具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物及其制备方法和应用 技术领域 本发明涉及蓝萼甲素 (GLA) 衍生物， 特别涉及具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生 物。 本发明还涉及所述具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物的制备方法及其在治疗癌症中 的应用。
背景技术 唇形科香茶菜属植物。在亚洲东部和非洲西部广为分布， 全世界约有 150 种， 我国 约有 90 种 25 个变种。其中约有 30 种民间作为药用， 作为清热解毒、 抗癌消炎、 健脾、 活血、 杭菌药来使用。 人们对该属植物的 - 菇类成分作了研究， 已从中提取了百余种药类成分。 经 药理筛选发现许多二萜化合物具有细胞毒、 抗肿瘤、 杭炎活性作用。
蓝萼香茶菜是唇形科香茶菜属植物， 分布在我国的东北、 华北， 朝鲜 . 日本， 原苏 联远东地区， 吉林省资源尤其丰富。 蓝萼香茶菜具有健胃、 清热解毒、 活血、 抗菌消炎和抗癌 活性， 用于胃炎、 肝炎初起、 感冒发热、 乳腺炎、 关节痛等疾病。现代研究发现全草对心血管
有一定的作用， 而其中的有效成分对血小板聚集及癌症有一定的影响。
1981 年许云龙等人从蓝萼香茶菜中提取出蓝萼甲素 (glaucocalyxinA) 和蓝萼乙 素 (glaucocalyxinB)， 从光谱中推断蓝萼甲素具有香茶菜属二萜典型的巧一氧 -16 一贝壳 杉烯 (ent-15-oxo-l6-kaurene) 骨架， 而蓝萼乙素是蓝萼甲素的 14 一乙酰化物， 把两者分 别乙酰化， 得到相同的乙酰化物， 从而证实了两者的相互关系。 随后赵全成也从吉林产蓝萼 香茶菜中分得这两种二萜。
1988 年刘晨江等从北京地区产蓝萼香茶菜中分得甲素和乙素外， 还分得蓝萼丙素 (glaucocalyxinC)， 结构为对映 -7p， 14a， 15a- 三羟基 -16- 贝壳杉 -3- 酮。Dongsa kimls， 除了从中分出蓝萼甲素、 蓝萼乙素和蓝萼丙素， 还分出了两种新二萜 glaucocalyxinD 和 glaucocalyxinE 并列出了这五种化合物的结构红外紫外吸收值、 最主要的 1H 一核磁共振、 13C 一核磁共振化学位移值及质谱数据值。
金永日等从蓝萼香茶菜根中分得了蓝萼甲素， 另外王先荣等从安徽产王枣子 〔 Isodonamethystoides(Benth)CyWuetHsuan〕 中也分得蓝萼甲素。王慧芬等人用反相高效 液相色谱法外标法对不同部位及不同采集期的蓝萼香茶菜中蓝萼甲素的含量进行了测定， 结果表明叶中蓝萼甲素远高于根、 茎。不同采集期以 7-8 月份含量高， 9 月末含量下降。张 元桐等也采用反相 HPLC 测定蓝萼甲素含量， 测得蓝萼甲素含量为 1.03 ％， 平均回收率为 99.2％。
从蓝萼甲素体内外实验结果来看， 其具有较强的抗肿瘤作用， 且抗瘤谱较广， 能抑 制 Lewis 肺癌、 5180 实体型以及 HCA 实体型等实体瘤的生长， 明显增加荷腹水型 5180 腹水 型和荷 HCA 腹水型小鼠的生命延长率， 其抗肿瘤作用的强弱呈剂量依赖性。
科研人员用 MTT 法对从毛叶香茶菜叶中分离鉴定的 14 个已知对映 - 贝壳杉烯类 二萜化合物进行了人早幼粒白血病细胞、 人卵巢癌细胞和人肺癌细胞的抗癌活性研究， 其 中具有 α- 亚甲基环戊酮结构的化合物对上述 3 种肿瘤细胞株均表现出不同程度的抑制活性。从蓝萼香茶菜叶分离的化合物如蓝尊香茶菜甲素 (GLA) 和乙素 (GLB) 结构中具有 α- 亚甲基环戊酮， 因而显示出较强的生物活性。
对若干天然及化学修饰后的贝克杉烯类化合物进行了系统的体外抗肿瘤活性筛 选及构效关系研究表明， 应用化学手段破坏分子中 α- 亚甲基环戊酮结构单元， 会显著降 低贝克杉烯类化合物的抗肿瘤活性。
由于蓝萼甲素为对映 - 贝壳杉烯类二萜化合物， 其化合物极性小， 易溶于氯仿等 非极性溶剂， 在水中不溶， 因此不适合直接作为药物进行给药 ； 蓝萼甲素体外具有明显的抗 癌作用， 但在体内需大剂量长时间用药才能产生药效。药物在体内消除很快， 半衰期短， 尚 不能直接作为药物使用。 发明内容
鉴于蓝萼甲素 (GLA) 特别是其 α- 亚甲基环戊酮结构对肿瘤细胞株活性具有良好 的抑制作用， 然而由于其极性小、 半衰期短等特点， 其不适于直接作为药物进行给药， 故现 在需要以蓝萼甲素 (GLA) 为先导化合物， 通过对先导化合物的结构改造， 来获得蓝萼甲素 的衍生物， 从而使其按照已知的代谢途径失活或不代谢， 而由原形排出体外， 从而提高药物 的安全性， 增加药效。本发明的目的之一在于提供具有对肿瘤细胞株良好的抑制作用的、 结构改良的具 有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物， 从而解决 GLA 极性小、 不易溶于水、 半衰期短、 在体内 消除过快等缺陷， 从而作为治疗癌症的药物使用。
本发明的目的之二在于提供所述具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物的制备方 法， 避免单纯的采用有机合成所带来的毒副作用较大的缺陷， 并且避免单纯的采用原料提 纯多带来的药效较低、 无法针对性治疗某一特定癌症的缺陷。
本发明所公开的具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物是一种贝壳杉烷型四环二 萜类物质， 具有贝壳杉烷型结构、 羰基、 羟基和环状八肽结构， 其分子结构的通式如下 ：
其中， R1、 R2 为 -OH 或而 R3 为环状八肽取代基。
在一个优选实施例中， 所述 R1 和 R2 中有一个为 -OH。 在一个优选实施例中， 所述 R3 为环状八肽的取代基 环状八肽的分子式为 C33H48N11O17S2。所述环状八肽具有 D 型或 L 型结构， 其中所述研究表明上述 cNGQGEQc 环状八肽与非小细胞肺癌 (A-549)、 肺鳞癌 Calu-1、 肺腺 鳞癌 H178 细胞具有特异性结合， 这是通过整合素 α3 的介导完成的。
故蓝萼甲素中引入了上述环状八肽取代基， 使得经修饰后的 GLA 衍生物可以与相 应的肿瘤细胞进行特异性结合， 即可以对肿瘤细胞进行靶向给药， 从而发挥有效的抗癌作 用。
在 一 个 优 选 实 施 例 中， 所 述 R1 为所 述 R2为 -OH， 所述 R3 为 D 型环状八肽取代基 下：
其分子结构如
在 一 个 优 选 实 施 例 中， 所 述 R2 为所 述 R1为 -OH， 所述 R3 为 D 型环状八肽取代基 下：
其分子结构如
在 一 个 优 选 实 施 例 中， 所 述 R1 为所 述 R2为 -OH， 所述 R3 为 L 型环状八肽取代基 下：
其分子结构如
在 一 个 优 选 实 施 例 中， 所 述 R2 为所 述 R1为 -OH， 所述 R3 为 L 型环状八肽取代基 下：
