一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法.pdf

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，该方法是通过培养SB9026(保藏号CCTCC M2011292)发酵用菌株、选择合适的种子培养基和发酵培养基和培养条件，在此基础上，在发酵罐中对上述微生物发酵制备方法进行中试放大，通过对温度、转速、pH值控制及原料补充控制等调控手段来调试和建立放大规模的新型活性博莱霉素衍生物6’-脱羟基-BLM S的微生物发酵制备工艺。该制备方法缩短6’-脱羟基-BLM S的发酵制备周期，提高6’-脱羟基-BLM S的发酵产率,同时增加了6’-脱羟基-BLM S在总代谢产物中的比例，便于后继的分离提纯。本发明的博来霉素族衍生物其化学结构通式如说明书中所示。

权利要求书
1.  一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，所述博来霉素族衍生物为6’-脱羟基-BLM S，其特征是，具体步骤为：
1）黄绿链霉菌SB9026的发酵培养：
将黄绿链霉菌SB9026菌株接种至种子培养基中培养，在25°C-35℃下培养1-3天；再取所述种子培养基转接到发酵培养基中培养，接种量为8%-12%，在25°C-35℃下培养9-10天；所述种子培养基为：12g/L-17g/L甘油、12g/L-17g/L棉籽粉、2.5g/L-3.5g/L NaCl和4.5g/L-5.5g/L蛋白胨，其余为水，pH值为6.8-7.2；所述发酵培养基为：18g/L-22g/L葡萄糖，12g/L-17g/L可溶性淀粉，18g/L-22g/L黄豆粉，4.5g/L-5.5g/L酵母粉，0.08g/L-0.12g/L CuSO4·5H2O，0.48g/L-0.52g/L ZnSO4·7H2O和2.5g/L-3.5g/L CaCO3，其余为水，pH为6.8-7.2；其中黄绿链霉菌SB9026的保藏号为CCTCC M 2011292；
2)发酵罐发酵制备博来霉素族衍生物：
采取逐级放大的方式将所述发酵培养基转接至发酵罐中发酵培养；所述发酵罐培养时采取梯度降温模式，初始温度为32°C，当发酵罐培养至20-26小时降温至30℃；当发酵罐培养至55-65小时时降温至28°C，继续发酵培养115-125小时；在发酵培养过程中对微生物的生长和次代谢产物的合成进行控制，同时通过在线监测pH值和溶氧值，使发酵液中残糖浓度维持在0.8g/L-1.2g/L，同时pH值维持在7.5以下，溶氧维持在40%-60%，发酵周期为6-12天；6’-脱羟基-BLM S在发酵液中的产量达30mg/L以上。

2.  根据权利要求1所述博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征是，在步骤1）发酵培养之前先对黄绿链霉菌SB9026进行涂布培养，筛选高产菌株。

3.  根据权利要求1或2所述博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征是，步骤1）为：将黄绿链霉菌SB9026菌株接种至种子培养基中培养，在30℃下培养2天；再取所述种子培养基转接到发酵培养基中培养，接种量为10%，在30°C下培养12天；所述种子培养基为：15gL甘油、15g/L棉籽粉、3g/L NaCl和5g/L蛋白胨，其余为水，pH值为7.0；所述发酵培养基为：20g/L葡萄糖，15g/L可溶性淀粉，20g/L黄豆粉，5g/L酵母粉，0.1g/L CuSO4·5H2O，0.5g/L ZnSO4·7H2O和3g/L CaCO3，其余为水，pH值为7.0。

4.  根据权利要求1或2所述博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征是，步骤2）中所述逐级放大的方式具体为：先将300μl黄绿链霉重组工程菌SB9026的孢子 悬浮液接种到60ml种子培养基中进行第一级放大，在32°C下培养24小时后转至600ml发酵培养基中进行第二级放大，并在32°C再次培养24-36小时直至菌丝体密度达到肉眼可见密集程度；随后将所述600ml发酵培养基转接至装有6L发酵培养基的15L发酵罐中进行发酵培养。

5.  根据权利要求1或2所述博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，其特征是，步骤2）中发酵罐培养的具体方法为：当发酵罐的容积为12L-20L时，发酵罐开始培养时，初始温度为32°C；初始pH值为6.8；设置发酵罐溶氧值与转速为联动状态，溶氧的下限值为30%，转速范围为210rpm-400rpm；当发酵罐培养至20-26小时，设置发酵罐溶氧值与转速为联动状态，将培养温度降低至30°C；当发酵罐培养至55-65小时，发酵液溶氧值跌至最低，转速在最高值运转，此时将培养温度进一步降低至28°C；在发酵培养后期约115-125小时，发酵液溶氧值和pH值开始上升时，开始补加葡萄糖溶液，并实时测定发酵液中残留的还原糖浓度，通过调节补料的频率和速度以及葡萄糖溶液的浓度，使发酵液中残糖浓度维持在1g/L，同时pH值维持在7.5以下，溶氧在40%-60%；当发酵罐维持补充葡萄糖2-3天，溶氧和pH值开始进一步上升，此时整个发酵周期结束。

说明书一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新型博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法。 
背景技术
