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1、(10)申请公布号 CN 102977215 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102977215 A *CN102977215A* (21)申请号 201210503077.1 (22)申请日 2012.11.30 C07K 19/00(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 29/00(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第三军医大学 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正街 30 号 (72)发明人 王靖雪 吴玉章 刘钱 刘宏利 (74)专利代理机构。
2、 北京同恒源知识产权代理有 限公司 11275 代理人 赵荣之 (54) 发明名称 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种靶向肝脏的 caspase-1 抑 制剂， 由人乙型肝炎病毒 Pre-S1 肽通过柔性接 头与 caspase-1 抑制剂连接而成， Pre-S1 肽由 Pre-S1 蛋白的第 1-50 位氨基酸组成， caspase-1 抑制剂由 YVAD 四肽的三分子聚合物通过柔性 接头与 VAD 三肽的三分子聚合物连接而成 ； 该 制剂利用特异性靶向肝脏的载体 Pre-S1 肽将 caspase-1 抑制剂特异性靶向肝细胞， 既有利于 通过终。
3、止肝细胞内的 caspase-1 活化来阻断由损 伤肝细胞释放的内源性危险信号导致的肝内持续 性慢性炎症， 进而阻断肝细胞的继发性损伤， 也有 利于减少 caspase-1 广泛抑制可能导致的机体不 良反应， 从而对肝细胞起到特异有效的保护， 可用 于制备由损伤肝细胞释放的内源性危险信号导致 的肝内慢性炎症的治疗药物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂，。
4、 其特征在于， 由人乙型肝炎病毒 Pre-S1 肽通过柔性 接头与caspase-1抑制剂连接而成， 所述Pre-S1肽由Pre-S1蛋白的第1-50位氨基酸组成， 所述 caspase-1 抑制剂由 YVAD 四肽的三分子聚合物即 Tyr-Val-Ala-Asp-Tyr-Val-Ala-As p-Tyr-Val-Ala-Asp通过柔性接头与VAD三肽的三分子聚合物即Val-Ala-Asp-Val-Ala-As p-Val-Ala-Asp 连接而成。 2.根据权利要求1所述的靶向肝脏的caspase-1抑制剂， 其特征在于， 所述靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂由 SEQ ID No.1。
5、 所示的氨基酸序列组成。 3.权利要求1所述的靶向肝脏的caspase-1抑制剂在制备由损伤肝细胞释放的内源性 危险信号导致的肝内慢性炎症的治疗药物中的用途。 权 利 要 求 书 CN 102977215 A 2 1/4 页 3 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 涉及一种酶抑制剂及其在医药领域中的用途。 背景技术 0002 以慢性肝炎为主要原因导致的慢性肝损伤是我国的重大健康问题， 也是当前世界 卫生组织公布的人类主要死亡病因之一。 慢性肝脏炎症一旦启动， 难以终止， 进一步造成肝 硬化、 肝功能衰竭、 肝癌的发生， 称为 “慢性肝病。
6、三步曲” ； 并且， 肝细胞的损伤也难以终止， 被喻为 “永不愈合的创伤” 。 0003 既往研究认为， 病毒在肝内的活动是肝内炎症持续存在的重要原因， 所以抗病毒 治疗是目前治疗慢性乙肝最常采用的方式。但研究发现， 即使是有效抑制了病毒复制， 也 难以终止慢性乙肝进展到肝硬化 / 肝功能衰竭的恶性病程， 而这恰恰是慢性乙肝的主要危 害。目前临床尚无能够阻断慢性肝炎恶性进展的有效治疗策略和治疗药物。 0004 炎症体 （inflammasome） 在炎症应答和免疫调控中具有重要作用， 通过感知各种内 源性和外源性的危险信号， 活化以caspase-1为主的激酶， 促进IL-1的分泌， 启动炎症。
7、应 答， 生理状况下， 清除感染和死亡细胞， 维持机体内环境稳态， 也有报道 caspase-1 的异常 活化与多种自身免疫病或自身炎症性疾病相关。 发明内容 0005 根据发明人和其他研究人员的最新研究结果， 炎症体与慢性肝损伤包括慢性乙肝 病毒感染相关的慢性肝炎密切相关。发明人的研究结果显示 ： 慢性乙肝的炎症持续原因并 不仅仅包括乙肝病毒的活动， 也能由损伤肝细胞特别是凋亡肝细胞释放的内源性危险信号 引起 ； 这些内源性危险信号以损伤肝细胞释放的 ATP 为代表， 通过活化炎症体， 导致肝内慢 性炎症和慢性损伤。同时， 发明人在肝细胞等组织细胞中的研究也发现， 肝细胞 （一种非免 疫细胞。
8、） 中也存在 caspase-1 的应答机制， 肝内微环境中常见的内源性危险信号 （如 HMGB1、 尿酸、 ATP 等） 能够有效启动肝细胞内 caspase-1 的活化， 进而促进炎症应答。因此， 阻断肝 细胞内 caspase-1 的活化有可能阻断由损伤肝细胞释放的内源性危险信号导致的肝内慢 性炎症， 进而阻断肝细胞的继发性损伤和慢性肝炎的恶性进展。 0006 有鉴于此， 本发明的目的之一在于研制一种靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂， 并考 察其是否可以通过终止肝细胞内的 caspase-1 活化来阻断由损伤肝细胞释放的内源性危 险信号导致的肝内慢性炎症， 进而阻断肝细胞的继发性损。