其分子结构如上述具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物由于具有 GLA 的 α- 亚甲基环戊酮结 构， 故其对肿瘤细胞株活性具有良好的抑制作用， 另一方面， 上述具有环状八肽结构的蓝萼 甲素衍生物由于具有环状八肽的结构修饰， 故其对肿瘤细胞株具有特异性结合， 从而对肿 瘤细胞株进行靶向给药， 并且上述具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物进行了结构修饰， 解决了极性小、 半衰期短等缺陷特点， 适于作为治疗癌症的药物使用。
上述具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物按照以下方法进行制备， 其包含用于制 备作为先导化合物的蓝萼甲素的步骤 1 ～ 4 以及用于结构修饰蓝萼甲素进行衍生化的步骤 5。
所述步骤 1 为提取步骤， 具体包括以下步骤 ：
步骤 1.1 ： 取香茶菜药材 ( 地上部分 ) 粉碎至 20 目～ 50 目 ；
步骤 1.2 ： 将所得的粉碎物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 ～ 1 ∶ 15 混合， 加热， 在 80℃～ 90℃温度条件下回流 1 ～ 2 小时， 提取、 过滤， 得到提取液和剩余物 ；
步骤 1.3 ： 将步骤 1.2 所得的剩余物与 95 ％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 ～ 1 ∶ 15 混合， 加热， 在 80℃～ 90℃温度条件下回流 1 ～ 2 小时， 提取、 过滤， 得到提取液和剩 余物， 重复该步骤 1 ～ 3 次 ；
步骤 1.4 ： 合并步骤 1.2 和 1.3 所得的提取液。
所述步骤 2 为溶剂处理步骤， 具体包括以下步骤 ：
步骤 2.1 ： 将步骤 1 所得的提取液加热， 在 55℃～ 65℃温度条件下加热减压浓缩， 回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物 ；
步骤 2.2 ： 将步骤 2.1 所得的初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 8 ～ 1 ∶ 10 混合， 在室温条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌 10 分钟， 随后静置 6 ～ 12 小时， 弃去上清液 得到下层固体 ；
步骤 2.3 ∶将步骤 2.2 所得的固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 25℃～ 35℃温度条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌溶解， 静置 1 ～ 3 小时， 过 滤得到滤液和不溶物 ；
步骤 2.4 ： 将步骤 2.3 所得的不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 25℃～ 35℃温度条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌溶解， 静置 1 ～ 3 小时， 过 滤得到滤液和不溶物， 重复该步骤 1 ～ 3 次 ；
步骤 2.5 ： 合并步骤 2.3 和 2.4 所得的滤液 ；
步骤 2.6 ： 将步骤 2.5 所得的滤液加热， 在 35℃～ 45℃温度条件下加热减压浓缩， 回收乙酸乙酯 (A.R.)， 得到固体浓缩物。
所述步骤 3 为树脂处理步骤， 具体包括以下步骤 ： 步骤 3.1 ： 将步骤 2 所得的固体浓缩物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合溶解， 得到溶液 ；
步骤 3.2 ： 将步骤 3.1 所得的溶液缓慢加到 7 号树脂柱中， 起观察树脂的颜色， 在 树脂柱有 2/3 变色时， 停止加样， 并采用 200ml ～ 400ml 的 95％乙醇 (A.R.) 冲洗该树脂柱， 收集所有流出液， 所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至 pH 值中 性；
步骤 3.3 ： 将步骤 3.2 所得流出液加热， 并在 55℃～ 65℃温度条件下加热减压回 流， 直至溶剂干， 得到固体残留物。
所述步骤 3 为重结晶步骤， 具体包括以下步骤 ：
步骤 4.1 ： 将上述残留物与 30℃～ 40℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混 合， 得到初级溶液， 加热， 在 30℃的～ 40℃温度条件下减压浓缩， 在 -23℃～ -13℃温度条件 下静置析晶， 过滤得到浅黄色针状结晶 ；
所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 2 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液 ；
步骤 4.2 ： 将步骤 4.1 所得的结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 -23℃～ -13℃温度条件下反复重结晶 2 ～ 4 次， 每次 12 ～ 24 小时， 得到中间产物蓝萼 甲素 ；
所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 4 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液。
所述步骤 5 为衍生化步骤， 具体包括以下步骤 ：
步骤 5.1 ： 在室温下， 将 9.06 ～ 11.06g 步骤 4 所得将蓝萼甲素溶于 25 ～ 35ml 四氢呋喃 (THF) 中， 随后加入 0.857 ～ 1.057g 丁二酸和 0.067 ～ 0.08794- 二甲氨基吡啶 (DMAP)， 在室温条件下搅拌反应 2 ～ 3 小时 ；
步骤 5.2 ： 将步骤 5.1 的反应溶液加热 30℃～ 40℃减压浓缩， 除去 THF， 随后加入
25 ～ 35ml 水稀释， 并采用 25 ～ 35ml 乙酸乙酯萃取 3 次， 合并有机相并采用饱和食盐水洗 涤、 无水硫酸钠干燥， 随后将所得溶液加热至 30℃～ 40℃减压浓缩至干， 得到蓝萼甲素的 丁二酸酯的粗产品 ；
步骤 5.3 ： 采用硅胶柱层析分离蓝萼甲素的丁二酸酯的粗产品， 所述洗脱液为体 积比为 1 ∶ 1 的石油醚 - 乙酸乙酯混合溶液， 采用 2 倍柱体积 (2BV) 的洗脱液冲洗层析柱， 然后将所述蓝萼甲素的丁二酸酯的粗产品用洗脱液完全溶解后加入柱子， 再采用 4BV 的洗 脱液冲洗层析柱， 收集合并含有目标成分的馏分， 将所得馏分加热至 30 ℃～ 40 ℃减压浓 缩， 除去溶剂， 得到蓝萼甲素的丁二酸酯的无色晶体 ；
