂肪酸的功能 ； 在胰岛组织中 提高胰岛细胞分泌胰岛素的水平 ； 提高胰岛细胞抵抗细胞因子诱导的凋亡能力。
4、。 权 利 要 求 书 CN 103074347 A 2 1/5 页 3 适用于哺乳动物表达的人源化 mfat1 基因及其应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一种人源化的 mfat1 基因。 背景技术 0002 Omega-3 多不饱和脂肪酸 （omega-3polyunsaturated fatty acids， n-3PUFAs ； 又 称n-3， -3） ， 是人体生长和健康所必需的物质， 属于18-24碳脂肪酸家族， 其碳链上具有3 个以上的双键， 依照第一个双键距离甲基端碳原子不同分为 n-3 系、 n-6 系、 n-7 系、 n-9 系 （即n编号系统，。
5、 也叫编号系统） ， n-3PUFAs是指从脂肪酸碳链甲基端算起， 第一个双键位 于第 3 位碳原子上的多不饱和脂肪酸， 属于亚麻酸类。由于哺乳类细胞不具有能增加双键 到第 9 位原子后的酶， 因此， n-3PUFAs 是人体必需氨基酸， 是细胞膜磷脂的主要成分， 在体 内不能合成， 必须从食物中提供。 0003 n-3PUFAs 主要包括 - 亚麻酸 （-linolenic acid， ALA， 18:3n-3） ， 二十碳五 烯酸 （eicosapentaenoic acid， EPA， 20:5n-3） ， 二十二碳六烯酸 （docosahexaenoic acid， DHA， 22:6。
6、n-3） 。ALA 多来自植物油， 如亚麻籽、 核桃仁及其他种子油， EPA 和 DHA 主要来 自鱼油， 这些成分由于体内不能合成， 只能从食物中摄取， 因此， 被称为 “必需”脂肪酸 （essential fatty acid， EFA） 。其中 - 亚麻酸作为 n-3 多不饱和脂肪酸的前体， 在体内 经去饱和与延长反应， 生成 EPA 或 DHA 等 n-3 多不饱和脂肪酸， 人体内无催化 n-6PUFAs 向 n-3PUFAs转化的n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶。 目前n-3PUFAs主要从鱼油中获取， 但提炼工 艺复杂且产率低。 0004 来源于秀丽线虫 (Caenorhabditis 。
7、elegans) 的 n-3 多不饱和脂肪酸脱氢酶基 因 (fat-1)， 其编码产物是 n-3 多不饱和脂肪酸脱氢酶， 可以 n-6PUFAs 为优先底物， 使其 脱氢转化为 n-3PUFAs。目前， n-3 多不饱和脂肪酸 （n-3PUFA） 主要成果在心血管方面的研 究。它具有降低血脂， 改变血液流变学， 抑制血小板聚集和血栓形成， 抑制动脉粥样硬化斑 块的形成等作用 （Kobayashi M,Sasaki S,Hamada GS.et al.Serum n-3fatty acids,fish consumption and cancer mortality in six Japanes。
8、e populations in Japan and Brazil.J Cancer Res.1999;90(9):914-21.Saadatian-Elahi M,Toniolo P,Ferrari P.et al.Serum fatty acids and risk of breast cancer in a nested case-control study of the New York University Womens Health Study.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2002;11(11):1353-60） 0005 随着研究的不断深入，。
9、 人们发现 n-3PUFA 还具有抗肿瘤功能， 并且越来越重视其 抗肿瘤作用 （Barber MD,Ross JA,Preston T,et a1.Fish oil-enriched nutritional supplement attenuates progression of the acute-phase response in weight-losing patients with advanced pancreatic cancer.J Nutr.1999;129(6):1120-5） 。 人体血液中 的脂肪酸含量测定研究显示， 血液中 n-3PUFAs 水平和前列腺癌发病率成反比关。