9、伤， 同时避免 caspase-1 广泛抑 制可能引起的机体不良反应， 最终实现对肝细胞特异有效的保护 ； 目的之二在于提供所述 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂在制药领域中的用途。 0007 经过研究， 本发明提供如下技术方案 ： 1靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂， 由人乙型肝炎病毒 Pre-S1 肽通过柔性接头与 caspase-1 抑制剂连接而成， 所述 Pre-S1 肽由 Pre-S1 蛋白的第 1-50 位氨基酸组成， 所述 caspase-1 抑制剂由 YVAD（Tyr-Val-Ala-Asp） 四肽的三分子聚合物即 Tyr-Val-Ala-Asp-T 说 明 书 C。
10、N 102977215 A 3 2/4 页 4 yr-Val-Ala-Asp-Tyr- Val-Ala-Asp 通过柔性接头与 VAD（Val-Ala-Asp） 三肽的三分子聚 合物即 Val-Ala-Asp-Val-Ala- Asp-Val-Ala-Asp 连接而成。 0008 进一步， 所述靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂由 SEQ ID No.1 所示的氨基酸序列组 成， 即所述Pre-S1肽与caspase-1抑制剂之间的柔性接头以及YVAD肽三分子聚合物与VAD 肽三分子聚合物之间的柔性接头均由 3 个甘氨酸组成。 0009 2所述靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂在制备由。
11、损伤肝细胞释放的内源性危险信 号导致的肝内慢性炎症的治疗药物中的用途。 0010 本发明的有益效果在于 ： 本发明利用特异性靶向肝脏的载体 Pre-S1 肽与 caspase-1 抑制剂连接， 制得了一种靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂， 并对其药理活性进行了 实验研究。研究结果显示， 该靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂能够特异有效地被原代肝细胞 摄取， 能够有效抑制由内源性危险信号ATP启动的原代肝细胞内caspase-1的活化， 减少促 炎症细胞因子IL-1的产生， 并能够有效阻断由内源性危险信号ATP启动的原代肝细胞的 死亡， 从而初步证实了可以通过阻断肝细胞内 caspas。
12、e-1 的活化来阻断由损伤肝细胞释放 的内源性危险信号导致的肝内持续性慢性炎症， 进而阻断肝细胞的继发性损伤， 这是治疗 慢性肝炎的一种创新性策略， 可能阻断慢性肝炎的恶性进展， 将是目前常规临床治疗方式 的重要且必要的补充。将 caspase-1 抑制剂特异性靶向肝脏， 不仅有利于终止肝细胞内的 caspase-1 活化， 而且有利于减少全身系统性的 caspase-1 抑制可能导致的严重的内环境 紊乱和免疫缺陷等不良反应， 从而实现对肝细胞特异有效的保护。 因此， 本发明的靶向肝脏 的 caspase-1 抑制剂可用于制备由损伤肝细胞释放的内源性危险信号导致的肝内慢性炎 症的治疗药物， 在。
13、终止包括慢性乙肝在内的各种慢性肝炎病程进展方面具有潜在、 良好的 应用前景。 附图说明 0011 为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合附图对本发明作进 一步描述， 其中 ： 图 1 为流式细胞仪检测原代肝细胞对靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂的摄取比例， 其中 a 表示阴性对照 （荧光标记的无关七肽） ， b 表示荧光标记的靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂， c 表示荧光标记的 caspase-1 抑制剂。 0012 图 2 为蛋白免疫印迹检测靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂对内源性危险信号 ATP 启 动的原代肝细胞内caspase-1活化的影响， 其。
14、中1表示未干预的正常肝细胞， 显示有大量的 caspase-1 活化后产生的 p10 亚单位， 2、 3、 4 分别表示靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂 5M、 20M、 40M 处理组。 0013 图 3 为 ELISA 实验检测靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂对内源性危险信号 ATP 启动 原代肝细胞内 Caspase-1 活化后产生 IL-1 能力的影响。 0014 图4为乳酸脱氢酶释放实验检测靶向肝脏的caspase-1抑制剂对内源性危险信号 ATP 启动的原代肝细胞死亡的影响。 0015 图 3 和图 4 中 “block” 表示靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂。 。
