一种太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104017863 A (43)申请公布日 2014.09.03 CN 104017863 A (21)申请号 201410206387.6 (22)申请日 2014.05.15 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 贵阳中医学院 地址 550002 贵州省贵阳市南明区市东路 50 号 申请人 贵州三泓药业股份有限公司 (72)发明人 周涛 赵丹 江维克 袁媛 肖承鸿 (74)专利代理机构 北京联创佳为专利事务所 ( 普通合伙 ) 11362 代理人 郭防 (54) 发明名称 一种太子参药材或原植物的快速分子鉴别。

2、方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种太子参药材或原植物的快 速分子鉴别方法， 包括以下步骤 ： 利用由序列表 中序列 1 所示序列设计合成的序列如序列表中序 列 2 和序列表中序列 3 所示的引物对鉴别样品进 行 PCR 反应 ； PCR 产物的检测 ： PCR 反应产物中加 入 SYBR Green I 核酸荧光染料， 混匀后在紫外光 下观察， PCR 反应产物产生绿色荧光的样品即为 太子参药材或原植物， PCR 反应产物未产生绿色 荧光的样品即为其它植物材料。本发明可根据太 子参药材或原植物的特异性 DNA 片段 ( 其序列如 序列表中序列 1 所示 ) 设计得到的一组引物 ( 其 序。

3、列如序列表中序列 2 和序列表中序列 3 所示 ) 快速、 准确的鉴别出太子参药材或原植物， 该方法 重现性好， 效果明显。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 14 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书14页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104017863 A CN 104017863 A 1/1 页 2 1. 太子参药材或原植物快速分子鉴别的特异性 DNA 片段， 其序列如序列表中序列 1 所 示。 2. 太子参药材或原植物快速分子鉴别的一组引物， 该组引物由序列表中序列 1 所示序 列设计合成， 其序。

4、列如序列表中序列 2 和序列 3 所示。 3. 权利要求 2 所述的引物在太子参药材或原植物的快速分子鉴别中的应用。 4. 包括权利要求 2 所述引物的试剂盒。 5. 太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 利用序列 为序列 2 和序列 3 所示的引物对鉴别样品进行 PCR 反应 ； PCR 反应产物中加入 SYBR Green I 核酸荧光染料， 混匀后在紫外光下观察， PCR 反应产物产生绿色荧光的样品即为太子参药 材或原植物， PCR 反应产物未产生绿色荧光的样品即为其它植物材料。 6. 根据权利要求 5 所述的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法， 其特。

5、征在于， 所 述的对鉴别样品进行 PCR 反应包括 ： 提取鉴别样品的基因组 DNA， 用该基因组 DNA 作为模 板， 利用序列为序列 2 和序列 3 所示的引物进行 PCR 反应。 7. 根据权利要求 6 所述的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法， 其特征在于， 所 述的提取鉴别样品的基因组 DNA 具体包括以下步骤 ： 取鉴别样品 1 5mg， 用植物 DNA 提取 试剂盒、 CTAB 提取法或碱裂解法提取基因组 DNA。 8. 根据权利要求 5 7 任一所述的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法， 其特征 在于， 所述的PCR反应体系为25L， 反应液组成为 ： Taq酶预混液513。

6、L， 上游和下游引 物各为1025pmol， DNA模板20150ng， 灭菌重蒸水加至25L ； 反应程序为 ： 9396 预变性 1 5min， 93 96变性 5 30s， 52 64退火延伸 15 40s， 变性、 退火延伸共 进行 30 40 次循环 ； 最后 71 73后延伸 1 5min ； PCR 产物的检测 ： PCR 反应产物中 加入 1 5L100SYBR Green I 核酸荧光染料， 混匀后在 300 400nm 紫外光下观察。 9. 根据权利要求 8 所述的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法， 其特征在于， 所 述的 PCR 反应体系为 25L， 反应液组成为 ：。

7、 Taq 酶预混液 5.5 7L， 上游和下游引物各 为 10 15pmol， DNA 模板 20 100ng， 灭菌重蒸水加至 25L ； 反应程序为 ： 94 95预 变性 1 2min， 94 95变性 5 8s， 56 62退火延伸 15 20s， 变性、 退火延伸共进 行 30 35 次循环 ； 最后 72 73后延伸 1 2min ； PCR 产物的检测 ： PCR 反应产物中加 入 1 2L100SYBR Green I 核酸荧光染料， 混匀后在 340 380nm 紫外光下观察。 10. 根据权利要求 9 所述的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法， 其特征在于， 所述的 PC。

