可复制型DNA疫苗载体PSFVAX1－IRES及其构建方法.pdf

本发明属于肿瘤生物治疗领域，涉及一种可复制型DNA疫苗载体的构建与制备，“自我复制”型载体是由Alpha病毒如Sindbis及SFV衍生的DNA/RNA载体，可被用于外源基因的高效表达。此类表达载体与传统真核载体对外源基因的表达机制不同，可介导细胞浆内重组RNA的自身复制，从而导致外源基因编码的mRNAs的高水平表达。本发明所研制的可复制型DNA疫苗载体pSFVax1－IRES，是在常规可复制型RNA疫苗载体pSFV1的基础上改造而成，该载体的特征在于具有PCMV启动子元件、RNA复制酶元件、IRES序列和多种稀有酶切位点，同时具有卡那霉素抗性。该载体系统的发明，不仅可提高外源基因的克隆表达效率，而且在DNA水平上方便外源基因的操作，从而为研究可复制型DNA疫苗提供了新的载体系统。

权利要求书
1.  一种用于肿瘤生物治疗的复制性DNA疫苗载体pSFVax1-IRES，其特征在于具有PCMV启动子元件、RNA复制酶元件、IRES序列和多种稀有酶切位点，同时具有卡那霉素抗性。

2.  按照权利要求1PCMV启动子元件是指CMV IE增强子启动子，在载体的10463-11025bp处，是重要的真核表达调控元件。

3.  按照权利要求1RNA复制酶元件是具有自主复制功能的RNA病毒复制元件，这类RNA病毒主要是披膜病毒科的甲病毒，如辛德比斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、以及委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)等。

4.  按照权利要求1IRES序列是双顺反子表达元件，可以有效地增加载体对外源基因的表达能力。此外在向载体引入IRES序列的同时还引入了两组有利于外源基因表达的稀有酶切位点。

