阿司匹林ARGGLYASPVAL缀合物,其合成,纳米结构和作为载药体系的应用.pdf

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1、10申请公布号CN104211763A43申请公布日20141217CN104211763A21申请号201310225673222申请日20130605C07K5/11200601C07K1/06200601C07K1/02200601A61K47/42200601A61K31/616200601A61P7/0220060171申请人首都医科大学地址100069北京市丰台区右安门外西头条10号72发明人彭师奇赵明吴建辉王玉记马海萍54发明名称阿司匹林ARGGLYASPVAL缀合物,其合成,纳米结构和作为载药体系的应用57摘要阿司匹林ARGGLYASPVAL缀合物,其合成,纳米结构和作为载药体。

2、系的应用。本发明公开了一种新型阿司匹林ARGGLYASPVALARGDV缀合物，还公开了它的制备方法以及它作为抗血栓剂的应用。ARGDV的特征在于，在血液中能够以纳米颗粒选择性地转运，到达血栓形成部位之后与被激活的血小板表面的GPIIB/IIIA受体作用，释放阿司匹林。因此，ARGDV是阿司匹林的靶向给药体系。ARGDV具有强的抗血栓活性，具有良好的临床应用前景。下面是ARGDV的结构式。51INTCL权利要求书1页说明书8页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图6页10申请公布号CN104211763ACN104211763A1/1页21结构式如。

3、下的新型阿司匹林ARGGLYASPVAL缀合物ARGDV。2权利要求1的ARGDV的纳米结构。3制备权利要求1的ARGDV的制备方法，包括1采用液相合成方法，通过逐步接肽分别合成ARGGLY的保护中间体和ASPVAL的保护中间体；2脱去ARGGLY的保护中间体的C端保护基；3脱去ASPVAL的保护中间体的N端保护基；4把N端游离的ASPVAL的保护中间体和C端游离的ARGGLY保护中间体偶联得到ARGGLYASPVAL的保护中间体；5脱去ARGGLYASPVAL的保护中间体的N端保护基；6把N端游离的ARGGLYASPVAL保护中间体和阿司匹林偶联得到ARGDV的保护中间体；7把ARGDV的保。

4、护中间体脱去保护基，得到ARGDV。4权利要求1的ARGDV作为阿司匹林载药体系的应用。5权利要求4的ARGDV的阿司匹林载药体系在血栓中定向释放阿司匹林的应用。6权利要求1的ARGDV作为抗血栓药物的应用。权利要求书CN104211763A1/8页3阿司匹林ARGGLYASPVAL缀合物，其合成，纳米结构和作为载药体系的应用技术领域0001本发明涉及一种新型阿司匹林ARGGLYASPVALARGDV缀合物，还涉及它的制备方法以及它作为抗血栓剂的应用。ARGDV的特征在于，在血液中能够以纳米颗粒选择性地转运，到达血栓形成部位之后与被激活的血小板表面的GPIIB/IIIA受体作用，释放阿司匹林。。

5、因此，ARGDV是阿司匹林的靶向给药体系。ARGDV具有强的抗血栓活性，具有良好的临床应用前景。本发明属于生物医药领域。下面是ARGDV的结构式。0002背景技术0003阿司匹林在临床上被广泛应用已逾百年，用于治疗急性炎症，疼痛，心血管疾病，中风，妊娠并发症，癌症，糖尿病和阿尔兹海默症，这些表明它卓越的疗效。对于不同的适应症，阿司匹林有不同的治疗方案。然而，临床也已经揭示了阿司匹林的严重局限性。最主要的局限性是患者对阿司匹林治疗出现耐药或者丧失疗效。患者对阿司匹林治疗出现耐药或者丧失疗效，一方面表现在阿司匹林不完全地抑制患者的血小板功能，尽管患者服用了足够临床剂量阿司匹林。这种情况严重地降低了。