步骤 5.4 ： 将所得蓝萼甲素的丁二酸酯溶于 15 ～ 20ml 四氢呋喃 (THF) 中， 在室温 下， 加入 0.5 ～ 0.6g 二氯乙烷 (EDC) 和 0.2 ～ 0.3gN- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)， 室温搅拌 8 ～ 10 小时 ；
步骤 5.5 ： 将所得反应溶液在 30 ℃～ 40 ℃条件下减压蒸馏， 除去 THF， 随后采用 15 ～ 20ml 二氯甲烷洗涤 3 次， 再用饱和食盐水洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥， 过滤并将所得 滤液在 30℃～ 40℃条件下减压蒸馏， 除去溶剂， 在室温条件下干燥， 得蓝萼甲素的丁二酸 酯与 NHS 的衍生物的无色晶体 ；
步骤 5.6 ： 在室温条件下， 将 55 ～ 65mg 步骤 5.5 的蓝萼甲素衍生物溶于 0.9 ～ 1.1mlTHF 溶液， 并将 58 ～ 68mg 环状八肽 溶于 4 ～6mlPBS 缓冲溶液， 随后将蓝萼甲素衍生物的 THF 溶液滴加到环状八肽的 PBS 溶液中， 室温条 件下搅拌反应 10 ～ 20 分钟 ；
步骤 5.7 ： 将步骤 5.6 的反应溶液在 30℃～ 40℃条件下减压蒸馏除去 THF， 随后过 滤并将所得滤液采用 1.5 ～ 2.5ml 水洗涤 3 次， 合并滤液， 并在 -45℃～ -35℃条件下冷冻 干燥 20 ～ 28 小时， 得到具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物。
经上述制备过程所得的具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物， 由于具有 α- 亚甲 基环戊酮结构和环状八肽片段， 故其对肿瘤细胞株具有良好的抑制作用及靶向作用， 可用 于治疗癌症， 特别用于治疗胃癌、 前列腺、 白血病、 鼻咽癌、 肝癌、 胰腺胆管癌、 卵巢癌、 乳腺 癌、 食管癌、 肺癌、 肾癌、 宫颈癌、 结肠癌。
本发明同时公开了所述具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物在治疗癌症中的应 用， 特别是在治疗胃癌、 前列腺、 白血病、 鼻咽癌、 肝癌、 胰腺胆管癌、 卵巢癌、 乳腺癌、 食管 癌、 肺癌、 肾癌、 宫颈癌、 结肠癌中的应用。 本发明所公开的前述任一结构的具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物可以采用 药剂学上的常规药物载体制成任何一种剂型， 包括但不限于片剂、 胶囊剂、 软胶剂、 喷雾剂、 凝胶剂、 凝胶吸入剂、 口服剂、 混悬剂、 冲剂、 贴剂、 软膏、 丸剂、 散剂、 注射剂、 输液剂、 冻干注 射剂、 脂质体注射剂、 靶向给药注射剂、 栓剂、 缓释制剂或控释制剂。
附图说明
图 1a 为蓝萼甲素与丁二酸的反应方程式。
图 1b 为蓝萼甲素的丁二酸酯与 N- 羟基琥珀酰亚胺的反应方程式。
图 2a 为蓝萼甲素的丁二酸酯与 NHS 的衍生物与 D 型环状八肽的反应方程式之一。图 2b 为蓝萼甲素的丁二酸酯与 NHS 的衍生物与 D 型环状八肽的反应方程式之二。 图 3a 为图 2a ～ 2b 示反应所得具有 D 型环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物的 HPLC 图 3b 为图 2a ～ 2b 示反应所得具有 D 型环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物的质谱 图 4a 为蓝萼甲素的丁二酸酯与 NHS 的衍生物与 L 型环状八肽的反应方程式之一。 图 4b 为蓝萼甲素的丁二酸酯与 NHS 的衍生物与 L 型环状八肽的反应方程式之二。 图 5a 为图 4a ～ 4b 示反应所得具有 L 型环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物的 HPLC 图 5b 为图 4a ～ 4b 示反应所得具有 L 型环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物的质谱图。
图。
图。
图。 具体实施方式
根据本发明的权利要求和发明内容所公开的内容， 本发明的技术方案具体如以下 实施例所述。
本发明所公开的制备方式是在四氢呋喃 (THF) 和 4- 二甲氨基吡啶 (DMAP) 存在 的条件下， 将经提取处理后的蓝萼甲素与丁二酸反应， 随后在四氢呋喃 (THF) 和二氯乙烷 (EDC) 存在的条件下将得到的蓝萼甲素的丁二酸酯与 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 反应得到中 间产物， 最后在四氢呋喃 (THF) 和磷酸盐缓冲液 (PBS 缓冲液 ) 存在的条件下， 将所得中间 产物与环状八肽进行衍生化反应， 从而制备得到本发明所公开的具有环状八肽结构的蓝萼 甲素衍生物， 该制备过程主要包括蓝萼甲素的制备以及取代基的衍生化。以下实施例所述 制备过程， 所采用的各种化学试剂如无特别标注， 则为分析纯。
实施例 1 ： 蓝萼甲素的制备
采用香茶菜药材 ( 地上部分 ) 作为原料， 通过提取、 溶剂处理、 树脂处理和重结晶 等步骤， 制备得到蓝萼甲素 (GLA)， 其具体过程如下 ：
步骤 1 为提取步骤， 其进一步包括 ：
步骤 1.1 ： 取香茶菜药材 ( 地上部分 ) 粉碎至 20 目～ 50 目 ；
步骤 1.2 ： 将所得的粉碎物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 ～ 1 ∶ 15 混合， 加热， 在 80℃～ 90℃温度条件下回流 1 ～ 2 小时， 提取、 过滤， 得到提取液和剩余物 ；
步骤 1.3 ： 将步骤 1.2 所得的剩余物与 95 ％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 5 ～ 1 ∶ 15 混合， 加热， 在 80℃～ 90℃温度条件下回流 1 ～ 2 小时， 提取、 过滤， 得到提取液和剩 余物， 重复该步骤 1 ～ 3 次 ；
步骤 1.4 ： 合并步骤 1.2 和 1.3 所得的提取液。
步骤 2 为溶剂处理步骤， 其进一步包括 ：
步骤 2.1 ： 将步骤 1 所得的提取液加热， 在 55℃～ 65℃温度条件下加热减压浓缩， 回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物 ；