8、R 反应体系为 25L， 反应液组成为 ： Taq 酶预混液 5.5L， 上游和下游引物各为 10pmol， DNA模板2080ng， 灭菌重蒸水加至25L ； 反应程序为 ： 95预变性1min， 95变 性 5s， 56退火延伸 15s， 变性、 退火延伸共进行 30 次循环 ； 最后 72后延伸 1min ； PCR 产 物的检测 ： PCR 反应产物中加入 1L100SYBR Green I 核酸荧光染料， 混匀后在 365nm 紫 外光下观察。 权 利 要 求 书 CN 104017863 A 2 1/14 页 3 一种太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法 技术领域 0001 本发明。

9、涉及一种中药材或原植物的真伪鉴别方法， 尤其是一种太子参药材或原植 物的快速分子鉴别方法。 背景技术 0002 太子参， 石竹科植物孩儿参 Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm 的干燥块根， 具有益气健脾、 生津润肺的功效， 用于脾虚体倦、 食欲不振、 病后虚弱、 气阴不足、 肺燥干咳等症的治疗。作为药食两用品种， 太子参近年来得到了广泛的开发与 利用。同时为牟取私利， 市场上出现了以淡竹叶 Lophatherum gracile.、 繁缕 Stellaria media、 宝铎草 Disporum sessile、 直立百。

10、部 Stemona sessilifolia、 百部 S.japonica、 对叶 百部 S.tuberosa、 禾叶山麦冬 Liriope graminifolia、 阔叶山麦冬 L.spicata、 矮小山麦冬 L.minor植物的根或块根冒充太子参销售的现象， 严重危害了消费者的健康。 因此对太子参 药材或原植物进行鉴别就显得尤为重要。 0003 传统的太子参鉴别主要依靠性状鉴定、 显微鉴定、 理化鉴定。 但太子参伪品外形与 正品外形较为相似， 容易混淆， 特别是加工粉碎后， 药材饮片特征消失、 细胞差别不明显、 理 化反应繁锁等等， 一般人难以区分， 因此上述鉴别方法均难以真正达到鉴别。

11、的目的， 针对这 种粉末类的、 传统鉴定方法难以准确判定的易混药材、 掺伪药材， 建立一种操作简捷、 结果 准确可靠的新型鉴定方法具有重要的现实价值和实践意义。 0004 DNA 分子鉴定方法是一种新型的鉴别方法， 其根据基因组序列进行比较研究， 在很 大程度上弥补和克服了传统鉴定的缺陷和难题。一般进行 DNA 分子鉴定的流程是这样的 ： 根据正品、 伪品药材特定区域的 DNA 序列 ( 即特异性 DNA 片段 )， 设计有高度特异性的正品 鉴别引物， 利用鉴别引物对所提取样品的 DNA 进行 PCR 扩增， 经凝胶电泳检测鉴别样品真 伪。但是目前由于确定太子参药材或其原植物的特异性 DNA 。

12、片段存在困难， 无法根据特异 性 DNA 片段来设计正品鉴别引物， 因而并不能采用分子鉴别的方法来快速鉴别太子参药材 或其原植物。此外， DNA 分子鉴定方法中采用凝胶电泳检测的方法进行鉴别， 不仅电泳过程 繁琐、 耗时， 而且电泳所用的溴化乙锭 (EB) 试剂污染环境、 危害人体的健康。因此探讨一种 更安全、 更灵敏的分子标记检测方法将有助于特异性 PCR 鉴定技术的推广及大规模样品的 鉴定。 发明内容 0005 本发明的目的之一是提供可快速、 准确的鉴别太子参药材或原植物的一段特异性 DNA 片段及一组引物 ； 0006 本发明的另外一个目的是提供一种太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法。。

13、 0007 为解决上述技术问题， 本发明采用如下的技术方案 ： 太子参药材或原植物快速分 子鉴别的特异性 DNA 片段， 其序列如序列表中序列 1 所示。序列表中序列 1 为太子参药材 或原植物的 rDNA-ITS2 核苷酸序列的一个片段。 说 明 书 CN 104017863 A 3 2/14 页 4 0008 太子参药材或原植物快速分子鉴别的一组引物， 该组引物由序列表中序列 1 所示 序列设计合成， 其序列如序列表中序列 2 和序列 3 所示。 0009 权利要求 2 所述的引物在太子参药材或原植物的快速分子鉴别中的应用。 0010 包括权利要求 2 所述引物的试剂盒。 0011 太子参。