博莱霉素（Bleomycin，英文简字BLM）是20世纪60年代从轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)的发酵产物中分离发现的一类糖肽类抗肿瘤抗生素。目前已有十余种博莱霉素天然组分被发现，它们的结构仅在末端胺基上存在差异，其中主要成分为博莱霉素A2（55％～70％）和博莱霉素B2（25％～32％）。此外，包括泰莱霉素（Tallysomycin），佐伯霉素（Zorbamycin）和腐草霉素（Phleomycin）在内的天然产物与博莱霉素的结构和活性都极为相似，因此统称为博莱霉素族糖肽类抗肿瘤抗生素。 
博莱霉素有独特的分子结构和生物活性，能够介导激活氧分子，并选择性地引起单链和双链DNA的断裂从而抑制肿瘤细胞DNA合成和复制。此外，博莱霉素还可以选择性地裂解RNA从而抑制蛋白质的合成。博莱霉素的活性机理决定了其不会抑制骨髓造血系统和免疫系统，因此对人体白细胞，机体免疫功能和造血系统等的副作用较为轻微。博莱霉素属于细胞周期非特异性药物，从上世纪80年代起被开发成为一种重要的有效抗肿瘤药物，在临床上广泛应用。以BLM A2和B2为主要成分的商品药就被用于治疗睾丸癌，同时还广泛应用于霍奇金淋巴瘤、鳞状上皮细胞癌、生殖细胞瘤和其他肿瘤的治疗。但是博莱霉素能增加活性氧分子从而导致细胞的氧化压力，并诱导肺中的上皮和非上皮细胞的衰老和凋亡最终导致肺纤维化。目前博来霉素一般与其他抗肿瘤药物或辅助药物联合应用，以降低其毒性和获得更好的抗肿瘤效果。 
佐伯霉素（Zorbamycin，英文简字ZBM）是由黄绿链霉菌（Streptomyces flavoviridis）合成的博莱霉素族抗生素。佐伯霉素与博莱霉素在结构极为相似，主要差别在于佐伯霉素中的末端胺基支链不同，第一个噻唑啉/噻唑的氧化程度不同，多肽骨架中存在β-羟基化-L-缬氨酸和L-高丝氨酸结构部分，糖基部分为2-O-(3-O-氨基甲酰-甘露糖基)-6-脱氧-L-古洛糖（如式II所示）。相应的，在佐伯霉素生物合成基因簇（zbm）的40个开放阅读框（ORF）中，仅有22个显示出与对应的博莱霉素生物合成基因簇（blm）开放阅读框的同源性，其 它开放阅读框的不同很可能导致了上述两种化合物的结构差异。 
博莱霉素自被发现后便因其强效的抗肿瘤活性迅速成为治疗多种肿瘤的特效化疗药物，近年来博莱霉素族抗生素在抗病毒研究中的应用，更加拓宽了其应用范围。但是博莱霉素导致的剂量依赖性肺纤维化以及一些肿瘤细胞逐渐形成的耐药性极大地限制了其临床应用和推广。因此合成新型的高效低毒的博莱霉素族衍生物一直都是开发博莱霉素类抗肿瘤药物的关键和热点。虽然博莱霉素的化学全合成已经完成，但是通过传统化学修饰获取的少量博莱霉素衍生物并未展示出更好的活性或更低的毒性，同时博莱霉素及其复杂的分子结构也导致相关的合成过程繁琐且效率低下，无法满足临床研究的需要和工业化生产的应用。随着生物化学和分子生物学的快速发展，新兴的组合生物合成方法通过遗传操纵次代谢产物生物合成基因来获取目标天然产物衍生物，是一种非常有应用前景的高新技术。通过生物合成基因簇中蕴含的信息以及相关微生物的遗传操纵，组合生物合成技术可实现复杂结构的多功能团化合物的特定结构改变。另一方面，包括博莱霉素、泰莱霉素和佐伯霉素在内的几种博莱霉素族抗肿瘤抗生素的生物合成被大量研究，其相关生物合成基因簇已经被分别克隆、测序以及表征，这为我们通过组合生物合成技术来操纵这些生物合成器并获得具有更好抗肿瘤活性和更低毒性的新型博莱霉素衍生物提供了坚实的基础，也为最终的博莱霉素类新型抗肿瘤药物的开发提供了一条新颖高效的途径。 

式II.、博莱霉素（BLM）和佐伯霉素（ZBM）的化学结构，红色虚线圈标示为两者结构差异之处。 
虽然博莱霉素类化合物具有强效的抗肿瘤活性，要推广其在临床上的应用就必须面对和解决博莱霉素诱导的剂量依赖性肺纤维化以及一些肿瘤细胞逐渐形成的耐药性等关键性问题，因此合成新型的高效低毒的博莱霉素族衍生物一直都是开发博莱霉素类抗肿瘤药物的关键和热点。博莱霉素复杂的分子结构使得通过传统的化学全合成方法来获取其相关衍生物的过程及其繁琐且效率低下，无法满足临床研究的需要和工业化生产的应用，并且合成的博莱霉素衍生物也并未展示出更好的活性或更低的毒性。新兴的组合生物合成方法 通过遗传操纵次代谢产物生物合成基因来获取目标天然产物衍生物，是一种非常有应用前景的高新技术。专利申请号201110276318.9，从佐伯霉素的原始高产菌株黄绿链霉菌SB9001出发，应用基因重组技术将黄绿链霉菌SB9001中的zbmVIII基因完全失活后得到不生产佐伯霉素的黄绿链霉菌突变株，然后以该突变株作为异源宿主，将包含完整博莱霉素生物合成基因簇（blm基因簇）的人造细菌染色体质粒blm1-6E转入其中获得黄绿链霉菌重组工程菌SB9026（保藏号CCTCC M 2011292）。从该重组工程菌的发酵培养产物中我们成功得到一种新型博莱霉素衍生物6’-脱羟基-BLM S，并且初步生物活性测试表明6’-脱羟基-BLM S的DNA裂解活性至少是博莱霉素-A2的10倍以上。这说明在更少用量的条件下，6’-脱羟基-BLM S比目前临床使用的任何一种博莱霉素类抗癌药物的毒性都要低，因此作为迄今为止发现的最有效的博莱霉素衍生物，6’-脱羟基-BLM S很有希望成为博莱霉素族化合物中的新型抗癌药物。但是，6’-脱羟基-BLM S在黄绿链霉菌重组工程菌SB9026中的发酵产率极低，并且还有伴随的副产物BLM S产生，两者产量相当，总产量仅为10mg/L左右，其中6’-脱羟基-BLM S为5mg/L左右，同时整个发酵制备周期在12天以上，效率低下。而要推动其后继的抗癌活性分析、作用机理以及临床前期等研究，就必需获得足量的6’-脱羟基-BLMS。因此，无论是从现阶段研究的需要，还是将来工业化应用的需求，如何建立一套稳定并且高效高产的6’-脱羟基-BLM S的微生物发酵制备方法都迫在眉睫。 