10、系 （Pratt VC,Watanabe S,Bruera E,et al.Plasma and neutrophil fatty acid composition in advanced cancer patients and response to fish oil supplementation.Br J 说 明 书 CN 103074347 A 3 2/5 页 4 Cancer.2002,87(12):1370-1378） 。研究结果发现， n-3PUFAs 可以通过多种途径抑制肿瘤 细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡 （Stoll BA.N-3fatty acids and lipid pe。
11、roxidation in breast cancer inhibition.Br J Nutr.2002,87(3):193-198.Palakurthi SS,Fluckiger R,Aktas H,et al.Inhibition of translation initiation mediates the anticancer effect of the n-3polyunsaturated fatty acid eicosapentaenoic acid.Cancer Res.2000,60(11):2919-2925） 。基于这些数据 , 我们对 fat1 基因进行了改造， 得到 。
12、mfat1 基因， 以使该基因能够在哺乳动物中高效表达。 我们预期在哺乳动物中表达人源化的mfat1 基因， 可有效提高各种转基因动物的品质。 发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题是提供一种人源化的可以在哺乳动物中高效表达的 mfat1 基因。 0007 本发明序列如 SEQ ID No ： 1 所示。 0008 上述适用于哺乳动物表达的人源化 mfat1 基因在提高转基因哺乳动物品质中的 应用。 0009 其中， 所述的哺乳动物为小鼠。 0010 其中， 所述的提高转基因哺乳动物品质， 为人源化 mfat1 基因在哺乳动物体内完 成转化为 Omega-3 多不饱和脂肪酸的功能 ； 在。
13、胰岛组织中提高胰岛细胞分泌胰岛素的水 平 ； 提高胰岛细胞抵抗细胞因子诱导的凋亡能力。 0011 有益效果 ： 本发明的人源化 mfat1 基因可以用于在哺乳动物中表达， 同时在体内 完成转化为 Omega-3 多不饱和脂肪酸的功能， 在胰岛组织中可以有效提高胰岛细胞分泌胰 岛素的水平， 另外， 可以提高胰岛细胞抵抗细胞因子诱导的凋亡能力。 附图说明 0012 图 1 是本发明实施例中构建的 pST181 转基因载体的示意图。 0013 图 2 是 mfat1 转基因和野生型对照小鼠分别分离胰岛组织后， 用不同浓度的葡萄 糖和 10nmol/l 的胰高血糖素样肽 -1 共同处理 30 分钟， 。
14、测量胰岛素分泌水平。结果显示在 葡萄糖和胰高血糖素样肽 -1 刺激下， mfat1 转基因小鼠的胰岛有更高水平的胰岛素分泌。 0014 图 3 是 mfat1 转基因和野生型对照小鼠分别分离胰岛组织， 然后用 1.1mmol/l 的 葡萄糖以及 10mmol/l 亮氨酸和 10mmol/l 谷氨酸盐处理 60 分钟， 对照是仅用 1.1mmol/l 的 葡萄糖处理， 测定胰岛素分泌水平。 结果显示在葡萄糖， 亮氨酸和谷氨酸盐刺激下， mfat1转 基因小鼠的胰岛有更高水平的胰岛素分泌。 0015 图 4 是 mfat1 转基因和野生型对照小鼠分别分离胰岛组织， 用 10mol/l 前列腺 素 。
15、E2（PGE2） 预处理， 之后分别用 50ng/ml 百日咳毒素 （PTX） 处理， 没有百日咳毒素处理的 作为对照， 然后研究葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平。结果显示 mfat1 转基因小鼠的胰岛组 织分泌更多的胰岛素。 0016 图 5 是细胞因子诱导的凋亡测试。从 mfat1 转基因小鼠和对照野生型小鼠分离的 胰岛用细胞因子处理 48 小时， 然后用荧光共聚焦显微镜分析。结果显示 mfat1 转基因小鼠 可以明显抑制细胞因子诱导的凋亡。 说 明 书 CN 103074347 A 4 3/5 页 5 0017 图 6 是细胞因子诱导的凋亡测试的定量统计分析。结果显示 mfat1 转基因小鼠可。
16、 以明显抑制细胞因子诱导的凋亡。 具体实施方式 0018 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的内容仅用于说明本发明， 而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。 0019 实施例 1 ： pST181 质粒的构建。 0020 首先根据线虫 fat1 基因的 cDNA 序列， 根据哺乳动物核苷酸使用频率进行优化， 合成了在哺乳动物中高效表达 fat1 的 cDNA 序列 ( 由 Geneart 合成 )， 命名为 mfat1， 这 种能广泛在小鼠中表达 fat1 的转基因片段包含有 1.7kb 的 CMV 联合鸡 - 肌动蛋白 （。