14、药材或原植物的快速分子鉴别方法， 包括以下步骤 ： 利用序列为序列 2 和 序列3所示的引物对鉴别样品进行PCR反应 ； PCR反应产物中加入SYBR Green I核酸荧光染 料， 混匀后在紫外光下观察， PCR 反应产物产生绿色荧光的样品即为太子参药材或原植物， PCR 反应产物未产生绿色荧光的样品即为其它植物材料。 0012 优选的， 所述的对鉴别样品进行 PCR 反应包括 ： 提取鉴别样品的基因组 DNA， 用该 基因组 DNA 作为模板， 利用序列为序列 2 和序列 3 所示的引物进行 PCR 反应。 0013 更优选的， 所述的提取鉴别样品的基因组DNA具体包括以下步骤 ： 取鉴别。

15、样品1 5mg， 用植物 DNA 提取试剂盒、 CTAB 提取法或碱裂解法提取基因组 DNA。 0014 前述的太子参药材或原植物的快速分子鉴别方法中， 所述的 PCR 反应体系为 25L， 反应液组成为 ： Taq 酶预混液 5 13L， 上游和下游引物各为 10 25pmol， DNA 模 板20150ng， 灭菌重蒸水加至25L ； 反应程序为 ： 9396预变性15min， 9396 变性 5 30s， 52 64退火延伸 15 40s， 变性、 退火延伸共进行 30 40 次循环 ； 最后 7173后延伸15min ； PCR产物的检测 ： PCR反应产物中加入15L100SYBR 。

16、Green I 核酸荧光染料， 混匀后在 300 400nm 紫外光下观察。 0015 优选的， 所述的 PCR 反应体系为 25L， 反应液组成为 ： Taq 酶预混液 5.5 7L， 上游和下游引物各为 10 15pmol， DNA 模板 20 100ng， 灭菌重蒸水加至 25L ； 反应程 序为 ： 94 95预变性 1 2min， 94 95变性 5 8s， 56 62退火延伸 15 20s， 变性、 退火延伸共进行 30 35 次循环 ； 最后 72 73后延伸 1 2min ； PCR 产物的检测 ： PCR 反应产物中加入 1 2L100SYBR Green I 核酸荧光染料，。

17、 混匀后在 340 380nm 紫 外光下观察。 0016 更优选的， 所述的 PCR 反应体系为 25L， 反应液组成为 ： Taq 酶预混液 5.5L， 上 游和下游引物各为 10pmol， DNA 模板 20 80ng， 灭菌重蒸水加至 25L ； 反应程序为 ： 95 预变性 1min， 95变性 5s， 56退火延伸 15s， 变性、 退火延伸共进行 30 次循环 ； 最后 72 后延伸1min ； PCR产物的检测 ： PCR反应产物中加入1L100SYBR Green I核酸荧光染料， 混匀后在 365nm 紫外光下观察。 0017 发明人进行了一系列实验， 以选择本发明提供的太。

18、子参药材或原植物的快速分子 鉴别方法的鉴别条件等， 证明本发明鉴别方法的有效性。具体如下 ： 0018 一、 序列的获取与比对 0019 在 NCBI( 美国国立生物技术信息中心， National Center for Biotechnology Information) 下载到太子参、 阔叶山麦冬、 繁缕等的物种 rDNA-ITS2 片段， 共计 25 条 序 列， 登 录 号 分 别 为 JF830349.1、 EF197887.1、 EF197886.1、 EF197885.1、 EF197884.1、 EF197883.1、 EF197882.1、 EF197881.1、 EF197。

19、880.1、 EF197879.1、 FJ384025.1、 AY849797.1、 JF327839.1、 JF327838.1、 JF327840.1、 JF327841.1、 AB721393.1、 KC439470.1、 EU930852.1、 EU930853.1、 EU930854.1、 JN589063.1、 EU785985.1、 L78051.1、 AY936245.1。发明人运用 Clustal X2.1 软件对这些序列进行排序、 比对、 分析后发现 ： rDNA-ITS2 序列能较好地反映 说 明 书 CN 104017863 A 4 3/14 页 5 出太子参及其混伪品。