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种利用黄绿链霉重组工程菌SB9026来高效合成新型活性博莱霉素衍生物的微生物发酵制备方法。具体是通过单一菌落分离和菌种选育筛选出稳定高产的SB9026发酵用菌株，然后通过多组平行摇瓶实验，采取单因素和多元响应面等方法来优化发酵制备时所需的种子培养基和发酵培养基，并最终确定使微生物的生长和合成条件达到协调性最佳的培养基。在此基础上，在15L发酵罐中对上述微生物发酵制备方法进行中试放大，通过对温度、转速、pH值控制及原料补充控制等调控手段来调试和建立放大规模的新型活性博莱霉素衍生物6’-脱羟基-BLM S的微生物发酵制备工艺，缩短6’-脱羟基-BLM S的发酵制备周期，提高6’-脱羟基-BLM S的发酵产率。 
本发明的技术方案是： 
一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法，所述博来霉素族衍生物为6’-脱羟基-BLM S，具体步骤为： 
1）黄绿链霉菌SB9026的发酵培养： 
将黄绿链霉菌SB9026菌株接种至种子培养基中培养，在25°C-35℃下培养1-3天；再 取所述种子培养基转接到发酵培养基中培养，接种量为8%-12%（体积比），在25°C-35℃下培养9-10天；所述种子培养基为：12g/L-17g/L甘油、12g/L-17g/L棉籽粉、2.5g/L-3.5g/LNaCl和4.5g/L-5.5g/L蛋白胨，其余为水，pH值为6.8-7.2；所述发酵培养基为：18g/L-22g/L葡萄糖，12g/L-17g/L可溶性淀粉，18g/L-22g/L黄豆粉，4.5g/L-5.5g/L酵母粉，0.08g/L-0.12g/L CuSO4·5H2O，0.48g/L-0.52g/L ZnSO4·7H2O和2.5g/L-3.5g/LCaCO3，其余为水，pH为6.8-7.2；其中黄绿链霉菌SB9026的保藏号为CCTCC M 2011292； 
2)发酵罐发酵制备博来霉素族衍生物： 
采取逐级放大的方式将所述发酵培养基转接至发酵罐中发酵培养；所述发酵罐培养时采取梯度降温模式，初始温度为32°C，当发酵罐培养至20-26小时降温至30℃；当发酵罐培养至55-65小时时降温至28°C，继续发酵培养115-125小时；在发酵培养过程中对微生物的生长和次代谢产物的合成进行控制，同时通过在线监测pH值和溶氧值，使发酵液中残糖浓度维持在0.8g/L-1.2g/L，同时pH值维持在7.5以下，溶氧维持在40%-60%，发酵周期为6-12天；6’-脱羟基-BLM S在发酵液中的产量达30mg/L以上。 
在步骤1）发酵培养之前优选先对黄绿链霉菌SB9026进行涂布培养，筛选高产菌株（所述高产菌株见实施例4中的菌种编号为23和24的菌种）。 
步骤1）优选为：将黄绿链霉菌SB9026菌株接种至种子培养基中培养，在30℃下培养2天；再取所述种子培养基转接到发酵培养基中培养，接种量为10%（体积比），在30°C下培养12天；所述种子培养基为：15g/L甘油、15g/L棉籽粉、3g/LNaCl和5g/L蛋白胨，其余为水，pH值为7.0；所述发酵培养基为：20g/L葡萄糖，15g/L可溶性淀粉，20g/L黄豆粉，5g/L酵母粉，0.1g/L CuSO4·5H2O，0.5g/L ZnSO4·7H2O和3g/L CaCO3，其余为水，pH值为7.0。 
步骤2）中所述逐级放大的方式具体优选为：先将300μl黄绿链霉重组工程菌SB9026的孢子悬浮液接（每ml悬浮液中有106-107个孢子）种到60ml种子培养基中进行第一级放大，在32°C下培养24小时后转至600ml发酵培养基中进行第二级放大，并在32°C再次培养24-36小时直至菌丝体密度达到肉眼可见密集程度；随后将所述600ml发酵培养基转接至装有6L发酵培养基的15L发酵罐中进行发酵培养。 
步骤2）中发酵罐培养的具体方法优选为：当发酵罐的容积为12L-20L时，发酵罐开始培养时，初始温度为32°C；初始pH值为6.8；设置发酵罐溶氧值与转速为联动状态，溶氧的下限值为30%，转速范围为210rpm-400rpm；当发酵罐培养至20-26小时，设置发酵罐溶氧值与转速为联动状态，将培养温度降低至30°C；当发酵罐培养至55-65小时，发 酵液溶氧值跌至最低，转速在最高值运转，此时将培养温度进一步降低至28°C；在发酵培养后期约115-125小时，发酵液溶氧值和pH值开始上升时，开始补加葡萄糖溶液，并实时测定发酵液中残留的还原糖浓度，通过调节补料的频率和速度以及葡萄糖溶液的浓度，使发酵液中残糖浓度维持在1g/L，同时pH值维持在7.5以下，溶氧在40%-60%；当发酵罐维持补充葡萄糖2-3天，溶氧和pH值开始进一步上升，此时整个发酵周期结束。 
下面对本发明做进一步的解释和说明： 
本发明所述的博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，其化学结构通式如式（I）所示： 

其中，R1选自H、烷基、氨基、烃基、酰基、磺酰基、卤代烷基、杂烷基、羟基烷基、氨基烷基或-(CH2)n-C(NH2)=NH，其中n=1-6； 
R2选自H或-OH； 
所述烷基为C1-C6直链或支链脂族烃； 
所述杂烷基指C1-C6直链或支链脂族烃，其中一个或者多个碳被O、S或N取代； 
所述卤代烷基指C1-C6直链或支链脂族烃，其中一个或者多个碳被F、Cl或Br取代。 
其中R1优选为-(CH2)n-C(NH2)=NH，n=1-4，优选n=2。 