6、阿司匹林的对多种疾病包括二型糖尿病，哮喘，心血管疾病，中风，冠心病和小儿心脏手术的治疗效果。为了克服阿司匹林的不足，人们做出了许多努力。例如，为增强糖尿病人血小板的敏感性，实施代谢控制和服用阿司匹林的交替给药方案；为增强高血浆胆固醇的心血管疾病患者的血小板敏感性，将阿司匹林与脂质过氧化抑制剂联用；为增强动脉粥样硬化血栓患者血小板的敏感性，将阿司匹林与他汀类药物联用；为避免患者对阿司匹林的不良容忍性，将阿司匹林与其它药物交替使用；为增强因阿司匹林致呼吸道疾病加重的病人口服阿司匹林的安全性，使用采用预处理过的白三烯改造的药物。尽管这些工作取得了一些成就，患者对阿司匹林治疗出现耐药或者丧失疗效至少仍。

7、然是限制阿司匹林治疗心血管疾病的主要临床障碍。0004RGD序列肽是整合素识别胶原，纤连蛋白，玻连蛋白，层粘连蛋白，免疫球蛋白超家族成员和血浆蛋白质的触发点。虽然整合素与RGD序列肽的相互作用被广泛用于制备大分子药物载体，但是没有任何研究使用单一的RGD四肽直接输送药物。0005在RGD四肽与小分子形成的缀合物的生物学研究中，发明人发现，当缀合物的RGD四肽部分与活化的血小板表面的GPIIB/IIIA受体相互作用时，缀合物的小分子部分可以分解下来。也就是说，当RGD四肽与小分子形成的缀合物的RGD四肽部分与血栓中活化的血小板表面的GPIIB/IIIA受体相互作用时，缀合物的小分子部分可以分解下。

8、来。而在没有说明书CN104211763A2/8页4活化血小板的血液循环中，RGD四肽与小分子形成的缀合物不发生任何分解。根据这些认识，发明人提出了本发明。发明内容0006本发明的第一个内容是将RGDV与阿司匹林缀合，制备新型阿司匹林ARGGLYASPVALARGDV缀合物。下面是该缀合物ARGDV的结构式。00070008本发明的第二个内容是提供一种制备ARGDV的方法，该方法包括00091采用液相合成方法，通过逐步接肽分别合成ARGGLY的保护中间体和ASPVAL的保护中间体；00102脱去ARGGLY的保护中间体的C端保护基；00113脱去ASPVAL的保护中间体的N端保护基；00124。

9、把N端游离的ASPVAL的保护中间体和C端游离的ARGGLY保护中间体偶联得到ARGGLYASPVAL的保护中间体；00135脱去ARGGLYASPVAL的保护中间体的N端保护基；00146把N端游离的ARGGLYASPVAL保护中间体和阿司匹林偶联得到ARGDV的保护中间体；00157把ARGDV的保护中间体脱去保护基，得到ARGDV。0016其中，所述的N端保护基是对多肽的N端进行保护时常用的保护基团，例如可以是叔丁氧羰基BOC，所述的C端保护基是对多肽的C端进行保护时常用的保护基团，例如可以是苄氧基OBZL。以上所述的液相合成中间体并加以保护的方法是本领域的常规并公知的技术。0017本发。

10、明的第三个内容是用透射电子显微镜TEM，扫描电子显微镜SEM和原子力显微镜AFM测定ARGDV的纳米结构。通过ROESY2DNMR图谱，ESLMS图谱和介观理论计算，考察ARGDV形成纳米颗粒的机理。0018本发明的第四个内容是研究ARGDV与GPIIB/IIIA和COX1的相互作用，说明ARGDV在血液中保持缀合物分子的完整性，在血栓中释放阿司匹林，以及显示的靶向抗血栓作用。附图说明0019图1阿司匹林ARGGLYASPVALARGDV的合成路线图。I二环己基羰二亚胺DCC，N羟基苯并三氮唑HOBT，N甲基吗啉NMM；IINAOH1M；III氯化氢乙酸乙酯6M；IVH2和PD/C。0020图。

11、2ARGDV的1HNMR图谱。说明书CN104211763A3/8页50021图3ARGDV的ROESY2DNMR图谱和4个相关峰。相关峰1表示ARGDV的构造，相关峰24表示ARGDV的分子间聚集。0022图4ARGDV的ESIMS图谱。0023图5左图为ARGDV的透射电镜照片，右图为ARGDV的扫描电镜照片。0024图6ARGDV的原子力显微镜照片。AARGDV在水中的原子力显微镜照片；B大鼠血浆的原子力显微镜照片；CARGDV在大鼠血浆中的原子力显微镜照片。0025图7ARGDV形成四聚体从而形成纳米结构组图。0026图8ARGDV在大鼠血浆中孵育30MIN后的ESIMS图谱。0027。