5.  按照权利要求1同时也将pSFV1中的氨卞青霉素抗性改造成了卡那霉素抗性，使本发明将来所获得的复制型DNA疫苗能够更适合人体应用。

6.  pSFVax1-IRES的构建方法其特征在于首先获得pVAX1-IRES过渡载体，然后经酶切补平和平段连接后获得改造后的新型复制型DNA载体。

7.  新型复制型DNA载体pSFVax1-IRES在疫苗研究中的应用。

说明书可复制型DNA疫苗载体pSFVax1-IRES及其构建方法
技术领域
本发明属于肿瘤生物治疗领域，涉及一种可复制型DNA疫苗载体的构建与制备。
背景技术
常规DNA疫苗有可能与宿主细胞基因组发生整合，从而引起宿主细胞的转化；并且DNA疫苗不能在体内复制，外源基因的表达水平低，达不到所需要的免疫效果[Nichols W W，Ledwith B J，Manam S V，et al.Potential DNAvaccine integration into host cell genome.[J]Ann N Y AcadSci，1995，772：30-39.]。这些局限性促使研究人员去研发更安全、高表达、免疫效果更好的疫苗。近年来用具有“自主复制”功能的RNA病毒复制元件构建的复制型DNA疫苗克服了常规DNA疫苗、RNA疫苗以及RNA复制子疫苗的缺点，显示出很好的应用前景。所谓“自主复制”的RNA疫苗(即RNA复制子疫苗)，是在具有“自我复制”功能的RNA病毒的基础上构建而成的。这类RNA病毒主要是披膜病毒科的甲病毒，如辛德比斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、以及委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)等。这种RNA病毒在利用自身的RNA复制酶实现自我复制的同时，也实现了外源基因的高效表达。但该疫苗虽然在外源基因高效表达上有了突破性进展，而RNA的稳定性差所带来的生产、储存、运输不便的问题仍未解决，因此RNA复制子疫苗的应用还是受到了一定的限制。
用具有“自主复制”功能的RNA病毒复制元件构建的复制型DNA疫苗，则克服了上述缺点，并保留了“自主复制”型RNA疫苗的优点。1)RNA复制酶使得该疫苗具有自我复制能力，介导RNA复制子在细胞质中的大量自我复制，因此外源基因可以得到高效表达[Hariharan M J，Driver D A，Townsend K，et al.DNA immunization against herpes simplex virus：enhanced efficacy using aSindbis virus-based vector[J].J Virol，1998，72(2)：950-958.]。2)复制型DNA疫苗可以产生CTL反应和抗体应答，同时还可诱导黏膜免疫和全身免疫，因此该疫苗的免疫效果较好[Lee JS，Hadjipanayis AG，Welkos SL.Venezuelan equineencephalitis virus-vectored vaccine protect mice against anthrax sporechallenge.[J].Infect Immun，2003，71：1491.]。表达产物在APC内经蛋白酶复合体降解成短肽片段后，一部分在内质网上与MHC-I类分子结合，然后表达于细胞膜表面，激活CD8+T细胞，引发CTL反应，从而产生细胞免疫反应。另一部分短肽进入溶酶体内体区与MHC-II类分子结合后运至APC表面，激发CD4+T细胞克隆的增殖、分化，从而促进B细胞的增殖分化，产生抗体，诱发体液免疫反应[Frolov I，Hoffman TA.Alphavirus-based expression vectors：Strategies and applications.[J]Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：11371.]。3)该疫苗的自我复制、转录表达均发生于细胞质中，而且最终会诱导被转染细胞的凋亡，从而消除了与宿主细胞基因组整合的危险性，提高了安全性[LeitnerW W，Ying H，Driver D A，et al.Enhancement of tumor-specific immune responsewith plasmid DNA replicon vectors.[J]Cancer Res，2000，60：51-55.]。4)由于DNA的理化性质比较稳定，体外不易降解，所以该疫苗的稳定性较好，便于生产、储存和运输。基于上述优点，作为一种新型疫苗，复制型DNA疫苗已经在许多疾病模型上展示出了良好的免疫效果。[Nordstrom EK，Forsell MN，Barnfield C，et al.Enhanced immunogenicity using an alphavirus replicon DNAvaccine against human immunodeficiency virus type 1.[J].J Gen Virol.2005，86：349-354.][Otten GR，Schaefer M，Doe B，et al..Enhanced potency of plasmidDNA microparticle human immunodeficiency virus vaccines in rhesus macaquesby using a priming-boosting regimen with recombinant proteins.[J].J Virol.2005，79(13)：8189-8200.][Quintana-Vazquez D，Vazquez-Blomquist DM，GalbanRodriguez E，et al.A vaccination strategy consisting of SemlikiForest-virus(SFV)DNA prime and fowlpox-virus boost significantly protects mice from arecombinant(HIV-1)vaccinia-virus infection.[J].Biotechnol Appl Biochem.2005，41：59-66.]