步骤 2.2 ： 将步骤 2.1 所得的初级浓缩物与水按照体积比 1 ∶ 8 ～ 1 ∶ 10 混合， 在室温条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌 10 分钟， 随后静置 6 ～ 12 小时， 弃去上清液 得到下层固体 ；步骤 2.3 ： 将步骤 2.2 所得的固体与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 25℃～ 35℃温度条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌溶解， 静置 1 ～ 3 小时， 过 滤得到滤液和不溶物 ；
步骤 2.4 ： 将步骤 2.3 所得的不溶物与乙酸乙酯 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 25℃～ 35℃温度条件下以 60 ～ 120 转 / 分的速度搅拌溶解， 静置 1 ～ 3 小时， 过 滤得到滤液和不溶物， 重复该步骤 1 ～ 3 次 ；
步骤 2.5 ： 合并步骤 2.3 和 2.4 所得的滤液 ；
步骤 2.6 ： 将步骤 2.5 所得的滤液加热， 在 35℃～ 45℃温度条件下加热减压浓缩， 回收乙酸乙酯 (A.R.)， 得到固体浓缩物。
步骤 3 为树脂处理步骤， 其进一步包括 ：
步骤 3.1 ： 将步骤 2 所得的固体浓缩物与 95％乙醇 (A.R.) 按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合溶解， 得到溶液 ；
步骤 3.2 ： 将步骤 3.1 所得的溶液缓慢加到 7 号树脂柱中， 起观察树脂的颜色， 在 树脂柱有 2/3 变色时， 停止加样， 并采用 200ml ～ 400ml 的 95％乙醇 (A.R.) 冲洗该树脂柱， 收集所有流出液， 所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至 pH 值中 性； 步骤 3.3 ： 将步骤 3.2 所得流出液加热， 并在 55℃～ 65℃温度条件下加热减压回 流， 直至溶剂干， 得到固体残留物。
步骤 4 为重结晶步骤， 其进一步包括 ：
步骤 4.1 ： 将上述残留物与 30℃～ 40℃的极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混 合， 得到初级溶液， 加热， 在 30℃的～ 40℃温度条件下减压浓缩， 在 -23℃～ -13℃温度条件 下静置析晶， 过滤得到浅黄色针状结晶 ；
所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 2 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液 ；
步骤 4.2 ： 将步骤 4.1 所得的结晶与极性溶剂按照体积比 1 ∶ 4 ～ 1 ∶ 6 混合， 在 -23℃～ -13℃温度条件下反复重结晶 2 ～ 4 次， 每次 12 ～ 24 小时， 得到中间产物蓝萼 甲素 ；
所述极性溶剂为按照体积比 1 ∶ 1 ～ 1 ∶ 4 混合的氯仿 (A.R.) 和丙酮 (A.R.) 的 混合溶液。
通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。
实施例 2 ： 衍生化
按照图 1a ～ 1b 所示的反应方程式， 将实施例 1 所制备得到的蓝萼甲素， 采用丁二 酸和 NHS 进行衍生化， 得到中间产物， 随后按照图 2a ～ 2b 和图 4a ～ 4b 所示的反应方程
式， 将所得中间产物与环状八肽进行衍生化， 从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基， 得到具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物， 所述衍生化步骤 5 进一步包括 ：
步骤 5.1 ： 在室温下， 将 9.06 ～ 11.06g 步骤 4 所得将蓝萼甲素溶于 25 ～ 35ml 四氢呋喃 (THF) 中， 随后加入 0.857 ～ 1.057g 丁二酸和 0.067 ～ 0.08794- 二甲氨基吡啶(DMAP)， 在室温条件下搅拌反应 2 ～ 3 小时 ；
步骤 5.2 ： 将步骤 5.1 的反应溶液加热 30℃～ 40℃减压浓缩， 除去 THF， 随后加入 25 ～ 35ml 水稀释， 并采用 25 ～ 35ml 乙酸乙酯萃取 3 次， 合并有机相并采用饱和食盐水洗 涤、 无水硫酸钠干燥， 随后将所得溶液加热至 30℃～ 40℃减压浓缩至干， 得到蓝萼甲素的 丁二酸酯的粗产品 ；
步骤 5.3 ： 将蓝萼甲素的丁二酸酯的粗产品溶于洗脱液中， 并采用硅胶柱层析分 离， 将所得馏分加热至 30℃～ 40℃减压浓缩， 除去溶剂， 得到蓝萼甲素的丁二酸酯的无色 晶体 ；
步骤 5.4 ： 将所得蓝萼甲素的丁二酸酯溶于 15 ～ 20ml 四氢呋喃 (THF) 中， 在室温 下， 加入 0.5 ～ 0.6g 二氯乙烷 (EDC) 和 0.2 ～ 0.3gN- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS)， 室温搅拌 8 ～ 10 小时 ；
步骤 5.5 ： 将所得反应溶液在 30 ℃～ 40 ℃条件下减压蒸馏， 除去 THF， 随后采用 15 ～ 20ml 二氯甲烷洗涤 3 次， 再用饱和食盐水洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥， 过滤并将所得 滤液在 30℃～ 40℃条件下减压蒸馏， 除去溶剂， 在室温条件下干燥， 得蓝萼甲素的丁二酸 酯与 NHS 的衍生物的无色晶体 ；
步骤 5.6 ： 在室温条件下， 将 55 ～ 65mg 步骤 5.5 的蓝萼甲素衍生物溶于 0.9 ～ 溶于 4 ～1.1mlTHF 溶液， 并将 58 ～ 68mg 环状八肽6mlPBS 缓冲溶液， 随后将蓝萼甲素衍生物的 THF 溶液滴加到环状八肽的 PBS 溶液中， 室温条 件下搅拌反应 10 ～ 20 分钟 ；
所述 PBS 缓冲液为 0.2μmol/L 且其 pH ＝ 8.0 ；
步骤 5.7 ： 将步骤 5.6 的反应溶液在 30℃～ 40℃条件下减压蒸馏除去 THF， 随后过 滤并将所得滤液采用 1.5 ～ 2.5ml 水洗涤 3 次， 合并滤液， 并在 -45℃～ -35℃条件下冷冻 干燥 20 ～ 28 小时， 得到具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物。
实施例 3 ：
采用以下技术参数改进实施例 1。
步骤 1.1 中采用粉碎至 30 目的香茶菜药材 ( 地上部分 )。
步骤 1.2 和步骤 1.3 的重结晶过程中， 按照体积比 1 ∶ 8 混合所得粉碎物与 95％ 乙醇， 加热回流的温度为 83℃， 加热回流的时间为 1.7 小时。
重复步骤 1.3 的重结晶过程 2 次。
步骤 2.1 中， 加热减压浓缩的温度为 58℃。
步骤 2.2 中， 按照体积比 1 ∶ 9 混合初级浓缩物与水， 搅拌后静置的时间为 8 小时。