20、之间的种间差异， 基于该差异， 发明人进一步设计获得了具有稳定差 异的太子参特异性 DNA 片段， 其序列如序列表中序列 1 所示。 0020 二、 引物的设计与筛选 0021 运用Premier Primer5.0软件对上述太子参特异性DNA片段进行引物设计， 调整参 数使上游引物在太子参的特异性片段内， 长度在100500bp， 共设计了3组引物， 分别命名 为 Tzs-1F/Tzs-1R、 Tzs-2F/Tzs-2R、 Tzs-3F/Tzs-3R， 各引物序列见表 1。由上海生工生物科 技有限公司合成。 0022 根据引物序列 Tzs-1F/Tzs-1R、 Tzs-2F/Tzs-2R、 。

21、Tzs-3F/Tzs-3R 的 Tm 值 (DNA 熔解 温度 ) 及扩增产物的长度， 预先设置了特异性 PCR 扩增体系与扩增程序验证此 3 组引物的 特异性。其体系及扩增程序见表 1。取 6L PCR 扩增产物加入含 EB 的 1.0琼脂糖凝胶 中， 80V 稳定电压电泳 1h， 紫外凝胶成像系统观察， 拍照保存。结果如图 5 所示。 0023 表 1 引物及 PCR 反应条件 0024 0025 0026 图 5 为引物筛选电泳图 (M ： Marker， 1 10 ： 太子参、 繁缕、 繁缕、 太子参、 直立百 部、 阔叶山麦冬、 宝铎草、 阔叶山麦冬、 宝铎草、 太子参， 其中 1 。

22、2 为引物 Tzs-1F/Tzs-1R 扩 增， 3 6 为引物 Tzs-2F/Tzs-2R 扩增， 7 10 为引物 Tzs-3F/Tzs-3R 扩增 ) ； 0027 图5显示3对由Premier Primer 5.0软件设计所得的太子参鉴定引物中， Tzs-2F/ Tzs-2R(即引物序列表中序列2和序列表中序列3)的PCR扩增特异性较另外2组引物要好， 故本发明优选该组引物作为太子参与伪品药材的分子鉴定引物， 以之进行下述扩增反应条 件的优化。 0028 三、 太子参药材或原植物的快速分子鉴别条件考察 0029 (1) 待测样品基因组 DNA 的提取与检测 0030 取待检样品 1 5。

23、mg， 采用植物 DNA 提取试剂盒、 CTAB 提取法或碱裂解法提取基 因组 DNA ； 0031 使用 rDNA-ITS2 的通用引物 ITS2F/ITS3R( 即序列表中序列 4 和序列表中序列 5) 扩增上述 DNA。其扩增体系及扩增程序见表 2。取 5L PCR 扩增产物加入含 EB 的 1.0 琼脂糖凝胶中， 80V 稳定电压电泳 1h， 紫外凝胶成像系统观察， 拍照保存。结果如图 6 所示。 0032 表 2 通用引物 ITS2F/ITS3R 序列及其 PCR 反应条件 0033 说 明 书 CN 104017863 A 5 4/14 页 6 0034 图6为ITS2F/ITS3。

24、R扩增电泳图(M ： Marker， 19 ： 空白对照、 宝铎草、 繁缕、 百部、 矮小麦冬、 淡竹叶、 禾叶山麦冬、 阔叶山麦冬、 太子参 ) ； 0035 图6显示所有DNA模板均能有效扩增出目的条带， 表明模板DNA的ITS2片段完整， 其质量满足于后续研究。 0036 (2)PCR 扩增反应条件优化及检测 0037 以上述 (1) 所得 DNA 为模板， 根据序列表中序列 2 和序列表中序列 3 的 Tm 值及扩 增产物的长度设置 PCR 扩增条件， 其具体操作步骤如下 ： 0038 运用特异性引物序列表中序列 2 和序列表中序列 3， 扩增反应采用 25L 体系， 其组分为 ： T。

25、aq 酶预混液 13L， 20pmol 引物序列表中序列 2， 20pmol 引物序列表中序列 3， 60ng DNA 模板， 灭菌重蒸水加至 25L。 0039 扩增程序 ： 95预变性 1min ； 95变性 15s， 62退火延伸 30s， 变性、 退火延伸 循环 35 次 ； 72后延伸 1min。 0040 扩增产物的检测 ： 0041 电泳检测 ： 取 6L PCR 扩增产物加入含 EB 的 1.0琼脂糖凝胶中， 80V 稳定电 压电泳 50min， 紫外凝胶成像系统观察。 0042 荧光检测 ： 扩增产物经加入 5L100SRYB Green I 染色后紫外光下观察。 0043 。