西门利克森林病毒(Semliki forest virus，SFV)载体是近年来构建成功的新型甲病毒载体，具有表达效率高，宿主范围广，且表达蛋白能够进行正确的折叠、加工、转运等特点。与痘苗病毒、腺病毒和单纯疱疹病毒等病毒载体比较，不但系统简单，而且不产生大量的病毒特异性蛋白。因此该载体系统在外源基因的表达和新型疫苗的研究方面具有较广泛的应用前景。但该载体系统在SP6启动子控制下，外源基因在哺乳动物细胞中表达必须首先进行体外转录，制备5′末端含有帽子结构的重组RNA，这种体外转录物不但容易降解，而且转染效率低，因而限制了它的应用。另外pSFV1表达载体的多克隆位点区酶切位点少，不利于外源基因的插入。为克服pSFV1载体系统的种种限制，本研究对其进行了改造，首先在pSFV1的多克隆位点区插入含有多种稀有酶位点的接头；并将真核表达调控元件导入了该载体系统。该载体系统的改造，不但可提高外源基因的克隆效率，而且为在DNA水平上进行外源基因的操作提供了方便。
综上所述，“自我复制”型载体是由Alpha病毒如Sindbis及SFV衍生的DNA/RNA载体被用于外源基因的表达。此类表达载体与传统真核载体对外源基因的表达机制不同。在传统表达载体中，RNA聚合酶II直接介导外源基因mRNA的转录。而在此类复制性载体中，第一层表达核也利用CMV即刻-早期增强子作为启动子，但此启动子并不直接指导外源基因的表达，而是控制具有自身复制能力的Alpha病毒RNA表达层(replicon)的表达。这一复制子由SFV非结构区复制酶基因、病毒复制所必需的结构基因5’与3’末端，以及替代病毒结构基因的外源基因组成。Alpha病毒RNA的翻译产生Alpha病毒复制酶复合物，继而介导细胞浆内重组RNA的自身复制，从而导致外源基因编码的mRNAs的高水平表达。
发明内容
本发明的目的是自主设计并构建一个新的可复制型DNA疫苗载体，为研究可复制型DNA疫苗提供新的载体系统。在常规的可复制型RNA疫苗载体pSFV1的基础上，增加了CMV IE增强子启动子及牛生长因子加尾信号poly(A)加尾信号，并且增加了双顺反子表达元件IRES序列和多种稀有酶位点，从而将以RNA为基础的pSFV1载体系统构建成以DNA为基础的表达载体系统pSFVax1-IRES。同时也将pSFV1中的氨卞青霉素抗性改造成了卡那霉素抗性，更适合将来构建的复制型DNA疫苗进行人体应用，以该载体为基础开发新型复制型DNA疫苗，将会更加安全有效。
本发明构建的pSFVax1-IRES可复制型DNA疫苗载体，其质粒全长11458bp，参见序列表中的SEQ ID №：载体全长序列。重要的功能元件及其在pVAX1-IRES载体中的位置如下：
CMV promoter：10463-11025
Multiple cloning site A：7403-7478
Multiple cloning site B：8065-8113
IRES：7479-8071
BGH polyadenylation signal：8150-8167
Kanamycin resistance gene：8553-9347
pUC origin：9647-10320
附图说明
图1为pSFVax1-IRES可复制型DNA疫苗载体的构建策略图
图2为IRES的扩增片段
1.DL2000  2.IRES扩增产物
图3为IRES扩增产物测序图
图4为IRES插入pVAX1的酶切鉴定电泳图
1.DL2000  2.过渡载体pVAX1-IRES  3.EcorV和XhoI双酶切产物 
图5为线性化的pVAX1-IRES和酶切后的pSFV1
1.DL2000  2.过渡载体pVAX1-IRES
3.线性化的pVAX1-IRES
4.pSFV1质粒
5.酶切处理的pSFV1
图6为pSFVax1-IRES的鉴定图
1.DL2000
2、pVAX1质粒
3.过渡载体pVAX1-IRES
4、RNA疫苗载体pSFV1
5、可复制型载体pSFVax1-IRES
6.用SmaI和BamHI双酶切pSFVax1-IRES的产物
具体实施方式
本发明提出的pSFVax1-IRES可复制型DNA疫苗载体的构建与制备实施方式如下(参见图1)：
1、首先设计引物，从pIRES-neo载体中扩增出IRES序列。在pIRES-neo载体中，IRES序列的位置为1295-1880，扩增时，5’端多出16bp，3’端多出16bp(含一个SmaI酶切位点)。在扩增IRES序列的上游引物中，预先设计了限制性内切酶位点EcorV、BamI、ClaI、BstBI、PvuI和PsiI；在扩增IRES序列的下游引物中，预先设计了限制性内切酶位点BssHII、SwaI、PacI、NsiI、smaI和XhoI。
2、将上述扩增出的IRES片段，在EcorV和XhoI双酶切位点之间，插入pVAX1载体中，得到pVAX1-IRES过渡载体。
3、将得到的过渡载体pVAX1-IRES用NheI酶切，补平末端；再用BamHI酶切，得到线性化pVAX1-IRES；