步骤 2.3 和 2.4 的重结晶过程中， 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合步骤 2.2 所得的固体 与乙酸乙酯， 溶解的温度为 15℃， 静置的时间为 2.5 小时。
重复步骤 2.4 的重结晶过程 2 次。
步骤 2.6 中， 加热减压浓缩的温度为 38℃。
步骤 3.1 中， 按照体积比 1 ∶ 4.5 将步骤 2 所得固体浓缩物溶解于 95％乙醇。
步骤 3.2 中， 采用 250ml 的 95％乙醇冲洗树脂柱。
步骤 3.3 中， 加热减压回流的温度为 58℃。步骤 4.1 中， 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合残留物与 33℃的极性溶剂， 所述极性溶剂为 体积比 1 ∶ 1.5 的氯仿 - 丙酮混合溶液， 所述加热减压浓缩的温度为 33℃， 静置析晶的温度 为 -18℃。
步骤 4.2 中， 按照体积比 1 ∶ 4.5 混合所得晶体与 33℃的极性溶剂， 所述极性溶剂 为体积比 1 ∶ 2 的氯仿 - 丙酮混合溶液， 所述加热减压浓缩的温度为 33℃， 静置析晶的温度 为 -18℃， 静置析晶的时间为 16 小时。
重复步骤 4.2 的重结晶过程 2 次。
通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。
实施例 4 ：
采用以下技术参数改进实施例 1。
步骤 1.1 中采用粉碎至 40 目的香茶菜药材 ( 地上部分 )。
步骤 1.2 和步骤 1.3 的重结晶过程中， 按照体积比 1 ∶ 12 混合所得粉碎物与 95％ 乙醇， 加热回流的温度为 87℃， 加热回流的时间为 1.3 小时。
重复步骤 1.3 的重结晶过程 2 次。
步骤 2.1 中， 加热减压浓缩的温度为 62℃。
步骤 2.2 中， 按照体积比 1 ∶ 9 混合初级浓缩物与水， 搅拌后静置的时间为 10 小 时。
步骤 2.3 和 2.4 的重结晶过程中， 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合步骤 2.2 所得的固体 与乙酸乙酯， 溶解的温度为 25℃， 静置的时间为 1.5 小时。
重复步骤 2.4 的重结晶过程 2 次。
步骤 2.6 中， 加热减压浓缩的温度为 42℃。
步骤 3.1 中， 按照体积比 1 ∶ 5.5 将步骤 2 所得固体浓缩物溶解于 95％乙醇。
步骤 3.2 中， 采用 350ml 的 95％乙醇冲洗树脂柱。
步骤 3.3 中， 加热减压回流的温度为 62℃。
步骤 4.1 中， 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合残留物与 37℃的极性溶剂， 所述极性溶剂为 体积比 1 ∶ 1.5 的氯仿 - 丙酮混合溶液， 所述加热减压浓缩的温度为 37℃， 静置析晶的温度 为 -18℃。
步骤 4.2 中， 按照体积比 1 ∶ 5.5 混合所得晶体与 37℃的极性溶剂， 所述极性溶剂 为体积比 1 ∶ 3 的氯仿 - 丙酮混合溶液， 所述加热减压浓缩的温度为 37℃， 静置析晶的温度 为 -18℃， 静置析晶的时间为 20 小时。
重复步骤 4.2 的重结晶过程 2 次。
通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。
实施例 5 ：
采用以下技术参数改进实施例 2。
步 骤 5.1 中， 各 物 质 用 量 为， 蓝 萼 甲 素 9.26g、 THF26ml、 丁 二 酸 0.877g、 DMAP0.069g。
步骤 5.2 中， 减压浓缩的温度为 31℃， 采用 26ml 水稀释， 采用 26ml 乙酸乙酯萃取， 随后减压浓缩至干的温度为 31℃。
步骤 5.3 中， 所得馏分减压浓缩的温度为 31℃。步骤 5.4 中， 各物质用量为， THF16ml、 EDC0.51g、 NHS0.21g， 搅拌 8.5 小时 ；
步骤 5.5 中， 减压蒸馏的温度为 31℃， 采用 16ml 二氯甲烷洗涤， 所得滤液减压蒸馏 的温度为 31℃。
步骤 5.6 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素衍生物 56mg、 THF0.92ml、 环状八肽 59mg、 PBS 缓冲溶液 4.5ml， 搅拌反应 11 分钟。
步骤 5.7 中， 减压蒸馏温度为 31℃， 采用 1.6ml 水洗涤， 所得滤液在 -44℃条件下 冷冻干燥 21 小时。
实施例 6 ：
采用以下技术参数改进实施例 2。
步 骤 5.1 中， 各 物 质 用 量 为， 蓝 萼 甲 素 9.66g、 THF25 ～ 35ml、 丁 二 酸 0.917g、 DMAP0.073g。
步骤 5.2 中， 减压浓缩的温度为 33℃， 采用 28ml 水稀释， 采用 28ml 乙酸乙酯萃取， 随后减压浓缩至干的温度为 33℃。
步骤 5.3 中， 所得馏分减压浓缩的温度为 33℃。
步骤 5.4 中， 各物质用量为， THF17ml、 EDC0.53g、 NHS0.23g， 室温搅拌 9 小时 ；
步骤 5.5 中， 减压蒸馏的温度为 33℃， 采用 17ml 二氯甲烷洗涤， 所得滤液减压蒸馏 的温度为 33℃。
步骤 5.6 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素衍生物 58mg、 THF0.96ml、 环状八肽 61mg、 PBS 缓冲溶液 5ml， 搅拌反应 13 分钟。
步骤 5.7 中， 减压蒸馏温度为 33℃， 采用 1.8ml 水洗涤， 所得滤液在 -42℃条件下 冷冻干燥 23 小时。
实施例 7 ：
采用以下技术参数改进实施例 2。
步 骤 5.1 中， 各 物 质 用 量 为， 蓝 萼 甲 素 10.06g、 THF30ml、 丁 二 酸 0.957g、 DMAP0.077g。
步骤 5.2 中， 减压浓缩的温度为 35℃， 采用 30ml 水稀释， 采用 30ml 乙酸乙酯萃取， 随后减压浓缩至干的温度为 35℃。
步骤 5.3 中， 所得馏分减压浓缩的温度为 35℃。
步骤 5.4 中， 各物质用量为， THF17.5ml、 EDC0.55g、 NHS0.25g， 室温搅拌 9 小时 ；
步骤 5.5 中， 减压蒸馏的温度为 35℃， 采用 17.5ml 二氯甲烷洗涤， 所得滤液减压蒸 馏的温度为 35℃。
步骤 5.6 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素衍生物 60mg、 THF1.00ml、 环状八肽 63mg、 PBS 缓冲溶液 5ml， 搅拌反应 15 分钟。
步骤 5.7 中， 减压蒸馏温度为 35℃， 采用 2.0ml 水洗涤， 所得滤液在 -40℃条件下 冷冻干燥 24 小时。
实施例 8 ：