26、扩增程序的优化 0044 i 退火延伸温度 ： 根据上述、 、 ， 考察了 48、 50、 52、 54、 56、 58、 60、 62、 64、 66、 68的退火延伸温度。 结果显示， 太子参样品在5264均能扩增 出目的条带， 而混伪品均未检测出， 荧光反应结果与电泳结果一致。 荧光的亮度随着退火延 伸温度的升高变亮， 而后又变暗， 在 56 62时绿色荧光的亮度强且差异不明显。为节约 能源， 本发明优选退火温度为 56。如图 7 为部分退火延伸温度的荧光检测图 (1 4 ： 太 子参、 宝铎草、 繁缕、 阔叶麦冬 )。 0045 ii 退火延伸时间 ： 基于上述退火温度的特征， 考察了。

27、退火延伸时间 5s、 10s、 15s、 20s。结果显示 ： 电泳检测在退火延伸时间 15s 时太子参能有效扩增， 荧光反应在退火延 伸时间 10s 时均有绿色荧光。为了保证 PCR 扩增产物的产量， 本发明优选 PCR 退火延伸 时间为 15s。图 8 所示为退火延伸时间优化的荧光检测图 ( 其中 1 4 ： 退火延伸 5s、 10s、 15s、 20s)。 0046 iii 变性时间 ： 基于上述中的、 ， 考察了变性时间 2s、 5s、 10s、 15s、 20s、 25s、 30s。结果显示， 在变性时间 5s 时， 太子参样品电泳出明亮清晰的目的条带， 荧光反应结 果与电泳结果一致。

28、。为节约扩增时间， 本发明确定最佳变性时间为 5s ； 说 明 书 CN 104017863 A 6 5/14 页 7 0047 iv 变性、 退火延伸循环次数 (n) ： 根据上述中的、 、 ， 考察了 25、 30、 35、 40、 45 次变性、 退火延伸循环次数， 结果显示在 n 30 时， 太子参样品能电泳出明亮清晰的目 的条带， 且荧光检测呈现绿色荧光。兼顾 PCR 扩增产物产量与时间， 本发明优选循环次数为 30 次 ； 图 9 为变性、 退火延伸的循环次数优化的电泳检测及相应的荧光检测图 ( 其中， M ： Marker， 1 5 ： 25、 30、 35、 40、 45 次 。

29、)。 0048 v 基于上述中的、 、 、 ， 太子参药材或原植物的快速分子鉴别的扩增程序 最终优选为 ： 0049 0050 PCR 扩增体系组成的优化 0051 根据上述确定的扩增程序， 对 PCR 扩增体系的组成进行以下优化 ： 0052 i Taq 酶预混液用量 ： 在扩增体系 (25L) 中 Taq 酶预混液用量分别为 3.5L、 4.5L、 5.5L、 6.5L、 7.5L。结果显示 Taq 酶预混液用量在 5.5L 时， 太子参样 品出现绿色荧光， 电泳结果与荧光检测结果一致， 即电泳出目的条带。为节约鉴别成本， 本 发明优选 PCR 反应体系中 Taq 酶预混液的用量为 5.5。

30、L ； 图 10 为 Taq 酶预混液用量优化 的泳检测及相应的荧光检测图 ( 其中， M ： Marker， 1 5 ： 3.5L、 4.5L、 5.5L、 6.5L、 7.5L)。 0053 ii 引物用量 ： 根据上述中的， 考察了 25L 扩增体系中引物序列表中序列 2、 序列表中序列 3 的含量为 5pmol、 10pmol、 15pmol。结果显示 ： 序列表中序列 2 和序列表中 序列 3 含量 10pmol 时， 太子参样品扩增出清晰明亮的目的条带， 荧光检测时有绿色荧光 产生。为节约引物， 本发明优选引物用量为 10pmol。图 11 为引物用量优化的电泳检测及相 应的荧光检。