17、CMV-chicken-actin promoter） 基因的启动子、 肌肉肌酸激酶增强子 muscle creatine kinase(MCK)enhancer, 小鼠 fat1 基因的 cDNA( 哺乳动物 mfat-1cDNA， 其编码区经优化以 后在哺乳动物细胞体系中具有有效的翻译 ) 和牛生长激素基因 （bGH） 的 3 端不翻译区， 且 带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因新霉素 （Neomycin） 基因和原核细胞中筛选用的抗 性基因氨苄青霉素 （ampicillin） 基因 （见图 1） 。这种能广泛性表达的 - 骨骼肌肌动蛋 白 （CMV-chicken-actin promo。
18、ter） 基因的启动子可保证下游基因广泛性表达。 0021 本发明构建的全身性表达 mfat1 的转基因载体的全序列如 SEQ ID No ： 1 所示， 其 中 586-2285 碱基为基因的启动子区， 第 317-533 碱基为 MCK enhancer， 第 2286-3516 碱基 为 mfat1 基因的编码区， 第 3572-3796 碱基为 bGH3 端不翻译区， 第 4275-5778 碱基为新霉 素 （Neomycin） 抗性基因， 第 6972-7971 碱基为氨苄青霉素 （Ampicillin） 抗性基因。 0022 实施例 2 ： 利用原核注射的方法构建转基因小鼠并进行鉴。
19、定。 0023 将构建好的 pST181 转基因载体， 用 Bgl II 和 Rsr II 限制性内切酶酶切， 回收所 需片断， 通过原核注射的方法直接注入受精卵， 使外源基因整合到 DNA 中， 然后将受精卵植 入 4-5 周龄的代孕 C57BL/6 母鼠体内。提取 mfat-1 转基因小鼠尾部的基因组， 利用 PCR 引 物进行扩增， 进行基因型鉴定。 0024 正向引物为 ： 5 -GGACCTTGGTGAAGAGCATCCG-3 ， 0025 反向引物为 ： 5 -GCGTCGCAGAAGCCAAAC-3 。 0026 得到的 438bp 的片段为阳性片断。 0027 实施例 3 ： 。
20、mfat-1 转基因小鼠的表型功能分析。 0028 1. 小鼠体内组织的脂肪酸测定， mfat1 转入小鼠体内， 可以有效地将小鼠体内 Omega-6 多不饱和脂肪酸转化为 Omega-3 多不饱和脂肪酸。 0029 提取小鼠鼠尾和胰岛组织的脂肪酸， 通过气象色谱的方法测定小鼠鼠尾和胰岛组 织中不饱和脂肪酸含量， 发现实施例 2 制得的转基因小鼠的鼠尾和胰岛组织较野生型对照 小鼠相比， 含有更高水平的Omega-3多不饱和脂肪酸， 和较低水平的Omega-6多不饱和脂肪 酸。如表 1 所示。表 1 是本发明实施例 3 中， 转基因小鼠和对照野生型小鼠鼠尾和胰岛组 织的脂肪酸测定结果， mfat。
21、1 转基因小鼠和野生型对照组小鼠分别取用 50mg 的尾巴组织和 200个胰岛。 结果说明将mfat1转入小鼠体内， 可以有效地将小鼠体内的Omega-6多不饱和 脂肪酸转化为 Omega-3 多不饱和脂肪酸。 说 明 书 CN 103074347 A 5 4/5 页 6 0030 表 1 0031 0032 * 代表当 mfat1 组与相应的野生型对照组相比时 p0.001 具有显著差异。 0033 2分离小鼠胰岛组织， 用高浓度葡萄糖和胰高血糖素样肽 -1 处理分离的小鼠胰 岛组织， 转基因小鼠分离的胰岛细胞分泌胰岛素水平有显著提高。 0034 通 过 以 下 方 法 分 离 小 鼠 胰 。
22、岛 ： 通 过 胰 管 用 含 有 collagenase(type V) 的 Hanks buffered saline solution(HBSS) 进行灌注消化。消化以后剪碎， 置于 HBSS 中， 37 C， 15 分钟， 然后用 500m 的细胞筛过滤， HBSS 清洗， Ficoll-gradient 梯度离心纯 化胰岛， 最后在倒置显微镜下手工挑出分离的胰岛， 每 10 个类似尺寸的胰岛分为一组， 在 Krebs-Ringer bicarbonate buffer(KRBB)( 添加 10mmol/l HEPES and0.5%BSA) 中进行 预处理， 用 2.8mmol/l 。