采用以下技术参数改进实施例 2。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 10.46g、 THF25 ～ 35ml、 丁二酸 0.997g、 DMAP0.081g。步骤 5.2 中， 减压浓缩的温度为 37℃， 采用 32ml 水稀释， 采用 32ml 乙酸乙酯萃取， 随后减压浓缩至干的温度为 37℃。
步骤 5.3 中， 所得馏分减压浓缩的温度为 37℃。
步骤 5.4 中， 各物质用量为， THF18ml、 EDC0.57g、 NHS0.27g， 室温搅拌 9 小时 ；
步骤 5.5 中， 减压蒸馏的温度为 37℃， 采用 18ml 二氯甲烷洗涤， 所得滤液减压蒸馏 的温度为 37℃。
步骤 5.6 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素衍生物 62mg、 THF1.04ml、 环状八肽 65mg、 PBS 缓冲溶液 5ml， 搅拌反应 17 分钟。
步骤 5.7 中， 减压蒸馏温度为 37℃， 采用 2.2ml 水洗涤， 所得滤液在 -38℃条件下 冷冻干燥 25 小时。
实施例 9 ：
采用以下技术参数改进实施例 2。
步骤 5.1 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素 10.86g、 THF25 ～ 35ml、 丁二酸 1.037g、 DMAP0.083g。
步骤 5.2 中， 减压浓缩的温度为 39℃， 采用 34ml 水稀释， 采用 34ml 乙酸乙酯萃取， 随后减压浓缩至干的温度为 39℃。
步骤 5.3 中， 所得馏分减压浓缩的温度为 39℃。
步骤 5.4 中， 各物质用量为， THF19ml、 EDC0.59g、 NHS0.29g， 室温搅拌 9.5 小时 ；
步骤 5.5 中， 减压蒸馏的温度为 39℃， 采用 19ml 二氯甲烷洗涤， 所得滤液减压蒸馏 的温度为 39℃。
步骤 5.6 中， 各物质用量为， 蓝萼甲素衍生物 64mg、 THF1.08ml、 环状八肽 67mg、 PBS 缓冲溶液 5.5ml， 搅拌反应 19 分钟。
步骤 5.7 中， 减压蒸馏温度为 39℃， 采用 2.4ml 水洗涤， 所得滤液在 -36℃条件下 冷冻干燥 27 小时。
实施例 10 ：
技术参数分别同实施例 7 ～ 9， 只是各实施例中， 所采用的环状八肽为 D 型环状八 肽
实施例 11 ： 技术参数分别同实施例 7 ～ 9， 只是各实施例中， 所采用的环状八肽为 L 型环状八肽 实施例 12 ：
根据实施例 3 ～ 4 制备得到蓝萼甲素， 并将所得蓝萼甲素按照实施例 5 ～ 9 进行 衍生化， 特别是根据实施例 10， 制备得到具有 D 型环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物。
采用高效液相色谱 (HPLC) 和质谱检测上述蓝萼甲素衍生物结构， 所得 HPLC 谱图 和质谱图如图 3a 和 3b 所示。经 HPLC 和质谱检测表明， 上述蓝萼甲素衍生物结构如下。
实施例 13 ：
根据实施例 3 ～ 4 制备得到蓝萼甲素， 并将所得蓝萼甲素按照实施例 5 ～ 9 进行 衍生化， 特别是根据实施例 11， 制备得到具有 L 型环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物。
采用高效液相色谱 (HPLC) 和质谱检测上述蓝萼甲素衍生物结构， 所得 HPLC 谱图 和质谱图如图 5a 和 5b 所示。经 HPLC 和质谱检测表明， 上述蓝萼甲素衍生物结构如下。
实施例 14 ： 具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物制剂的制备
按照上述实施例制备得到具有实施例 12 和 13 的分子式结构的具有环状八肽结构 的蓝萼甲素衍生物。
将所得具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物， 采用药剂学上的常规药物载体， 并 采用药剂学上的常规制备方法， 制备成药剂学上的常规剂型， 包括但不限于片剂、 胶囊剂、 软胶剂、 喷雾剂、 凝胶剂、 凝胶吸入剂、 口服剂、 混悬剂、 冲剂、 贴剂、 软膏、 丸剂、 散剂、 注射 剂、 输液剂、 冻干注射剂、 脂质体注射剂、 靶向给药注射剂、 栓剂、 缓释制剂或控释制剂。
实施例 15 ： 具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物针对 SMMC-7721 人肝癌细胞、 HepG2 人肝癌细胞、 SW-1990 人胰腺胆管癌细胞、 HO-8910 人卵巢癌细胞、 K-562 肿瘤细胞、
KB 肿瘤细胞、 MCF-7 乳腺癌肿瘤细胞、 Eca-109 人食管癌肿瘤细胞、 A-549 肺癌肿瘤细胞、 肾 癌 A-498 肿瘤细胞、 宫颈癌 HeLa 肿瘤细胞、 人结肠癌 SW480 肿瘤细胞生长抑制作用的药效 学实验
1、 药物与试剂 ：
受试样品， F-12 培养基， 10 ％灭活胎牛血清 (FBS)， 二甲基亚砜 (DMSO)， 噻唑盐 (MTT)， 阿霉素 ( 阳性药 )
2、 仪器 ：
培养箱， 超静工作台， 多功能倒置显微镜， 离心机， 自动酶标仪， 96 孔培养板
3、 细胞株 ：
SMMC-7721 人肝癌细胞、 HepG2 人肝癌细胞、 SW-1990 人胰腺胆管癌、 HO-8910 人 卵巢癌细胞、 K-562 肿瘤细胞、 KB 肿瘤细胞、 MCF-7 肿瘤细胞、 Eca-109 人食管癌肿瘤细胞、 A-549 肺癌肿瘤细胞、 肾癌 A-498 肿瘤细胞、 宫颈癌 HeLa 肿瘤细胞、 人结肠癌 SW480 肿瘤细 胞
4、 样品配制 ：
取按照上述实施例制备得到的具有 D 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物、 具有 L 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物， 分别加入相应体积的二甲基亚砜 (DMSO) 溶解， 得 到浓度为约 50mg/ml 的药物溶液， 随后震荡溶解， 所得药物溶液可在 -20℃条件下储存 5、 实验方法 ：
将上述肿瘤细胞培养于含 10％ FBS 的 F-12 培养基中。取对数生长期的上述肿瘤 细胞， 按常规消化后进行细胞计数。细胞计数后调整细胞浓度为 1×104 并接种于 96 孔细 胞培养板上， 置于培养箱中培养 24 小时后加药。24 小时后对照组换培养液， 实验组加入不 同浓度的受试物， 于 48 小时后应用 MTT 法 (MTT 比色法、 噻唑蓝法 ) 比色检测细胞活力。每 孔中加入浓度为 5mg/ml 的 MTT( 噻唑蓝 )20μl， 培养 4 小时后吸去培养液， 加 DMSO150μl， 摇床振荡使蓝紫色沉淀颗粒完全溶解， 在酶标仪上 490nm 处测吸光度 (A) 值。
6、 实验结果 ：