当R1为-(CH2)2-C(NH2)=NH，R2为-OH时，对于本发明中的一种具体的化合物，化合物1，其标准分子式C53H79N19O21S2([C53H79N19O21S2+H]+，分子量为1382.5212，简称为BLM S（天赐102），具体结构鉴定和活性测试参见实施例。 
当R1为-(CH2)2-C(NH2)=NH，R2为H时，对于本发明中的另一种具体的化合物，化合 物2，其标准分子式C53H79N19O20S2([C53H79N19O20S2+H]+，分子量为1366.5263，简称为6’-脱羟基-BLM S（天赐103），具体结构鉴定和活性测试实施例。 
所述博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，在DNA裂解活性方面的应用。 
所述博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，在用于制备治疗抗肿瘤药物和抗生素类药物方面的应用。 
所述治疗抗肿瘤药物包括治疗鳞状上皮细胞癌，包括皮肤癌、头颈部癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、阴道癌、阴茎癌等，以及恶性淋巴瘤、脑瘤、甲状腺癌、生殖细胞瘤、恶性黑色素瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌及消化道肿瘤。 
所述博来霉素族衍生物或其异构体、非对映体、对映体，或其水解物、水合物、金属螯合物，或其医药用盐，在用于制备治疗白血病和银屑病药物方面的应用。 
本发明所述的一种用于制备博来霉素族衍生物的黄绿链霉菌SB9026，保藏号CCTCCM 2011292，菌种名称为：黄绿链霉菌SB9026.拉丁文学名为：streptomyces flavoviridis SB9026,保藏编号为：CCTCC NO:M2011292，保藏日期为：2011年8月19日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉，武汉大学。 
所述黄绿链霉菌SB9026的制备方法是：从佐伯霉素的原始高产菌株黄绿链霉菌SB9001出发，应用基因重组技术将黄绿链霉菌SB9001中的zbmVIII基因完全失活后得到不生产佐伯霉素的黄绿链霉菌SB9025突变株；同时以博莱霉素原始生产菌轮枝链霉菌ATCC15003为母体构建博莱霉素生物基因簇blm的人造细菌染色体（BAC）质粒文库，从中筛选出包含完整blm基因簇的BAC质粒pBS54；最终以黄绿链霉菌SB9025突变株为异源宿主，将BAC质粒pBS54转入其中获得黄绿链霉菌SB9026。 
由于博莱霉素族抗癌抗生素的临床重要性，为了开发高效低毒的新型抗癌药物，研究人员进行了大量的研究来确定其分子结构与生物活性之间的关联。一般认为博莱霉素分子骨架中的双噻唑和C-末端的胺基部分对博莱霉素化合物与DNA之间的亲和作用起了主导作用，而且有可能影响着对DNA的辨识和DNA裂解的选择性；而糖基团的功能尚未明确，很有可能参与了博莱霉素与细胞的辨识过程，尤其是细胞的摄取和金属离子的配位等。本发明涉及的BLM S是由博莱霉素的多肽分子骨架包括糖基团部分与佐伯霉素的C-末端胺基链结合而成，而6’-脱羟基-BLM S则是由博莱霉素的多肽分子骨架与佐伯霉素的C-末端 胺基链和糖基团部分结合而成。根据BLM S、6’-脱羟基-BLM S和BLM A2的DNA裂解活性测试比较，BLM S（EC50=320nM）与BLM A2（EC50=300nM）的生物活性相当，因此博莱霉素与佐伯霉素的末端胺基基团互换以后并未明显影响其生物活性；对于6’-脱羟基-BLM S和BLM A2而言，6’-脱羟基-BLM S（EC50=30nM）强于10倍以上的DNA裂解活性则首次揭示了糖基团在决定博莱霉素族化合物的生物活性中扮演了重要的角色。 
博莱霉素有独特的分子结构和生物活性，能够介导激活氧分子，并选择性地引起单链和双链DNA的断裂从而抑制肿瘤细胞DNA合成和复制。此外，博莱霉素还可以选择性地裂解RNA从而抑制蛋白质的合成。因此博莱霉素族化合物的DNA裂解活性的强弱直接反映了其抗癌活性的高低。6’-脱羟基-BLM S极强的DNA裂解活性也预示其更好的抗癌活性，因此可以减少其临床用量并极大地降低其剂量依赖性肺毒性，从而克服了当前博莱霉素临床治疗应用的一大挑战。 
与现有技术相比，本发明的优势在于： 
1、本发明提供了一系列优化改良的发酵培养基，可以提高新型活性博莱霉素衍生物6’-脱羟基-BLM S通过微生物发酵制备时的产量。 
2、本发明提供了一套微生物发酵制备工艺，可以缩短新型活性博莱霉素衍生物6’-脱羟基-BLM S的微生物发酵制备周期，并进一步提高其产量；同时6’-脱羟基-BLM S在总产物中所占的比例明显提高，有利于下游的分离提取和产物富集。 
3、本发明中提供的新型活性博莱霉素衍生物6’-脱羟基-BLM S的微生物发酵制备方法不仅简化了培养基成分，降低了生产成本，为将来新型活性博莱霉素衍生物6’-脱羟基-BLM S的中试规模生产和工业化应用奠定了坚实的基础。 
附图说明
图1是通过pBluescript II SK(+)质粒松弛活性分析来测试BLM S（化合物1）和6’-脱羟基-BLM S（化合物2）的DNA裂解活性，并与BLMA2进行比较； 
其中，图1(a)是固定浓度下的终点分析比较化合物1、化合物2和博来霉素A2的DNA裂解活性；图1(b)以6’-脱羟基-BLM S（化合物2）诱导的DNA裂解为例通过动力学分析确定EC50值；其中A代表超螺旋质粒DNA；B代表开环质粒DNA；C代表线形质粒DNA。 
另外，本发明的保藏号CCTCC M 2011292的菌种保藏信息如下： 
菌种名称为：黄绿链霉菌SB9026. 
