《热敏纳米颗粒制剂及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《热敏纳米颗粒制剂及其制备方法.pdf（29页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104203216A43申请公布日20141210CN104203216A21申请号201380014896222申请日2013021561/600,41820120217USA61K9/12720060171申请人效思因公司地址美国新泽西72发明人RA里德苏大水74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人李华英54发明名称热敏纳米颗粒制剂及其制备方法57摘要本发明涉及一种热敏脂质体制剂，更特别地涉及一种包含磷脂和表面活性剂的脂质体制剂，其中所述脂质体支持在低于或等于约8的温度下长期储存，控制降解物形成以最大化产品效价，并且在温和的较高温度下释放它们的。
2、包含物。还描述了制备制剂的方法。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014091886PCT国际申请的申请数据PCT/US2013/0264532013021587PCT国际申请的公布数据WO2013/123407EN2013082251INTCL权利要求书3页说明书14页附图11页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书14页附图11页10申请公布号CN104203216ACN104203216A1/3页21脂质体制剂，其包含脂质体的悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和包埋在所述脂质体内的活性剂；所述脂质双层包含I一种或多种磷脂，选自磷脂酰胆碱、磷脂。
3、酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；II一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和III一种或多种溶解脂质，选自单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基乙醇胺；其中所述活性剂选自多柔比星、博来霉素、达卡巴嗪、柔红霉素、更生霉素、氟达拉滨、吉西他滨、伊达比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱、长春瑞滨和长春新碱，并且其中所述脂质双层成分是以约809028218的摩尔比提供；并且其中该悬浮液中脂质体大小在约50和约150NM之间。2权利要求1的脂质体制剂，其中所述活性剂为多柔比星，并且其中在低于或等于8下储存6个月之后杂质A的相对浓度低于05，并且其中杂质A为在高效液相。
4、色谱HPLC中相对保留时间为约14的峰，所述高效液相色谱使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件。3权利要求2的脂质体制剂，其中在低于或等于8下储存6个月之后杂质A的相对浓度低于02。4权利要求2的脂质体制剂，其中在低于或等于8下储存约一年之后杂质A的相对浓度低于约05。5权利要求2的脂质体制剂，其中在低于或等于8下储存约2年之后杂质A的相对浓度低于约075。6权利要求2的脂质体制剂，其中在低于或等于8下储存6个月之后8脱乙酰基8羧基柔红霉素的相对浓度低于约05。7权利要求2的脂质体制剂，其中在低于或等于8下储存约一年之后8脱乙酰基8羧基柔红霉素的相对浓度低于约05。8权利要求2的脂质体制。
5、剂，其中在低于或等于8下储存约2年之后8脱乙酰基8羧基柔红霉素的相对浓度低于约16。9权利要求2的脂质体制剂，其中在约低于或等于8的温度下储存约六个月之后多柔比星的浓度为大于初始多柔比星浓度的99，如通过HPLC使用C18尺寸排阻柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。10权利要求2的脂质体制剂，其中在约低于或等于8的温度下储存约一年之后多柔比星的浓度为大于初始多柔比星浓度的97，如通过HPLC使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。11权利要求2的脂质体制剂，其中在约低于或等于8的温度下储存约两年之后多柔比星的浓度为大于初始多柔比星浓度的95，如通过HPLC使用C18反相柱与乙酸/。