12、图9ARGDV加GPIIB/IIIA在水中孵育30MIN后的ESIMS图谱。0028图10ARGDV加COX1在水中孵育30MIN后的ESIMS图谱。0029图11不同剂量阿司匹林，RGDV和不同剂量ARGDV的体内抗血栓活性。0030图12ARGDV对GPIIB/IIIA表达水平的影响。具体实施方式0031为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。0032实施例1制备BOCARGNO2GLYOBZL0033将100G313MMOLBOCARGNO2用100ML无水四氢呋喃THF溶解，冰浴冷却，向得到的溶液。

13、中加入43G313MMOLN羟基苯并三氮唑HOBT和64G313MMOL二环己基羰二亚胺DCC，将此反应液冰浴下搅拌10MIN。加入106G313MMOLTOSGLYOBZL和35G313MMOLN甲基吗啉NMM，室温搅拌24H。反应混合物过滤，滤除二环己基脲DCU。滤液减压浓缩，残留物用150ML乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5NAHCO3水溶液洗，饱和NACL水溶液洗，5KHSO4水溶液洗和饱和NACL水溶液洗。有机相用无水NA2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，残留物经柱层析纯化氯仿/甲醇，301，得到1284G88油状标题化合物。ESIMSM/E467MH。0034实施例2制备BOC。

14、ARGNO2GLY0035将1185G254MMOLBOCARGNO2GLYOBZL溶解在50ML甲醇中，冰浴冷却，加入12ML氢氧化钠甲醇溶液1M，搅拌1小时，反应液用2M盐酸中和至PH7，减压浓缩除去甲醇，残留物用2M盐酸酸化至PH2，减压浓缩除去水。残留物用100ML乙酸乙酯溶解。得到的溶液用饱和NACL水溶液洗。有机相用无水NA2SO4干燥，过滤，滤液减压浓缩至干。加少量石油醚将残留物研磨成89G93标题化合物，直接投下步反应。ESIMSM/E377MH。0036实施例3制备BOCASPOBZLVALOBZL0037按照实施例1的方法由77G237MMOLBOCASPOBZL和90G2。

15、37MMOLTOSVALOBZL制得107G89油状标题化合物。ESIMSM/E513MH。0038实施例4制备ASPOBZLVALOBZL0039将107G209MMOLBOCASPOBZLVALOBZL溶解在100ML氯化氢乙酸乙酯溶液6M中，冰浴下搅拌反应2H，TLC氯仿/甲醇，51监测反应。减压浓缩，残留物加100ML乙酸乙酯溶解，水泵抽干以除去游离HCL，重复3次。加100ML乙醚将残留物研磨得说明书CN104211763A4/8页6标题化合物，直接投下步反应。ESIMSM/E413MH。0040实施例5制备BOCARGNO2GLYASPOBZLVALOBZL0041按照实施例1的方。

16、法由89G235MMOLBOCARGNO2GLY和97G235MMOLASPOBZLVALOBZL制得159G88标题化合物，为无色粉末。ESIMSM/E771MH。0042实施例6制备ARGNO2GLYASPOBZLVALOBZL0043按照实施例4的方法由20G26MMOLBOCARGNO2GLYASPOBZLVALOBZL制得17G96标题化合物，为无色粉末。ESIMSM/E671MH。0044实施例7制备N2乙酰氧基苯甲酰基ARGNO2GLYASPOBZLVALOBZL0045按照实施例1的方法由322MG18MMOL阿司匹林和12G18MMOLARGNO2GLYASPOBZLVALO。

17、BZL制得262MG21标题化合物，为无色粉末。MP62；D25391C025，CH3OH。ESIMSM/E791M42H。IRKBR3277，2939，2868，1734，1639，1603，1544，1492，1456，1367，1303，1234，1207，1026，995，756，663。1HNMR300MHZ，DMSOD6886M，1H，853S，1H，839T，J54HZ，J54HZ，1H，827D，J66HZ，1H，818D，J81HZ，1H，795D，J75HZ，1H，743S，1H，733M，10H，692M，2H，507M，4H，478M，1H，456M，1H，417M，1。