拉丁文学名为：streptomyces flavoviridis SB9026, 
保藏编号为：CCTCC NO:M 2011292， 
保藏日期为：2011年8月19日， 
保藏单位为：中国典型培养物保藏中心， 
保藏单位地址：中国武汉，武汉大学。 
具体实施方式
下面结合实施例进一步解释和说明本发明，以下所有百分含量均指质量百分含量。 
实施例1： 
黄绿链霉菌SB9001和实验中得到的基因工程突变菌株均在30°C的ISP4琼脂固体培养基上培养以获取孢子。轮枝链霉菌ATCC15003在含有0.5%甘氨酸的TSBY液体培养基中，28°C和250rpm转速下生长以获取基因组DNA。大肠杆菌在LB液体培养基中，37°C和250rpm转速下生长用于日常的质粒克隆，BAC文库的建立。 
1)黄绿链霉菌SB9025突变株的构建 
从包含一部分佐伯霉素生物合成基因簇zbm的科斯质粒中分离得到了大小为10kb的含有完整的zbmVIII基因的DNA片段，并通过BamHI和BglII酶切位点将该10kb DNA片段克隆到Litmus 28质粒上。所得质粒经Sbf1酶切后将约3.7kb大小的插入片段移除，然后质粒再进行自我连接，完成zbmVIII基因的敲除。将这一更改过的DNA插入片段经过BamHI和BglII酶切后释放，并转移连接至pOJ260质粒中，所得质粒转入大肠杆菌S17-1中作为配体菌株与黄绿链霉菌SB9001进行接合转移实验。通过PCR实验对接合体进行筛选后分离得到双交换重组的黄绿链霉菌SB9025突变株，并最终通过DNA印迹实验对zbmVIII基因的敲除进行验证。 
2)轮枝链霉菌ATCC15003基因组BAC文库的建立和筛选 
基因组BAC文库的构建按照标准试验操作进行。对插入DNA片段的平均大小进行检查后，从平板上挑选的BAC克隆被转入冷冻的96孔板上并在-80°C冷藏过夜。随后这些克隆被转移到Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia,美国)上通过杂交进行固定，并与BlmA探针进行杂交实验。BlmA探针由引物BlmAF(5'-CATATGGTGAAATTCTTGGGTGCCG-3')和BlmAR(5'-AAGCCTCTCCCCCGCGGTGAAGTG-3')扩增得到。最后通过ORF32引物C-PHNA-F1(5'-GCAGCGTCATGAACAGGGTG-3')和C-PHNA-r1(5'-CCGGACCATCATGTAGCGAC-3′)对杂交所得的阳性克隆进行PCR筛选，PCR扩增程序为：94°C 2分钟；94°C 30秒,55°C  30秒，72°C 1分钟共35个循环;72°C 7分钟。最终筛选出包含完整blm基因簇的BAC质粒pBS54。 
上述基因序列号码均在美国的Genebank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）上公开发布，zbmVIII基因（Genbank accession number：EU670723），blm基因簇，以及BlmA探针和ORF32（Genbank accession number：AF149091，AF210249）。 
3)黄绿链霉菌SB9026的构建和发酵培养 
将BAC质粒pBS54转入黄绿链霉菌SB9025突变株中得到黄绿链霉菌SB9026，并通过PCR实验和DNA印迹实验对blm基因簇的转入进行验证。将黄绿链霉菌SB9026的孢子悬浮液接种至50ml种子培养基（15g/L甘油，15g/L药用培养基药媒，3g/L NaCl，2g/L天冬酰胺酸，pH值用1N盐酸调至7.0）中生长。在30°C和250rpm转速下培养2天后，50ml种子培养基被转接到500ml发酵培养基（6.4g/L粟米果冻，5g/L葡萄糖，35g/L黄豆粉，7.5g/L玉米浆，2g/L NaNO3，3g/LNaCl，1g/L K2HPO4，0.1g/L CuSO4·5H2O，0.5g/L ZnSO4·7H2O，pH值用1N盐酸调至7.0）中，在30°C和250rpm转速下发酵12天。 
实施例2： 
新型博莱霉素类似物BLM S（天赐102，化合物1）和6’-脱羟基-BLM S（天赐103，化合物2）的分离提纯和检测 
将发酵液离心后所得的上清溶液进行高效液相（HPLC）检测分析，流动相A为99.9%去离子水和0.1%醋酸，流动相B为99.9%甲醇和0.1%醋酸，流速为0.8mL/min，紫外检测器波长为300nm。线性梯度分析程序为：0-30分钟，100%A/0%B至0%A/100%B。其余上清液用1N盐酸调至pH 7.0后载入Amberlite IRC50(NH4+type)树脂柱，经10倍柱体积去离子水冲洗后，用2升20%醋酸铵溶液进行洗提。得到的洗提液与Diaion HP-20树脂混合并在室温下温和震荡45分钟进行吸附，然后将HP-20树脂装填入柱用10倍柱体积去离子水冲洗并排干残余水，用5倍柱体积的甲醇进行洗提，收集的甲醇洗提液进行浓缩后得到粗提物。将粗提物再次载入Sephadex LH-20柱并用甲醇进行洗提，含有化合物1和2的组分被分别合并蒸干，最后通过半制备高效液相进行提纯。制备柱首先用100%A进行平衡，然后用线性梯度程序（0-20分钟，100%A/0% B至36%A/64% B）进行洗脱，流量为3mL/min，紫外探测波长为300nm。化合物1在11.1分钟被洗脱，化合物2在11.4分钟被洗脱，所得的洗脱液冻干蒸发后得到纯的浅蓝色铜离子复合物1和2。将铜离子复合物用0.5M EDTA-Na(pH 7.0)溶液处理后得到不含铜离子的纯化产物，白色粉末状化合 物1和化合物2。 