23、葡萄糖在 37 C 处理 1 小时， 用 KRBB 洗一次， 然后用含有低浓度葡 萄糖 (2.8mmol/l) 或高浓度葡萄糖 （22.2mmol/l）的 1ml 新鲜配置的 KRBB 处理 30 分钟。 对照组是分离的胰岛用含有高浓度葡萄糖和 10nmol/l 胰高血糖素样肽 -1glucagon-like peptide-1(GLP-1) 的 KRBB 处理， 作为对照组。处理之后， 收集上清于 KRBB 中， 用 ELISA 的 方法测定胰岛素含量。 经葡萄糖刺激后， 转基因小鼠的胰岛组织较对照相比， 分泌胰岛素水 平有显著提高。如图 2 所示。 0035 3分离的小鼠胰岛组织， 用氨基。
24、酸刺激处理， 转基因小鼠分离的胰岛细胞分泌胰 岛素水平有显著提高。 0036 另外， 每10个类似尺寸的胰岛分为一组， 在KRBB和1.1mmol/l葡萄糖在37C处 理 1 小时， 然后在含有 1.1mmol/l 葡萄糖， 10mmol/l 亮氨酸和 10mmol/l 谷氨酸盐的 0.5ml 新鲜配置的 KRBB 中处理 1 小时， 之后收集上清， 将胰岛收集在 KRBB 中， 测定胰岛素含量， 如 图 3。结果显示， 经氨基酸刺激后， 转基因小鼠的胰岛组织分泌胰岛素水平有显著提高。 0037 4分离的小鼠胰岛组织， 用百日咳毒素和前列腺素 E2 刺激处理， 转基因小鼠分离 的胰岛细胞分泌胰。
25、岛素水平有显著提高。 0038 每 6 个类似尺寸的胰岛分为一组， 用含 2.8mmol/l 的葡萄糖， 有或者没有 50ng/ml 的百日咳毒素以及10mol/l的前列腺素E2(PGE2)的KRBB处理12小时， 在进行22.2mmol/ l 的葡萄糖刺激实验之前。收集培养液， 测定胰岛素浓度。如图 4 所示， mfat1 转基因小鼠 的胰岛组织分泌更多的胰岛素。 0039 5分离的小鼠胰岛组织， 用不同的细胞因子刺激处理， 转基因的胰岛细胞可以完 全抵抗细胞因子诱导的细胞坏死。 0040 胰 岛 体 外 培 养 48 小 时 以 后，用 以 下 的 细 胞 因 子 处 理 ： 5ng/ml。
26、 human 说 明 书 CN 103074347 A 6 5/5 页 7 interleukin-1(IL-1 白细胞介素 )， 100ng/ml-interferon(IFN- 干扰素 )， 以及 10ng/ml tumor necrosis factor-(TNF-肿瘤坏死因子)48小时。 每组实验重复三次。 胰岛用 propidium iodide(PI) 碘化丙啶和 Hoescst nuclear dye 复染， 用 confocal 显微 镜分析。如图 5， 6 所示。结果显示转基因的胰岛细胞可以完全抵抗细胞因子诱导的细胞坏 死。 0041 现代社会人类的食物中Omega-6多不饱。
27、和脂肪酸对应Omega-3多不饱和脂肪酸的 比例高达20:1， 而非理想比例的1:1， 相对来源于Omega-3多不饱和脂肪酸的类二十烷酸产 物， Omega-6 多不饱和脂肪酸的类二十烷酸产物是更加潜在的炎症因子， 失衡的 Omega-6 多 不饱和脂肪酸对应 Omega-3 多不饱和脂肪酸比例将是高度促进炎症反应的， 这种失衡的比 例会诱发许多的现代疾病， 例如自身免疫疾病， 糖尿病等等。 0042 细胞内 Omega-3 多不饱和脂肪酸水平的上升对于炎症刺激下胰岛细胞的存活有 着非常有利的影响， 这也可以解释为什么在幼年期增加 Omega-3 多不饱和脂肪酸的摄入量 可以有效减少 1 型。
28、糖尿病的发生。 说 明 书 CN 103074347 A 7 1/3 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 103074347 A 8 2/3 页 9 0003 序 列 表 CN 103074347 A 9 3/3 页 10 序 列 表 CN 103074347 A 10 1/6 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 103074347 A 11 2/6 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 103074347 A 12 3/6 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 103074347 A 13 4/6 页 14 图 4 说 明 书 附 图 CN 103074347 A 14 5/6 页 15 图 5 说 明 书 附 图 CN 103074347 A 15 6/6 页 16 图 6 说 明 书 附 图 CN 103074347 A 16 。