31、测图 (M ： Marker， 1 3 ： 5pmol、 10pmol、 15pmol)。 0054 iii模板DNA用量 ： 在中的、 的基础上， 分别对10ng、 20ng、 40ng、 60ng、 80ng、 100ng、 200ng、 300ng 模板 DNA 的用量进行考察。结果显示 ： 用量在 10 300ng 时， 荧光检 测太子参样品产生绿色荧光， 电泳检测均能太子参样品扩增出明亮清晰的目的条带， 但模 板用量在300ng时条带弥散。 兼顾模板DNA用量及扩增效果的选择性， 本发明优选模板DNA 用量为 20ng 80ng。图 12 为部分模板 DNA 用量优化的电泳检测及相应。

32、的荧光检测图 ( 其 中， M ： Marker， 1 4 ： 20ng、 40ng、 60ng、 80ng) 0055 iv 根据上述中的、 、 ， 太子参药材或原植物的快速分子鉴别， 运用特异性 引物序列表中序列 2 和序列表中序列 3， 扩增反应采用 25L 体系， 其组分含量优选值为 ： 0056 说 明 书 CN 104017863 A 7 6/14 页 8 0057 0058 结果检测条件的优化 0059 根据上述、 确定的扩增程序与扩增体系， 对 PCR 扩增结果检测的条件进行以 下优化 ： 0060 i 基于上述考察中， 电泳结果与荧光检测结果总体趋势一致， 相互验证了结果的准。

33、 确性， 但电泳过程繁琐、 耗时， 且所用溴化乙锭 (EB) 试剂污染环境并危害人体健康。因此， 本发明确定仅用荧光反应对扩增产物进行检测。 0061 ii100SRYB Green I 的用量 ： 在扩增产物中加入 1L、 2L、 3L、 4L、 5L 的 100SRYB Green I， 紫外光下肉眼观察。结果显示 ： 1 5L 的 100SRYB Green I 均能与 太子参样品的扩增产物能产生绿色荧光。为节约核酸染料， 本发明选择 100SRYB Green I 的用量为 1L。 0062 iii 基 于 上 述 中 的 、 ， 进 行 扩 增 结 果 检 测 时， 在 扩 增 产 。

34、物 中 加 入 1L100SRYBGreen I， 在紫外光下肉眼观察是否有绿色荧光产生， 出现绿色荧光， 则为太 子参药材或原植物 ； 无绿色荧光出现， 则为非太子参。 0063 四、 重现性考察 ： 0064 根据上述三中优选出的扩增条件， 对其确定的方法进行重现性考察， 具体操作如 下 ： 0065 i 分别使用 Mastercycler( 德国， Eppendof)、 Applied Biosystems VeritiTM96( 美 国， ABI)、 GeneAmp PCR system9700( 美国， ABI) 三台不同厂家和型号的 PCR 仪， 考察仪器对 PCR 反应稳定性的影。

35、响 ； 0066 ii 运用 2Power Taq PCR MasterMix( 北京百泰克生物技术有限公司 )、 2Taq PCRMaster Mix(北京天根生化科技有限公司)、 Premix Ex TaqTM Version2.0(宝生物工程大 连有限公司 ) 三种 Taq 酶预混液进行扩增， 考察不同厂家酶对 PCR 反应重现性的影响 ； 0067 iii 使用分别由上海生工生物科技有限公司、 北京博迈德生物有限公司合成的 2 个批次的引物， 考察不同厂家合成引物对 PCR 反应重现性的影响 ； 0068 iv 采用上述的、 、 中的条件进行试验， 结果显示 ： 采用三台不同厂家型号的。

36、 PCR 仪及不同厂家的 Taq 酶预混液进行扩增， 均能有效扩增出目的片段 ( 如图 13、 图 14 所 示， 图 13 中， 1 3 分别为 ： Mastercycler、 Applied Biosystems、 GeneAmp PCR system9700， 图14中， 1-11-2为 ： 2Power Taq PCR Master Mix， 2-12-2为 ： 2Taq PCR MasterMix， 3-1 3-2 为 ： Premix Ex TaqTM Version2.0)， 而不同批次的引物对 PCR 扩增结果也无明显 差异 ( 如图 15 所示 ： 1 4、 5 8 为上海生。