BLM S（天赐102，化合物1）和6’-脱羟基-BLM S（天赐103，化合物2）的结构分析说明： 
两种新型博莱霉素类似物通过全面的光谱分析进行了完整的结构表征。紫外光谱分析（最大波长分别为200、248和294nm）证明了化合物1和2含有博莱霉素族化合物中特有的双噻唑发光基团。高分辨基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）分析得到化合物1的[M+H]+分子离子峰（m/z）为1382.5274，与其标准分子式C53H79N19O21S2([C53H79N19O21S2+H]+,分子量为1382.5212)的数值一致。1H与13C核磁共振谱（NMR），以及二维NMR的联合分析表明化合物1中含有博莱霉素的特征结构部分，包括金属离子结合功能域（嘧啶并blamic酸（PBA）子单元以及临近的羟基化组氨酸）、(2S,3S,4R)-4-氨基-3-羟基-2-甲基戊酸(AHM)子单元、糖基团和双噻唑基团。此外，化合物1的核磁共振数据表明其结构中还含有佐伯霉素的末端胺基链3-氨基丙酰胺(APA)[δC169.2(s),33.0(t),and36.9(t);δH3.82(m)and2.83(t,J=6.8Hz)]。通过对HMBC和COSY的进一步详细分析，尤其是对HMBC中H2-51(δH3.82)与两个三级碳原子(C-53和C-49)的主要交联信号峰的分析，化合物1被推断为由BLM骨架和ZBM的末端胺基基团组成（表1和2）。 
化合物2的高分辨基质辅助激光解吸电离质谱[M+H]+分子离子峰（m/z）为1366.5198，与其标准分子式C53H79N19O20S2([C53H79N19O20S2+H]+,分子量为1366.5263)的数值一致。化合物2与化合物1的核磁共振数据对比表明（表1和2）两者结构十分相似，仅仅在二糖侧链的C-50位置上存在差异，化合物1在C-50位置连接了一个羟基，而在化合物2中则被甲基取代了。这说明化合物2的结构中含有与佐伯霉素相同的糖基团和末端胺基基团。 
BLM S（天赐102，化合物1）:[α]D23+26.5(c0.1,CH3OH);LC-MS(阳离子)m/z 722.3[M+Cu]2+;HR-MALDIMS(阳离子)m/z 1382.52121(C53H80N19O21S2[M+H]+,1382.52745)。 1H和13C NMR数据见表1和2。 
6’-脱羟基-BLM S（天赐103，化合物2）：[α]D23+18.1(c0.10,CH3OH);LC-MS(阳离子)m/z 714.4[M+Cu]2+;HR-MALDIMS(阳离子)m/z 1366.51983(C53H80N19O20S2[M+H]+,1366.51983).1H和13C NMR数据见表1和2。 
BLM S（天赐102，化合物1）与6’-脱羟基-BLM S（天赐103，化合物2）的结构式如下： 

表1.BLM S（天赐102，化合物1）和6’-脱羟基-BLM S（天赐103，化合物2）在D2O中的1H核磁共振数据（500Hz,δ：ppm，J=Hz） 

表2.BLM S（天赐102，化合物1）和6’-脱羟基-BLM S（天赐103，化合物2）在D2O中的13C核磁共振数据（125Hz,δ：ppm）及对应的结构 

实施例3： 
BLM S（天赐102，化合物1）和6’-脱羟基-BLM S（天赐103，化合物2）DNA裂解活性测试 
在Fe2+存在条件下，分别对BLM S、6’-脱羟基-BLM S和博莱霉素A2（BLMA2）的生物活性进行测试比较。以超螺旋质粒DNA pBluescript II SK(+)的质粒松弛活性分析为依据，博莱霉素族化合物介导的单链裂解首先将超螺旋质粒DNA(form A)转化为开环质粒DNA(form B)，随后的双链裂解再将其变为线形质粒DNA(form C)。DNA裂解活性测试实验的 反应总体积为10μl，其中包含25mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，约0.65μg的pBluescript SK II(+)质粒DNA，5μM Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O(在1mM H2SO4溶液中新鲜配制)和一定浓度的待测活性化合物（BLM S、6’-脱羟基-BLM S和BLM A2）。该体系在35°C下反应30min后加入5mM EDTA和5μl染液（30%甘油中含有0.25%(w/v)苯酚蓝）结束反应，待测样品进行电泳实验后于紫外灯下观察DNA条带分布。 