18、H，374M，2H，317M，2H，274M，1H，258M，1H，205M，1H，179M，2H，156M，2H，083D，J66HZ，6H。13CNMR125MHZ，DMSOD6/PPM17201，17193，17147，17103，17101，17023，16921，16919，16912，16810，16798，15917，13646，13627，13401，12958，12886，12884，12856，12848，12843，12831，11933，11928，11756，11747，11673，11668，7962，6641，6617，5817，5307，5301，4956，49。

19、46，4238，4227，4224，3667，3664，3024，2966，1932，1856。0046实施例8制备N2乙酰氧基苯甲酰基ARGGLYASPVALARGDV0047将200MG02MMO1N2乙酰氧基苯甲酰基ARGNO2GLYASPOBZLVALOBZL溶解在25ML甲醇中，加入10GPD/C，搅拌混悬。002MBA氢气环境中反应5H至反应完成。制得131MG90标题化合物，为无色粉末。MP71；D25196C01，H2O。ESIMSM/E565M42H。IRKBR3350，2964，2937，1660，1639，1597，1533，1496，1454，1373，1307，123。

20、4，1161，1026，756。1HNMR300MHZ，DMSOD6975S，1H，895D，J66HZ，1H，879D，J81HZ，1H，869M，1H，824S，2H，797D，J75HZ，1H，738T，J72HZ，J72HZ，1H，721D，J84HZ，2H，689M，2H，456M，1H，441M，1H，403M，2H，358M，1H，342M，2H，318S，1H，302S，1H，257M，1H，239M，1H，205M，2H，181M，2H，157M，2H，111M，4H，083D，J66HZ，6H。13CNMR75MHZ，DMSOD6/PPM17479，17365，17250，。

21、17093，16906，16806，16783，16442，15989，15932，15920，15782，13390，12974，11916，11761，11690，6535，6327，5800，5649，5310，5036，4278，3749，3092，3039，2519，1953，1900，1822，1561。0048实验例1ROESY2DNMR与ARGDV的分子内和分子间相互作用0049将ARGDV用氘代DMSO溶解，800MHZ核磁共振仪上测得ROESY2DNMR谱图3，用以支持分子间和分子内的相互作用能促使ARGDV形成纳米粒子。如图3，标出了4个相关峰。相关峰1表示阿司匹林上的乙。

22、酰基甲基H和精氨酸上的胍基H的距离相关峰说明书CN104211763A5/8页71表明精氨酸上的胍基H和阿司匹林上的乙酰基O可能形成氢键，ARGDV的阿司匹林精氨酸部分能形成一个环状结构。相关峰2表示天冬氨酸的羧基氢和精氨酸的胍基氢相关。相关点3表示阿司匹林苯环上对位氢和天冬氨酸的羧基氢相关。相关峰4表示缬氨酸的甲基氢和精氨酸侧链的和CH2的氢相关。这些相关峰表明，一个分子的苯环H到另一个分子的肽链H的距离和一个分子的肽链H到另一个分子的肽链H的距离都这些H靠近既反映了ARGDV分子间相互接近的立体化学关系，也反映了ARGDV分子间相互接近的立体化学关系来自分子间缔合。0050实验例2ESIM。

23、S谱图支持ARGDV以四聚体存在于溶液中0051将ARGDV溶于水进行质谱测试，ESIMS高分辨谱图如图4。右上角放大图显示质荷比为226145306的离子峰表示4个ARGDV失去乙酰基同时加H。意味着ARGDV在水中以四聚体存在。质谱图还给出了质荷比为169773621，113145904和56611528的离子峰，它们分别对应3个ARGDV失去乙酰基同时加H，2个ARGDV失去乙酰基同时加H，1个ARGDV失去乙酰基同时加H。可见，在高分辨质谱条件下ARGDV的四聚体溶液裂解丢失乙酰基，并释放三聚体，二聚体和单体。在这些离子峰中，二聚体的峰最高。0052实验例3ARGDV的透射电镜和扫描电。