4、用SphI酶切pSFV1，补平末端，再用BamHI酶切，得到pSFV1载体片段。
5、将上述线性化的pVAX1-IRES和pSFV1载体片段进行连接，得到pSFVax1-IRES可复制型DNA疫苗载体。
本发明更详细的实施方法可参见实施例，本实施例是用于解释、而不是以任何方式限制本发明。
实施例1：设计引物并进行合成。
上游引物设计：
EcorV GATATC-ClaI AT/CGATBstBI TT/CGAA-PvuI CGAT/CG-PsiITTA/TAA
                 GATATCGATTCGAACGATCGTTATAA
TGCAGATATCGATTCGAACGATCGTTATAActagggcggccaattccgcccctctcc(pSFVaxl-IRES)
下游引物设计：
NsiI ATGCA/T-PacI TTAAT/TAA-SwaI ATTT/AAAT-BssHII G/CGCGC-XhoICTCGAG
ATGCATTAATTAATTTAAATGCGCGCTCGAG(正向序列)
ataattcctgcagccaATGCATTAATTAATTTAAATGCGCGCTCGAGTCTAG(pSFVax1-IRES)
引物合成由北京三博远志生物技术有限公司完成。
实施例2：从pIRES-neo载体中扩增IRES序列，克隆到pSimple18-EcoRV/BAPVector测序
在GeneAmp PCR System 2400型PCR仪上进行如下反应：
反应体系50μl：5xPrimeSTARTM Buffer(Mg2+plus)10μl，dNTPs(2.5mmol/L)4μl，上游引物(20μmol/L)1μl，下游引物(20μmol/L)1μl，PrimeSTARTM HSDNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，模板(pIRES-neo质粒稀释100倍)1μl，灭菌蒸馏水32.5μl
反应条件：95℃3分钟(94℃45秒，60℃45秒，72℃1分钟30秒)循环30次72℃7分钟 4℃∞
产物鉴定：取5μl PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，结果证实扩增产物的分子量在500～750bp范围，与预期的682bp一致。
序列分析：将PCR产物按照TaKaRa DNA Kination Kit试剂盒的说明进行5′末端磷酸化，然后连接到测序载体pSimple18-EcoRV/BAP Vector中，委托三博远志生物技术公司进行序列测定，结果测定序列与预期序列一致，证明确实扩增出了序列完全正确的IRES基因，并在其两侧附加了多个酶切位点。预期及测序分析的PCR扩增产物序列完全一致(测序图见图3)。
实施例3：将IRES克隆到pVAX1真核表达载体中
双酶切：用碱变性法提取含IRES PCR扩增产物的pSimple18-EcoRV/BAP-IRES质粒，用EcorV和XhoI双酶切，纯化切出的IRES片段；用EcorV和XhoI双酶切真核表达载体pVAX1，纯化回收酶切处理后的载体。双酶切体系为5μl的10×NEBbuffer3，10u/μl的EcoRV 2μl，10u/μl的XhoI 2μl，100×BSA0.5μl，质粒30μl，加水至总体积50μl，37℃水浴8小时。酶切后产物割胶纯化回收目的片段。
插入连接：取上述纯化回收的IRES片段和pVAX1载体各5μl，TaKaRaDNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞连接试剂盒中的Ligation Mix 10μl，16℃过夜，进行连接反应。次日常规方法转化到DH5α感受态菌中。
鉴定：从转化的细菌中，挑出3个克隆提质粒用EcorV和XhoI双酶切进行酶切鉴定，获得了一个插入了IRES的阳性克隆，命名为pVAX1-IRES，酶切鉴定结果见图4。
实施例4：构建可复制型DNA载体pSFVax1-IRES
4.1将得到的过渡载体pVAX1-IRES用NheI酶切，补平末端；再用BamHI酶切，得到线性化pVAX1-IRES，酶切结果见图5。
4.2用SphI酶切pSFV1，补平末端，再用BamHI酶切，得到pSFV1载体片段，酶切结果见图5。
4.3将上述线性化的pVAX1-IRES和pSFV1载体片段进行连接反应，次日常规方法转化到DH5α感受态菌中。
4.4从转化的细菌中，挑取克隆提质粒用SmaI和BamHI双酶切进行酶切鉴定，获得了一个插入了IRES的阳性克隆，命名为pSFVax1-IRES，酶切鉴定结果见图6。
                  SEQUENCE LISTING
<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
<120>可复制型DNA疫苗载体pSFVax1-IRES及其构建方法
<130>参考文献标识于申请说明书中
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>11458
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>在常规可复制型RNA疫苗载体pSFV1的序列基础上改造而成，具有PCMV启动子
     元件、RNA复制酶元件、IRES序列和多种稀有酶切位点，同时具有卡那霉素
     抗性基因
<400>1
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