观察结果发现在所有测试中，待测活性化合物对DNA裂解活性均与其浓度相关。BLMS与BLM A2的活性相当，两者的EC50值分别为300nM和320nM。而6’-脱羟基-BLM S的活性至少是BLM A2的10倍以上，其EC50值仅为30nm（图1）。 
BLM S和6’-脱羟基-BLM S的结构差异与其抗癌活性之间的关系 
因为博莱霉素族抗癌抗生素的临床重要性，为了开发高效低毒的新型抗癌药物进行了大量的研究来确定其分子结构与生物活性之间的关联。一般认为博莱霉素分子骨架中的双噻唑和C-末端的胺基部分对博莱霉素化合物与DNA之间的亲和作用起了主导作用，而且有可能影响着对DNA的辨识和DNA裂解的选择性；而糖基团的功能尚未明确，很有可能参与了博莱霉素与细胞的辨识过程，尤其是细胞的摄取和金属离子的配位等。本发明涉及的BLM S是由博莱霉素的多肽分子骨架包括糖基团部分与佐伯霉素的C-末端胺基链结合而成，而6’-脱羟基-BLM S则是由博莱霉素的多肽分子骨架与佐伯霉素的C-末端胺基链和糖基团部分结合而成。根据BLM S、6’-脱羟基-BLM S和BLM A2的DNA裂解活性测试比较，BLM S（EC50=320nM）与BLM A2（EC50=300nM）的生物活性相当，因此博莱霉素与佐伯霉素的末端胺基基团互换以后并未明显影响其生物活性；对于6’-脱羟基-BLM S和BLMA2而言，6’-脱羟基-BLM S（EC50=30nM）强于10倍以上的DNA裂解活性则首次揭示了糖基团在决定博莱霉素族化合物的生物活性中扮演了重要的角色。 
博莱霉素有独特的分子结构和生物活性，能够介导激活氧分子，并选择性地引起单链和双链DNA的断裂从而抑制肿瘤细胞DNA合成和复制。此外，博莱霉素还可以选择性地裂解RNA从而抑制蛋白质的合成。因此博莱霉素族化合物的DNA裂解活性的强弱直接反映了其抗癌活性的高低。6’-脱羟基-BLM S极强的DNA裂解活性也预示其更好的抗癌活性，因此可以减少其临床用量并极大地降低其剂量依赖性肺毒性，从而克服了当前博莱霉素临床治疗应用的一大挑战，很有希望成为博莱霉素族化合物中的新型抗癌药物。 
实施例4：制备方法的进一步改进 
黄绿链霉重组工程菌SB9026在30°C，ISP4琼脂固体培养基上培养以获取孢子。在摇 瓶条件下进行6’-脱羟基-BLM S的发酵制备时，首先将200μl黄绿链霉重组工程菌SB9026的孢子悬浮液接种至容纳50ml优化种子培养基的250ml广口三角锥形瓶中，在30°C和210rpm转速下培养48小时；然后按照10%（v/v体积比）的发酵接种量，将10ml上述培养48小时的种子培养基转接到含有100ml发酵培养基的250ml三角锥形瓶中，在30°C和210rpm转速下发酵10天。目标产物6’-脱羟基-BLM S的分离提取和分析检测方法见实施例1-3。以下所有百分含量均指质量百分含量。 
1：新型博来霉素族衍生物6’-脱羟基-BLM S（天赐103）的稳定高产菌株筛选 
原始的黄绿链霉重组工程菌SB9026为氨基糖苷类抗生素阿普拉霉素（Apramycin）抗性菌株。为获得纯化的单一菌落，SB9026的孢子悬浮液被稀释了106倍后被均匀涂布在含有50mg/L阿普拉霉素的ISP4琼脂固体培养基平板上，并置于30°C下培养。培养7天后观察单菌落生长情况，挑选并标记生物形态特异的单菌落，在培养至10天左右，孢子接近成熟时，挑选所标记的单菌落进行进一步培养和目标产物效价测试评定，筛选6’-脱羟基-BLM S的稳定高产菌株。最终，我们在分离得到的352个单菌落中挑选了36株进行筛选（挑选及分类的有关描述详见表1），并从中得到了一株生长和形态稳定且6’-脱羟基-BLMS产量较高的生产菌种，用于后继的研究和生产。 
表3分离所得单菌落的生长形态描述以及筛选测试菌种的来源 
菌种编号 菌落生长形态 1-12 圆点状白色中间凸起 13-14 同心圆状中间有白色凸点 15-16 圆环状中间凹陷 17、19、22 全白色厚实菌丝体，圆点状中间凸起 18、20、25 圆环状中间灰色孢子，边缘一圈白色菌丝 21、26 圆点状全灰色孢子 23、24 灰色孢子中间间零星白色菌丝 27-31 圆环状中间灰色孢子，边缘一圈白色菌丝 32、33、35 灰色孢子中间间零星白色菌丝，黑色色素 36 灰色孢子中间间零星白色菌丝
菌种编号为23和24的菌种为优良的高产菌株，菌落生长形态为灰色孢子中间间零星白色菌丝的状态。 
2：新型博来霉素族衍生物6’-脱羟基-BLM S（天赐103）的微生物发酵制备培养基优化改良 
1)黄绿链霉重组工程菌SB9026的优化种子培养基 
黄绿链霉重组工程菌SB9026的原始种子培养基中包含15g/L甘油、15g/L药用培养基药媒、3g/L NaCl和2g/L天冬酰胺酸，然后pH值用1N盐酸调至7.0。 
考虑到原料的常规性和价格，我们用常规棉籽粉替代药用培养基药媒，用蛋白胨替代天冬酰胺酸，并对相关用量进行比较后得到了优化改良的种子培养基，其中包含15g/L甘油、15g/L棉籽粉、3g/LNaCl和5g/L蛋白胨，充分溶解后用2M NaOH调节pH值至7.0。使用优化种子培养基后，在相同接种量和培养条件下，菌体的生长速度及接种发酵时的菌体密度与使用原始种子培养基时的情况相当，最后的6’-脱羟基-BLM S发酵产量也基本相同，但是使用优化种子培养基时要略好与使用原始种子培养基时，且优化种子培养基的生产成本要明显低于原始种子培养基。 