24、镜照片00531制样0054配制ARGDV的水溶液，调PH72，将此溶液滴在铜网上，再滴一滴无水甲醇促进溶剂挥发。挥干溶剂后在透射电镜TEM下观察其纳米形态。0055将ARGDV溶于超纯水12MM，冻干。用双面胶将冻干粉粘在铜板上，扫描电镜SEM下观察。00562实验结果0057ARGDV在PH72的水溶液中能形成直径为5175NM的纳米球，90以上的纳米颗粒的直径小于50NM。这种尺寸既能使纳米颗粒避开巨噬细胞吞噬，也有利于纳米颗粒中的ARGDV在血液循环中转运。0058SEM下观察ARGDV的固体形态，为长214M的椭球。在粉线标识的固体颗粒表面能看到一些小点，暗示这些颗粒是由一些小颗粒构。

25、成的。由SEM照片不难想象，在水中这些颗粒能分散成之前提到的尺寸的纳米颗粒。图5左为ARGDV的TEM照片，图5右为ARGDV的SEM照片。0059实验例4ARGDV在大鼠血浆中的原子力显微镜照片00601制样0061将ARGDV溶于水或大鼠血浆中，配制成80107M的浓度，调PH72。00622实验结果0063拍摄ARGDV在大鼠血浆中的原子力显微镜AFM照片如图6，用以了解ARGDV在血液中的纳米特征。如图6所示，在水中和大鼠血浆中，ARGDV呈直径约为50NM的纳米颗粒，然而单纯大鼠血浆的照片没有观察到相似的纳米结构。这些观察结果表明，即便在大鼠血浆中，ARGDV的纳米粒仍然稳定，能够在。

26、血液循环中完整地转运。0064实验例5ARGDV四聚体形成纳米颗粒的过程0065通过计算机辅助的分子动力学方法，模拟了ARGDV的优势构象。用系统搜索方法产生30个构象，用BEST方法产生195个构象。生成的这225个构象通过可视化的检测，符说明书CN104211763A6/8页8合ROESY2DNMR图谱上相关峰1并选出有最低自由能的构象。为满足结构要求，分子间氢键相互作用通过ROESY2DNMR图谱上相关峰24规定，ESIMS谱图上226063965离子峰说明4个分子应该在附近并形成一个四聚体。通过计算机辅助的介观模拟软件使用四聚体作为构造块，构建纳米颗粒。发现，形成一个直径为5NM的纳米。

27、颗粒需要24个四聚体。图5和图7D，7E，7G所示，ARGDV形成的最小的纳米颗粒的直径为5NM。因此，最小的纳米颗粒包含24个ARGDV四聚体。0066实验例6ARGDV在血栓中释放阿司匹林00671制样0068大鼠眼框取血，往血样中加38柠檬酸钠水溶液或不加38柠檬酸钠水溶液。往200L血样中加50LARGDV水溶液3M或不加50LARGDV水溶液3M。血液凝固后，不含38柠檬酸钠溶液的样品在37孵育30MIN。离心10MIN，转速10000R/M。将不含38柠檬酸钠的血样形成的血栓磨碎，离心10MIN，转速10000R/M。取10L进样。00692实验结果0070用ESIMS检测ARGD。

28、V在血浆和血栓中的变化，考察RGDV是否能作为阿司匹林的载体，谱图见图8。图8A2表明，ARGDV在大鼠血浆中孵化30MINESIMS谱只给出ARGDV的离子峰60623637，没有发现RGDV自身的离子峰44425338。另一方面，不含ARGDV大鼠血浆的ESIMS谱图8A1也没有类似的离子峰。可见，ARGDV在大鼠血浆中孵化30MIN不释放阿司匹林。图8B2表示ARGDV在大鼠血栓中孵化30MIN，ESIMS谱给出ARGDV60623637，RGDV44425338和阿司匹林二聚体加C139513477的离子峰。可见，在大鼠血浆中孵化30MIN，ARGDV会释放阿司匹林。另一方面，不含AR。