具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物对 SMMC-7721 人肝癌细胞、 HepG2 人肝癌细 胞、 SW-1990 人胰腺胆管癌、 HO-8910 人卵巢癌细胞、 K-562 肿瘤细胞、 KB 肿瘤细胞、 MCF-7 肿瘤细胞、 Eca-109 人食管癌肿瘤细胞、 A-549 肺癌肿瘤细胞、 肾癌 A-498 肿瘤细胞、 宫颈癌 HeLa 肿瘤细胞、 人结肠癌 SW480 肿瘤细胞增殖的影响如下表所示
注： F1 表示具有 D 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物 ；
F2 表示具有 L 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物。
结果表明， 具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物能明显抑制 SMMC-7721 人肝癌细 胞、 HepG2 人肝癌细胞、 SW-1990 人胰腺胆管癌、 HO-8910 人卵巢癌细胞、 K-562 肿瘤细胞、 KB 肿瘤细胞、 MCF-7 肿瘤细胞、 Eca-109 人食管癌肿瘤细胞、 A-549 肺癌肿瘤细胞、 肾癌 A-498 肿瘤细胞、 宫颈癌 HeLa 肿瘤细胞、 人结肠癌 SW480 肿瘤细胞的生长， 此作用与助溶剂 DMSO 无关。
实施例 16 ： 具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物针对胃癌 AGS 细胞生长抑制作用 的药效学实验
1、 药物与试剂 ：
受试样品， F-12 培养基， 10 ％灭活胎牛血清 (FBS)， 二甲基亚砜 (DMSO)， 噻唑盐 (MTT)， 阿霉素 ( 阳性药 )
2、 仪器 ：
培养箱， 超静工作台， 多功能倒置显微镜， 离心机， 自动酶标仪， 96 孔培养板
3、 细胞株 ：
胃癌 AGS 细胞
4、 样品配制 ：
取按照上述实施例制备得到的具有 D 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物、 具有 L 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物， 分别加入相应体积的二甲基亚砜 (DMSO) 溶解， 得 到浓度为约 50mg/ml 的药物溶液， 随后震荡溶解， 所得药物溶液可在 -20℃条件下储存
5、 实验方法 ：
将上述肿瘤细胞培养于含 10％ FBS 的 F-12 培养基中。取对数生长期的上述肿瘤 细胞， 按常规消化后进行细胞计数。 细胞计数后调整细胞浓度为 1×104 并接种于 96 孔细胞 培养板上， 置于培养箱中培养 24 小时后加药。24 小时后对照组换培养液， 实验组加入不同 浓度的受试物， 于 48 小时后应用 MTT 法 (MTT 比色法、 噻唑蓝法 ) 比色检测细胞活力。每孔 中加入浓度为 5mg/ml 的 MTT( 噻唑蓝 )20μl， 培养 4 小时后吸去培养液， 加 DMSO 150μl， 摇床振荡使蓝紫色沉淀颗粒完全溶解， 在酶标仪上 490nm 处测吸光度 (A) 值。
6、 实验结果 ：
具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物对胃癌 AGS 细胞增殖的影响如下表所示
23101993474 A CN 101993477
说浓度 1μmol/ml 0.1μmol/ml 0.01μmol/ml明书18/21 页组别 空白对照 F1A 值 (490nm) 0.4420+0.0355 0.0121+0.0182 ＊＊△△ 0.0293+0.0190 ＊＊△△ 0.0590+0.0251 ＊＊△△ 0.0280+0.0188 ＊＊△△ 0.0402+0.0177 ＊＊△△ 0.0651+0.0204 ＊＊△△ 0.3723+0.0492 0.4417+0.0318 0.4070+0.0288抑制率 (％ )94.11 89.88 78.23 92.41 81.45 76.44 15.76 0.08 7.92F21μmol/ml 0.1μmol/ml 0.01μmol/mlDMSO 对照1μl/ml 0.1μl/ml 0.01l/ml＊ 注： 表示与空白对照组比较， P ＜ 0.05 ； ＊＊
表示与空白对照组比较， P ＜ 0.01 ；
△表示与相同浓度的 DMSO 对照组比较， P ＜ 0.05 ；
△△表示与相同浓度的 DMSO 对照组比较， P ＜ 0.01 ；
F1 表示具有 D 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物 ；
F2 表示具有 L 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物。
结果表明， 具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物能明显抑制胃癌 AGS 细胞的生 长， 此作用与助溶剂 DMSO 无关。
实施例 17 ： 具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物对激素依赖性人前列腺癌 LNCap 细胞增殖的影响
1、 药物与试剂 ：
受试样品， F-12 培养基， 10 ％灭活胎牛血清 (FBS)， 二甲基亚砜 (DMSO)， 噻唑盐 (MTT)， 阿霉素 ( 阳性药 )
2、 仪器 ：
培养箱， 超静工作台， 多功能倒置显微镜， 离心机， 自动酶标仪， 96 孔培养板
3、 细胞株 ：
胃癌 AGS 细胞
4、 样品配制 ：
取按照上述实施例制备得到的具有 D 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物、 具有
L 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物， 分别加入相应体积的二甲基亚砜 (DMSO) 溶解， 得 到浓度为约 50mg/ml 的药物溶液， 随后震荡溶解， 所得药物溶液可在 -20℃条件下储存
5、 实验方法 ：
复苏 LNCaP 细胞培养于含 10％ FBS 的 F-12 培养基中。生长 2-3 天后， 置生物显 微镜观察细胞贴壁生长情况。当细胞生长至铺满瓶底时， 吸净一次性 Celllbind 培养瓶中 的原培养液， 加入含 EDTA 的 0.25％胰蛋白酶进行消化， 将培养瓶放平， 盖好瓶盖， 镜下观察 消化情况。消化约 1 ～ 2 分钟后， 镜下观察细胞出现明显回缩， 细胞间隙变大， 脱离瓶壁时， 加入含 10％ FBS F-12 培养基终止消化。将液体吸转入 15ml 离心管中， 1500rpm 离心 5 分 钟。取出离心管， 吸弃上清， 再加入 10％ FBS F-12 培养基 1ml， 适力吹打均匀后， 细胞计数 5 后调整细胞浓度为 1×10 接种于 96 孔细胞培养板上， 置于培养箱中培养 48 小时后加药。 48 小时后对照组换培养液， 实验组加入不同浓度的受试物， 于 24 小时后应用 MTT 法比色 检测细胞活力。每孔中加入 5mg/ml 的 MTT( 噻唑蓝 )20μl， 培养 4 小时后吸去培养液， 加 DMSO150μl， 摇床振荡使蓝紫色沉淀颗粒完全溶解， 在酶标仪上 490nm 处测吸光度 (A) 值。