2)黄绿链霉重组工程菌SB9026的优化发酵培养基 
黄绿链霉重组工程菌SB9026的原始发酵培养基中包含6.4g/L粟米果冻、5g/L葡萄糖、35g/L黄豆粉、7.5g/L玉米浆、2g/L NaNO3、3g/L NaCl、1g/L K2HPO4、0.1g/LCuSO4·5H2O和0.5g/L ZnSO4·7H2O，然后pH值用1N盐酸调至7.0。 
首先进行碳源的优化改良，分别使用葡萄糖、果糖、甘露醇、甘油、麦芽糖、糊精、玉米粉、可溶性淀粉、半乳糖、乳糖、山梨醇、鼠李糖和豆油作为初始碳源，并评价各个条件下的6’-脱羟基-BLM S产量。最终的比较结果表明，葡萄糖和甘露醇作为单一碳源时能较好的支持6’-脱羟基-BLM S的生物合成，考虑到甘露醇的价格至少是葡萄糖的7倍，我们采用葡萄糖作为发酵培养基的第一速效碳源，随后经过多元优化将可溶性淀粉定为第二长效碳源，并经过一系列测试比较后最终确定两者的用量为20g/L葡萄糖和15g/L可溶性淀粉时为最佳组合。 
在确定了碳源组成后，氮源优化对包括蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、酵母膏、麦芽提取物、牛肉浸膏、酶解干酪素、玉米浆、玉米粉、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米蛋白粉、胰蛋白粉和小麦胚芽粉在内的14种常用氮源进行了比较。最终的比较结果表明，胰蛋白胨、酵母粉、酶解干酪素和黄豆饼粉均可很好地支持6’-脱羟基-BLM S的生物合成，随后的多元组合优化表明酵母粉和黄豆饼粉的组合在效价和生产成本等方面要明显优于其它化合物组合，经过一系列测试比较后最终确定两者的用量为20g/L黄豆粉和5g/L酵母粉时为 最佳组合。 
最后对培养基中的无机盐进行优化，比较测试结果表明，Cu2+和Zn2+的用量都已经达到最佳，无需再次调整；磷酸盐虽然能促进菌体的生长，但是对6’-脱羟基-BLM S的生物合成有一定抑制作用，不加时6’-脱羟基-BLM S的产量反而略有提升；NaNO3和NaCl的添加与否对菌体生长和6’-脱羟基-BLM S的产量毫无影响；根据文献报道和经验，添加一定量的CaCO3可以平衡发酵液的pH值，并且有利于菌丝体的生长，最终确定优化后无机盐的组成为0.1g/L CuSO4·5H2O、0.5g/L ZnSO4·7H2O和3g/L CaCO3。 
在对碳源、氮源和无机盐等主要成分进行单因素和多元响应面优化后，最终确定的优化发酵培养基包含20g/L葡萄糖，15g/L可溶性淀粉，20g/L黄豆粉，5g/L酵母粉，0.1g/L CuSO4·5H2O，0.5g/L ZnSO4·7H2O和3g/L CaCO3，充分溶解后用2M NaOH调节pH值至7.0，该组成与原始发酵培养基相比得到了明显的简化，大大降低了生产成本。 
在使用优化的种子培养基和发酵培养基对新型博来霉素族衍生物6’-脱羟基-BLM S进行微生物发酵制备时，发酵周期由原始的12天缩短到9至10天，6’-脱羟基-BLM S的产量可达15mg/L左右，比原始产量提高了近3倍。 
3：新型博来霉素族衍生物6’-脱羟基-BLM S（天赐103）的发酵罐发酵制备工艺 
采取逐级放大的方式对黄绿链霉重组工程菌SB9026进行上罐发酵培养。先将300μl黄绿链霉重组工程菌SB9026的孢子悬浮液接种到60ml优化种子培养基中进行第一级放大，在32°C下培养24小时后转至600ml发酵培养基中进行第二级放大，并在32°C再次培养24至36小时直至菌丝体密度达到肉眼可见密集程度；随后将此600ml发酵培养基转接至装有6L发酵培养基的15L发酵罐中进行最后的发酵培养以制备新型博来霉素族衍生物6’-脱羟基-BLM S。发酵罐开始培养时，初始温度为32°C；初始pH值为6.8左右；溶氧值与转速设置成联动，溶氧的下限值为30%，转速范围为210-400rpm。当发酵罐培养至24小时左右，溶氧和转速开始联动时，将培养温度降低至30°C。当发酵罐培养至60小时左右，发酵液溶氧值跌至最低，转速在最高值运转，此时将培养温度进一步降低至28°C。在发酵培养后期约120小时左右，发酵液溶氧值和pH值开始上升时，开始按照补加葡萄糖溶液，并通过二硝基水杨酸（DNS）试剂法实时测定发酵液中残留的还原糖浓度，通过调节补料的频率和速度以及葡萄糖溶液的浓度，使发酵液中残糖浓度维持在1g/L左右，同时pH值维持在7.5以下，溶氧在40%-60%。当发酵罐维持补充葡萄糖3天左右，溶氧 和pH值开始进一步上升，此时整个发酵周期结束，按照标准流程对发酵液进行处理后，分离提取和纯化目标产物6’-脱羟基-BLM S并进行定量分析。 
经过对发酵过程中温度、转速、pH值控制及原料补充控制等重要发酵参数的人工调控，最终的发酵制备周期缩短至8天左右，6’-脱羟基-BLM S的产量可达30mg/L左右，比原始产量提高了近6倍，并且总产物中目标化合物6’-脱羟基-BLM S和副产物BLM S的组成由原始的1:1变为3:1，简化了后继的分离和纯化等工作。