15、具体实施方式 说 明 书 CN 102977215 A 4 3/4 页 5 0016 以下将参照附图， 对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 0017 一、 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂的制备 设计并委托生工生物工程 （上海） 股份有限公司合成氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂。在 SEQ ID No.1 所示序列中， 第 1-50 位氨基酸为来源于乙 型肝炎病毒株 FMC#97 的 Pre-S1 蛋白的第 1-50 位氨基酸序列， 第 51-53 。
16、位氨基酸为柔性接 头， 第 54-65 位氨基酸为 YVAD（Tyr-Val-Ala-Asp） 四肽的三分子聚合物， 第 66-68 位氨基 酸为柔性接头， 第 69-77 位氨基酸为 VAD（Val-Ala-Asp） 三肽的三分子聚合物。 0018 同时， 合成缺少靶向载体的caspase-1抑制剂作为对照， 即从SEQ ID No.1所示序 列中去除第 1-53 位氨基酸。 0019 二、 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂的活性检测 1、 人原代肝细胞的培养 取非 HBV 相关的肝癌患者外科手术肿瘤切除的无相邻的正常组织， 按文献方法 （Methods for preparation。
17、 of adult and fetal hepatocytes. Isolated and cultured hepatocytes. A.Guillouzo and C.Guguen-Guillouzo. Les E ditions INSERM Paris, John Libbey and Co.,Ltd. 1986, 1-12） 分离原代肝细胞， 用含有3.510-6 M氢化可的松 琥珀酸单酯、 2%(v/v) 二甲基亚砜、 5%(v/v) 人血清和 5%(v/v) 胎牛血清的 H 培养基培养。 0020 2、 流式细胞仪检测原代肝细胞对靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂的摄取率 将。
18、人原代肝细胞接种至 12 孔板中培养， 每孔约 106个细胞， 与 FITC 标记的靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂共孵育 60 分钟， 弃去培养上清， 细胞用 PBS 漂洗 2 次， 用 4%(v/v) 多聚甲 醛溶液固定后， 于流式细胞仪 488nm 激发光下检测细胞对靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂的 摄取比例， 以 FITC 标记的缺少靶向载体的 caspase-1 抑制剂作为对照。结果如图 1 所示， 可见原代肝细胞能够特异有效地摄取靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂， 而对缺少靶向载体的 caspase-1 抑制剂的摄取率与阴性对照相差无几。 0021 3、 蛋白免。
19、疫印迹检测靶向肝脏的caspase-1抑制剂对内源性危险信号ATP启动的 原代肝细胞内 caspase-1 活化的影响 Caspase-1 活化需要双信号， 通常有一个预激信号用以上调 pro-caspase-1 以及 pro-IL-1 等分子的表达， 可以是 LPS、 CpG 等各种病原体携带的毒性分子 ； 另一个信号是 危险信号， 直接激活在细胞中的炎症体 （inflammasome） ， 使 pro-caspase-1 被切割成为有 活性的 caspase-1， 再切割 pro-IL-1 产生有活性的 IL-1。在正常生理状态下， 肝细胞 就处于含有生理活性浓度的 LPS 的血液中。因此。
20、， 在蛋白免疫印迹实验和后续的 ELISA 实 验和乳酸脱氢酶释放实验中， 均采用 LPS 作为 caspase-1 活化的预激信号， 并采用 ATP 作为 内源性危险信号。 0022 将人原代肝细胞接种至 12 孔板中培养， 每孔约 106个细胞， 分设 4 组 ： 组与 200ng/ml LPS 共孵育 24 小时， 移除 LPS， 再加入 5M ATP 继续刺激 6 小时 ； 组在加入 LPS 前， 先用 5M 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂预处理 1 小时， 其余与组相同 ； 组在 加入 LPS 前， 先用 20M 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂预处理 1 小时， 其余。
21、与组相同 ； 组在加入 LPS 前， 先用 40M 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂预处理 1 小时， 其余与组相 同 ； 最后收集细胞， 用 RIPA 裂解液裂解后， 收集总蛋白并测定浓度。将收集的总蛋白进行 说 明 书 CN 102977215 A 5 4/4 页 6 SDS-PAGE， 电泳完毕后转膜， 用 WB 洗涤液漂洗， 再加入 WB 封闭液， 室温封闭 60 分钟， 去除封 闭液， 再加入按体积比1:200稀释的caspase-1一抗 （Santa Cruze公司） 和GAPDH抗体， 4 过夜孵育， 去除一抗， 用 WB 洗涤液漂洗， 再加入二抗， 室温孵育 1 小时， 。