29、GDV的大鼠血栓的ESIMS谱图8B1上没有类似的峰。0071实验例7与GPIIB/IIIA的相互作用导致ARGDV释放阿司匹林00721制样0073制备ARGDV的水溶液100G/ML，GPIIB/IIIA的水溶液04G/ML，ARGDV和GPIIB/IIIA的混合水溶液100G/ML和04G/ML37下孵化30MIN。各取10L进样。00742实验结果0075众所周知，在被激活血小板的表面存在RGD序列的受体GPIIB/IIIA。用ESIMS谱检测GPIIB/IIIA对ARGDV释放阿司匹林的影响，谱图如图9。在GPIIB/IIIA自身的ESIMS谱图9A中没有与ARGDV，RGDV及阿司。

30、匹林有关的离子峰。而在ARGDV加GPIIB/IIIA的ESIMS谱图9B中存在ARGDV60623637，ARGDV裂解乙酰基56424836，强度为6107和RGDV44422655的离子峰。存在RGDV的离子峰，表明GPIIB/IIIA和ARGDV的相互作用导致ARGDV释放了阿司匹林。0076实验例8与COX1的相互作用导致ARGDV转移乙酰基00771制样0078制备COX1的水溶液22G/ML，ARGDV的水溶液100G/ML，ARGDV和COX1的混合水溶液100G/ML和22G/ML37下孵化30MIN。各取10L进样。00792实验结果0080众所周知，环氧合酶1COX1是促。

31、使花生四烯酸产生前列腺素G2的关键酶。用说明书CN104211763A7/8页9ESIMS谱检测COX1与ARGDV的作用，如图10。在COX1的ESIMS图谱图10A中没有发现与ARGDV，RGDV和阿司匹林有关的离子峰，在ARGDV加COX1的ESIMS谱图10B中只存在ARGDV丢失乙酰基56424803的离子峰。在ARGDV自身的ESIMS谱图10C中，同时存在ARGDV60623637和ARGDV丢失乙酰基56424803的离子峰。可见，ARGDV与COX1的相互作用导致ARGDV彻底消失。很明显，这与ARGDV向COX1转变乙酰基有关。0081实验例9ARGDV体外抗血小板聚集活性。

32、实验00821配液0083血小板聚集诱导剂均来源于SIGMA公司均用生理盐水NS溶解，二磷酸腺苷ADP，浓度500MOL/ML，花生四稀酸AA，浓度74MG/ML，凝血酶TH，浓度15U/ML。ARGDV，RGDV，阿司匹林用NS配成浓度为104M的溶液。00843实验方法0085猪颈动脉取血，用经硅烷化处理的血清瓶收集，预先按10的比例加入38枸橼酸钠溶液抗凝，37下保存。将新鲜猪全血迅速以1000R/MIN的转速离心10MIN，收集上清液即为富血小板血浆PRP。剩下的全血1500R/MIN离心10MIN，收集上清液即为贫血小板血浆PPP。PRP与PPP均保存在37下。在血小板聚集仪上测定A。

33、DP，TH和AA为诱导剂诱导的血小板聚集。每个测量平行6次。0086表1为RGDV，阿司匹林，ARGDV对ADP，TH，AA诱导的血小板聚集作用的影响。数据说明，阿司匹林和RGDV不能抑制TH和AA诱导的血小板聚集，ARGDV抑制TH和AA诱导的血小板聚集的能力明显高于阿司匹林和RGDV。ARGDV抑制ADP诱导的血小板聚集的能力低于RGDV。ARGDV选择性地抑制AA诱导的血小板聚集，比RGDV高出23倍。0087表1RGDV，阿司匹林，ARGDV对ADP，TH和AA诱导的血小板聚集的抑制率008800890090实验例10ARGDV的体内抗血栓活性实验00911分组，剂量及配液0092阳性。

34、对照组阿司匹林167MOL/KG，167MOL/KG；试验组RGDV100NMOL/KG，ARGDV1NMOL/KG，01NMOL/KG，001NMOL/KG；空白对照为生理盐水。麻醉剂为乌拉坦20G/100ML，7ML/KG，腹腔注射。抗凝剂为肝素钠50IU/ML。以上均用生理盐水配制。00932实验动物0094WISTER大鼠，255302G，每组12只。00953制备旁路0096旁路插管为硅烷化过的聚乙烯胶管，分三段，中段为聚乙烯胶管，长60CM，内径说明书CN104211763A8/8页1035MM；两端为相同的聚乙烯管，管长100CM，内径10MM，外径20MM，该管的一端拉成尖管用。