5、 阳性对照
取 一 片 比 卡 鲁 胺 片 ( 约 50mg)， 加 入 蒸 馏 水 120ml， 得 到 浓 度 为 0.42mg/ ml(1000μmol/L) 的溶液， 用 0.22μm 的微孔滤膜过滤， -20℃保存备用。
6、 实验结果 ：
具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物对激素依赖性人前列腺癌 LNCap 细胞增殖 的影响如下表所示
组别 空白对照 F1浓度 1μmol/ml 0.1μmol/ml 0.01μmol/mlA 值 (490nm) 1.4133±0.0433 0.0223+0.0182 ＊＊△△ 0.0341+0.0190 ＊＊△△ 0.0513+0.0251 ＊＊△△ 0.0042±0.0047 ＊＊△△ 0.1524±0.0576 ＊＊△△ 1.5590+-.0490 ＊ 1.2262+0.0178 ＊＊ 1.2785+0.2089 1.6083+0.0861 ＊抑制率 (％ )91.36 85.98 79.72 99.71 89.22 -10.31 13.24 9.54 -13.79F21μmol/ml 0.1μmol/ml 0.01μmol/mlDMSO 对照1μl/ml 0.1μl/ml 0.01l/ml＊ 注： 表示与空白对照组比较， P ＜ 0.05 ； ＊＊
表示与空白对照组比较， P ＜ 0.01 ；
△表示与相同浓度的 DMSO 对照组比较， P ＜ 0.05 ；
△△表示与相同浓度的 DMSO 对照组比较， P ＜ 0.01 ；
F1 表示具有 D 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物 ；
F2 表示具有 L 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物。
结果表明， 具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物能明显抑制人激素依赖性前列腺 癌 LNCaP 细胞的增殖， 此作用与助溶剂 DMSO 无关。
实施例 18 ： 具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物对 HL-60 肿瘤细胞株的生长抑制 作用
1、 药物与试剂 ：
受试样品， F-12 培养基， 10 ％灭活胎牛血清 (FBS)， 二甲基亚砜 (DMSO)， 噻唑盐 (MTT)， 阿霉素 ( 阳性药 )
2、 仪器 ：
培养箱， 超静工作台， 多功能倒置显微镜， 离心机， 自动酶标仪， 96 孔培养板
3、 细胞株 ：
HL-60 肿瘤细胞
4、 样品配制 ：
取按照上述实施例制备得到的具有 D 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物、 具有 L 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物， 分别加入相应体积的二甲基亚砜 (DMSO) 溶解， 得 到浓度为约 50mg/ml 的药物溶液， 随后震荡溶解， 所得药物溶液可在 -20℃条件下储存
5、 实验方法 ：
将上述肿瘤细胞培养于含 10％ FBS 的 F-12 培养基中。取对数生长期的上述肿瘤 细胞， 按常规消化后进行细胞计数。细胞计数后调整细胞浓度为 1×104 并接种于 96 孔细 胞培养板上， 置于培养箱中培养 24 小时后加药。24 小时后对照组换培养液， 实验组加入不 同浓度的受试物， 于 48 小时后应用 MTT 法 (MTT 比色法、 噻唑蓝法 ) 比色检测细胞活力。每 孔中加入浓度为 5mg/ml 的 MTT( 噻唑蓝 )20μl， 培养 4 小时后吸去培养液， 加 DMSO150μl， 摇床振荡使蓝紫色沉淀颗粒完全溶解， 在酶标仪上 490nm 处测吸光度 (A) 值。
5、 实验结果 ：
具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物对 HL-60 肿瘤细胞生长抑制作用如下表所 示
26101993474 A CN 101993477说浓度 1μmol/ml 0.1μmol/ml 0.01μmol/ml明书21/21 页组别 空白对照 A3A 值 (490nm) 1.4206±0.0419 0.0187+0.0182 ＊＊△△ 0.0417+0.0190 ＊＊△△ 1.1609+0.0251 ＊＊△△ 0.0151±0.0039 ＊＊△△ 0.0478±0.0412 ＊＊△△ 1.3904+-0.460 ＊ 1.3098+0.0178 ＊＊ 1.3241+0.2089 1.6083+0.0861 ＊抑制率 (％ )94.38 76.42 18.66 95.32 72.44 -8.49 10.24 9.54 -13.79A41μmol/ml 0.1μmol/ml 0.01μmol/mlDMSO 对照1μl/ml 0.1μl/ml 0.01l/ml＊ 注： 表示与空白对照组比较， P ＜ 0.05 ； ＊＊
表示与空白对照组比较， P ＜ 0.01 ；
△表示与相同浓度的 DMSO 对照组比较， P ＜ 0.05 ；
△△表示与相同浓度的 DMSO 对照组比较， P ＜ 0.01 ；
F1 表示具有 D 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物 ；
F2 表示具有 L 型环状八肽取代基的蓝萼甲素衍生物。
结果表明， 具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物能明显抑制 HL-60 肿瘤细胞的增 殖， 此作用与助溶剂 DMSO 无关。
实施例 19 ： 具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物制剂的应用
根据实施例 15 ～ 18， 按照上述实施例制备得到具有实施例 12 ～ 13 的分子式结构 的具有环状八肽结构的蓝萼甲素衍生物， 用于癌症的治疗， 特别是在治疗胃癌、 前列腺、 白 血病、 鼻咽癌、 肝癌、 胰腺胆管癌、 卵巢癌、 乳腺癌、 食管癌、 肺癌、 肾癌、 宫颈癌、 结肠癌中的 应用。
上述内容为本发明的具体实施例的例举， 对于其中未详尽描述的试剂、 设备、 操作 方法等， 应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、 设备、 操作方法等来予以实施。
同时本发明上述实施例仅为说明本发明技术方案之用， 仅为本发明技术方案的列 举， 并不用于限制本发明的技术方案及其保护范围。 采用等同技术手段、 等同试剂等对本发 明权利要求书及说明书所公开的技术方案的改进应当认为是没有超出本发明权利要求书 及说明书所公开的范围。