37、工生物科技有限公司、 北京博迈德生物有限公 司合成 2 个批次引物， 1、 5 ： 太子参， 2、 6 ： 宝铎草， 3、 7 ： 繁缕， 4、 8 ： 阔叶麦冬 )。因此， 本发明 的太子参药材或原植物的鉴别方法重现性较好， 可用于太子参药材或原植物的快速分子鉴 说 明 书 CN 104017863 A 8 7/14 页 9 定。 0069 五、 方法有效性考察 0070 为了验证本发明的快速分子鉴别方法可有效鉴别出太子参药材或原植物， 发明人 还进行了一系列的试验研究， 具体如下 ： 0071 实验例 1 0072 (1) 材料、 试剂与仪器 0073 a) 材料 0074 太子参药材分别。

38、购于贵州施秉、 安徽宣城、 江苏句容、 福建柘荣、 山东临沂等地， 共 37份样本。 另收集到太子参伪品共41份， 分别为宝铎草、 繁缕、 直立百部、 蔓生百部、 对叶百 部、 阔叶山麦冬、 禾叶山麦冬、 矮小山麦冬， 均为块根 ( 见表 3)。所有药材样品均经专家鉴 定。 0075 表 3 样品来源表 0076 0077 0078 b) 试剂 说 明 书 CN 104017863 A 9 8/14 页 10 0079 琼 脂 糖 ( 西 班 牙 Biowest agarose)、 D2000( 北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司 )、 10000SYBR Green I 核酸染料 (。

39、 北京索莱宝科技有限公司 )、 2Power Taq PCR Master Mix( 北京百泰克生物技术有限公司 )、 EB( 北京天根生化科技有限公司 )、 2Taq PCR Master Mix( 北京天根生化科技有限公司 )、 Premix Ex TaqTM Version2.0( 宝生物工程大连 有限公司 )、 其他试剂均为分析纯。 0080 c) 仪器 0081 PCR仪(Mastercycler， 德国Eppendof)、 凝胶成像系统(GGM/D2， 英国SYNGENE)、 电 脑三恒多用电泳仪(DYY-12， 北京六一仪器厂)、 自动蒸汽灭菌锅(ES-315， 日本Tomy)、。

40、 低温 高速冷冻离心机 (Centrifuge5810R， 德国 Eppendof)、 三用紫外仪 (ZF-2， 上海市安亭电子 仪器厂 )。 0082 (2) 基因组 DNA 提取 ： 取待检样品 1 5mg， 采用碱裂解法提取各药材样品总基因 组DNA ； 使用rDNA-ITS2通用引物序列表中序列4和序列表中序列5扩增上述基因组DNA以 验证模板 DNA-ITS2 片段的完整性， DNA 样品保存于 -20冰箱。 0083 (3) 特异性 PCR 扩增 ： 0084 运用如序列表中序列 2 和序列 3 所示的特异性引物， 扩增反应采用 25L 体系， 其 组分为 ： 0085 0086 。

41、扩增程序 ： 0087 0088 0089 (4) 结果的检测 ： 0090 在扩增产物中加入15L100SYBR Green I核酸荧光染料， 混匀后在紫外光下 观察， 太子参药材或原植物呈现绿色荧光， 而其他非太子参样品则没有绿色荧光出现。 如图 4 所示。 0091 实验例 2 0092 (1) 材料、 试剂与仪器 说 明 书 CN 104017863 A 10 9/14 页 11 0093 同实验例 1 ； 0094 (2) 基因组 DNA 提取 ： 取待检样品 1 5mg， 用植物 DNA 提取试剂盒、 CTAB 提取法、 碱裂解法或其他方法提取基因组 DNA， 并进行检测， 确认已。

42、提取获得 ； 0095 (3) 特异性 PCR 扩增 ： 0096 运用如序列表中序列 2 和序列 3 所示的特异性引物， 扩增反应采用 25L 体系， 其 组分为 ： 0097 0098 扩增程序 ： 0099 0100 (4) 结果的检测 ： 0101 在扩增产物中加入12L100SYBR Green I核酸荧光染料， 混匀后在紫外光下 观察， 太子参药材或原植物呈现绿色荧光， 而其他非太子参样品则没有绿色荧光出现。 0102 实验例 3 0103 (1) 材料、 试剂与仪器 0104 同实验例 1 ； 0105 (2) 基因组 DNA 提取 ： 取待检样品 1 5mg， 用植物 DNA 。