22、去除二抗， 再用 WB 洗 涤液漂洗， 最后采用化学发光法检测 caspase-1 活化片段 p10 亚单位。结果如图 2 所示， 可 见靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂有效地阻断了原代肝细胞中 caspase-1 的活化。 0023 4、 ELISA 实验检测靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂对内源性危险信号 ATP 启动原代 肝细胞 caspase-1 活化后产生 IL-1 能力的影响 将人原代肝细胞接种至 12 孔板中培养， 每孔约 106个细胞， 分设 5 组 ： 组不加入任何 试剂 ； 组与 200ng/ml LPS 共孵育 12 小时或 24 小时， 移除 LPS， 再加。
23、入 5M ATP 继续刺 激 6 小时 ； 组在加入 LPS 前， 先用 5M 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂预处理 1 小时， 其 余与组相同 ； 组在加入 LPS 前， 先用 20M 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂预处理 1 小 时， 其余与组相同 ； 组在加入 LPS 前， 先用 40M 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂预处理 1 小时， 其余与组相同 ； 最后收集培养上清， 用 IL-1 的 ELISA 检测试剂盒 （Abcam 公司） 检测培养上清中 IL-1 的分泌情况。结果如图 3 所示， 可见原代肝细胞中 caspase-1 活化 后产生IL-1的能力被靶。
24、向肝脏的caspase-1抑制剂有效抑制， 且该抑制作用呈现剂量依 赖性。 0024 5、 乳酸脱氢酶释放实验检测靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂对内源性危险信号 ATP 启动的原代肝细胞死亡的影响 将人原代肝细胞接种至 12 孔板中培养， 每孔约 104个细胞， 分设 6 组 ： 组不加入任何 试剂， 为样品对照组 ； 组与200ng/ml LPS共孵育24小时， 移除LPS， 再加入5M ATP继续 刺激6小时 ； 组在加入LPS前， 先用5M 靶向肝脏的caspase-1抑制剂预处理1小时， 其 余与组相同 ； 组在加入 LPS 前， 先用 20M 靶向肝脏的 caspase-1 。
25、抑制剂预处理 1 小 时， 其余与组相同 ； 组在加入 LPS 前， 先用 40M 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂预处理 1 小时， 其余与组相同 ； 不加任何处理， 收集细胞后用 1%NP-40 处理， 为最大酶活性组 ； 另设无血清培养基为空白对照 ； 最后收集培养上清， 加入 60l LDH 检测工作液， 混匀， 室 温避光孵育 30 分钟， 于 490nm 处测定吸光度， 并使用 600nm 作为参考波长进行双波长测定， 各组吸光度以测得吸光度减去空白对照吸光度的差值表示， 按以下公式计算细胞死亡率 ： 细胞死亡率 (%)=( 样品处理组吸光度 - 样品对照组吸光度 )/( 最。
26、大酶活性组吸光度 - 样 品对照组吸光度)100。 结果如图4所示， 可见靶向肝脏的caspase-1抑制剂有效地抑制 了由内源性危险信号 ATP 启动的原代肝细胞的死亡。 0025 最后说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述， 但本领域的普通技术人员应当理解， 可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。 说 明 书 CN 102977215 A 6 1/1 页 7 中国人民解放军第三军医大学 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂及其应用 1 1 77 PRT。
27、 人工序列 靶向肝脏的 caspase-1 抑制剂 1 Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn 1 5 10 15 Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu 20 25 30 Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe 35 40 45 Asn Pro Ile Lys Asp Gly Gly Gly Tyr Val Ala Asp Tyr Val Ala 50 55 60 Asp Tyr Val Ala Asp Gly Gly Gly Val Ala Asp Val Ala Asp Val 65 70 75 Ala Asp 序 列 表 CN 102977215 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102977215 A 8 2/2 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 102977215 A 9 。