35、于插入大鼠颈动脉或静脉外径为10MM。欲插大鼠颈动脉的一端套上一根充满肝素钠生理盐水溶液的注射器，将旁路中充满肝素钠，同时保证注射器中还留有足够的肝素钠。00974实验方法0098麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉和左颈总静脉，结扎颈总动脉远心端，结扎颈总静脉远心端，剪一小口，将一根充满肝素钠生理盐水溶液的聚乙烯管插入颈总静脉并固定，按1ML/KG的剂量推注肝素钠生理盐水溶液。拔下肝素钠注射器，换上吸有计算量药液的药液注射器，将药品缓缓推入大鼠体内。用动脉夹夹住颈总动脉近心端，在颈总动脉远心端剪一小口，将聚乙烯管另一端插入颈总动脉并固定。松开动脉夹，血流从右侧颈总动脉经聚乙烯管流入左侧颈总静脉。

36、，形成旁路循环。15MIN后小心取出取出丝线，在滤纸上轻轻蘸掉血滴，精确称重并记录血栓湿重。统计各组的血栓湿重并做T检验。00995实验结果0100167MOL/KG阿司匹林和100NMOL/KGRGDV无抗栓活性。01和1NMOL/KGARGDV有明显的抗栓活性，且抗栓活性存在剂量依赖性。阿司匹林的无效剂量167MOL/KG是ARGDV的有效剂量01NMOL/KG的16700倍。图11表示，不同剂量阿司匹林，RGDV和不同剂量ARGDV的体内抗栓活性。实验结果说明，ARGDV具有优秀的抗栓活性，这与它能靶向定位于被激活的血小板，释放阿司匹林作用于被激活的血小板，同时能抑制血栓形成有关。010。

37、1实验例11ARGDV对GPIIB/IIIA表达水平的影响01021实验方法0103大鼠取血，按1/9的比例加入38柠檬酸钠水溶液，迅速离心160G，15MIN，收集富血小板血浆PRP。往600LPRP中加入5400L稀释液，制得PRP样品。往960LPRP中加入浓度为04MM的ARGDV或RGDV的NS溶液20L，37孵育5MIN，加入20L浓度为015MG/ML的AA的NS溶液，37孵育3MIN。以上作为ARGDV或RGDV处理PRP的受试样品。往960LPRP中加入20LNS溶液，37孵育5MIN，然后加入20L浓度为015MG/ML的AA的NS溶液，37孵育3MIN作为空白对照。往包被。

38、了酶的空白孔和受试孔中分别加入50LNS处理过的PRP和50LNS处理过的PRP。将板在37孵育30MIN后，弃去孔中试剂，用300L洗剂清洗5次，每次300L。往空白孔中加入50LNS，往受试孔中加入50L酶标记液。将板在37孵育30MIN后，弃去孔中试剂，用300L洗剂清洗5次，每次300L。往各孔中依次加入50L染色剂A和50L染色剂B，37避光轻轻混合并染色15MIN。往各孔中加入50L终止剂终止染色10MIN。450NM波长下测得各孔OD值，根据标准曲线计算GPIIB/IIIA的表达水平。测试前样品可在20保存不超过10天。01042实验结果0105用ELISA试剂盒检测RGDV和A。

39、RGDV处理过的血小板的GPIIB/IIIA的表达水平，考察RGDV对ARGDV与GPIIB/IIIA受体相互作用的影响，结果如图12。04MM浓度下RGDV和ARGDV都显著抑制了GPIIB/IIIA表达。另一方面，ARGDV的抑制活性显著高于RGDV。该比较说明，GPIIB/IIIA同时是RGDV和ARGDV的受体，阿司匹林和RGDV的缀合物明显增强了RGDV和GPIIB/IIIA的相互作用。说明书CN104211763A101/6页11图1说明书附图CN104211763A112/6页12图2说明书附图CN104211763A123/6页13图3图4说明书附图CN104211763A134/6页14图5图6图7说明书附图CN104211763A145/6页15图8图9图10说明书附图CN104211763A156/6页16图11图12说明书附图CN104211763A16。