43、提取试剂盒、 CTAB 提取法、 碱裂解法或其他方法提取基因组 DNA， 并进行检测， 确认已提取获得 ； 0106 (3) 特异性 PCR 扩增 ： 0107 运用如序列表中序列 2 和序列 3 所示的特异性引物， 扩增反应采用 25L 体系， 其 组分及终浓度 ： 0108 说 明 书 CN 104017863 A 11 10/14 页 12 0109 扩增程序 ： 0110 0111 (4) 结果的检测 ： 0112 在扩增产物中加入 1L100SYBR Green I 核酸荧光染料， 混匀后在紫外光下观 察， 太子参药材或原植物呈现绿色荧光， 而其他非太子参样品则没有绿色荧光出现。 0。

44、113 另外， 通过对比实验例1实验例3的检测结果发现 ： 采用实验例3中的条件进行 检测时， 特异性 PCR 扩增耗费时间最短 ( 实例 1 花费的时间为 35 80min， 实例 3 花费的时 间约 35min), 所耗实验试剂也最少 ( 即所需成本最低 ) ； 采用实验例 2 中的条件进行检测 时， 特异性 PCR 扩增耗费时间 35 50min， 所耗实验试剂较少 ； 实验例 1 实验例 3 检测时 显示的绿色荧光均比较明显。 0114 图 1、 图 2 分别是不同样品的电泳检测图及相应的荧光检测图 (M ： Marker， 1 9 ： TZS-01、 TZS-02、 TZS-03、 。

45、TZS-04、 TZS-05、 TZS-07、 TZS-08、 TZS-09、 TZS-10， 10 12 ： DZY-01、 DZY-02、 DZY-03， 13 15 ： MD-01、 MD-03、 MD-06， 16 18 为 ： BB-01、 BB-02、 BB-04， 19 21 ： BDC-01、 BDC-02、 BDC-03， 22、 23 ： FL-01、 FL-02， CK 为阴性对照 )。 0115 由图 1、 图 2 可知， 使用序列表中序列 2 和序列表中序列 3 特异性扩增太子参 DNA， 扩增产物电泳检测时， 太子参样品有效扩增出目的条带， 混伪品均未电泳出条带 ；。

46、 扩增产物 经 1L100SYBR Green I 染色后荧光检测， 太子参样品呈现绿色荧光， 混伪品均未见绿色 荧光。图 1、 图 2 显示电泳检测结果与荧光检测结果一致， 均表明本发明的快速分子鉴别方 法能有效鉴别出太子参药材或原植物。 0116 与现有技术相比， 本发明可根据太子参药材或原植物的特异性 DNA 片段 ( 其序列 如序列表中序列1所示)设计得到的一组引物(其序列如序列表中序列2和序列3所示)快 速、 准确的鉴别出太子参药材或原植物， 该方法重现性好， 效果明显， 可以将太子参药材或 原植物与其他太子参常见混伪品 ( 如淡竹叶、 繁缕、 宝铎草、 禾叶山麦冬、 阔叶山麦冬、 。

47、矮小 麦冬、 直立百部、 蔓生百部、 对叶百部等)进行有效的区分 ； 同时本发明采用SYBR Green I对 扩增产物进行分子标记检测， 在紫外光下肉眼观察荧光反应即可方便的鉴别出太子参药材 或原植物， 该处理方法相对于凝胶电泳过程而言， 不仅检测过程灵敏、 快速 ( 本发明采用二 说 明 书 CN 104017863 A 12 11/14 页 13 温度点法进行高特异性 PCR 扩增， 即把常规 PCR 的三温度点法合并为变性、 退火延伸， 并通 过优选扩增条件， PCR过程在35min内完成， 较常规的PCR扩增方法节约13个小时 ； 扩增 产物加 SYBR Green I 混匀后紫外光。

48、下肉眼就可观察， 相对常规电泳过程节约 40 90min)、 准确、 成本低， 简化了分子鉴定的操作流程， 而且还具有操作简捷、 稳定性高的优点 ； 另外， SYBR Green I 致畸性相对较低， 保障了实验操作人员的健康安全 ； 此外， 本发明的检测方法 的检测结果一目了然， 且不受人为、 环境因素的影响 ； 所需实验设备也比较简单 ( 不需电 泳槽、 凝胶成像系统等仪器 )， 实用性强， 有利于大规模推广应用。此外， 本发明中经 SYBR Green I 染色后的扩增产物最好在 2h 内观察， 避免 SYBR Green I 从其与 DNA 的复合物中分 离出来， 导致假阴性结果的出现。 附图说明 。