6、甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。12权利要求2的脂质体制剂，其中在约低于或等于8的温度下储存约六个月之后总降解产物的形成低于1。13权利要求2的脂质体制剂，其中在约低于或等于8的温度下储存约一年之后总降解产物的形成低于1。权利要求书CN104203216A2/3页314权利要求2的脂质体制剂，其中在约低于或等于8的温度下储存约两年之后总降解产物的形成低于25。15权利要求2的脂质体制剂，其中所述一种或多种磷脂为二棕榈酰基磷脂酰胆碱DPPC、二硬脂酰基磷脂酰甘油DSPG或其组合；所述溶解脂质为单棕榈酰基磷脂酰胆碱MPPC、单月桂酰基磷脂酰胆碱MLPC、单肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱MMPC、单硬脂酰基磷脂酰。
7、胆碱MSPC或其混合物；并且所述一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂为PEG化的脂质。16权利要求2的脂质体制剂，其中所述一种或多种磷脂为二棕榈酰基磷脂酰胆碱，一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂为1,2二硬脂酰基SN甘油基3磷酸乙醇胺N聚乙二醇2000，并且所述一种或多种溶解脂质为单硬脂酰基磷脂酰胆碱。17权利要求2的脂质体制剂，其中所述脂质体进一步包括显像剂或诊断剂。18权利要求17的脂质体制剂，其中所述显像剂或诊断剂包埋在脂质体中。19权利要求18的药物组合物，其中所述显像剂或诊断剂为X射线造影剂、MRI造影剂、超声显像剂、荧光剂或放射性试剂。20将活性剂负载到热敏脂质体中的方法，其包括A制。
8、备脂质体的悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和在该脂质体内部的浓度大于其在该脂质体外部的浓度的铵离子，所述脂质双层包含I一种或多种磷脂，选自磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；II一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和III一种或多种溶解脂质，选自单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基乙醇胺；其中所述脂质双层成分以约809028218的摩尔比提供；并且其中所述制备包括将悬浮液中脂质体大小减小至在约50和约150NM之间的平均粒度；B将活性剂的溶液加入到脂质体的悬浮液中，其中所述活性剂被吸收到所述脂质体中，其中所述活性剂选自多柔比星、博来霉素、达卡。
9、巴嗪、柔红霉素、更生霉素、氟达拉滨、吉西他滨、伊达比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱、长春瑞滨和长春新碱。21权利要求20的方法，其中所述活性剂是多柔比星。22权利要求21的方法，其中所述溶液中存在的至少95的多柔比星被吸收到脂质体中。23权利要求21的方法，其中被吸收到所述脂质体中的多柔比星的浓度为约50MM。24权利要求21的方法，其中被吸收到所述脂质体中的多柔比星的浓度为约75MM。25权利要求21的方法，其中所述制备包括在铵盐的存在下制备脂质体。26权利要求25的方法，其中所述铵盐是以硫酸铵溶液形式提供。27权利要求26的方法，其中所述硫酸铵的浓度为约100MM至约300MM。。
10、28权利要求26的方法，其进一步包括以单糖或二糖溶液替换所述脂质体外部的铵离子。29权利要求28的方法，其中所述单糖或二糖溶液的浓度为约515。权利要求书CN104203216A3/3页430权利要求29的方法，其中所述脂质体外部的铵离子被单糖溶液替换。31权利要求30的方法，其中所述单糖溶液为乳糖溶液。32权利要求21的方法，其进一步包括在步骤B之后添加组氨酸缓冲液。33权利要求32的方法，其中所述组氨酸缓冲液的浓度为约5MM至约15MM。34权利要求21的方法，其中所述一种或多种磷脂具有两个相同或不同的C14C20酰基。35权利要求34的方法，其中所述一种或多种磷脂为二棕榈酰基磷脂酰胆碱D。
11、PPC、二硬脂酰基磷脂酰甘油DSPG或其组合。36权利要求21的方法，其中所述溶解脂质为单棕榈酰基磷脂酰胆碱MPPC、单月桂酰基磷脂酰胆碱MLPC、单肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱MMPC、单硬脂酰基磷脂酰胆碱MSPC、或其混合物。37权利要求21的方法，其中所述一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂为PEG化的脂质。38权利要求37的方法，其中所述PEG化的脂质为1,2二硬脂酰基SN甘油基3磷酸乙醇胺N聚乙二醇2000。39权利要求21的方法，其中所述一种或多种磷脂为二棕榈酰基磷脂酰胆碱，一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂为1,2二硬脂酰基SN甘油基3磷酸乙醇胺N聚乙二醇2000，并且所述一种或多种溶解脂。
12、质为单硬脂酰基磷脂酰胆碱。40通过权利要求21的方法制备的脂质体制剂。权利要求书CN104203216A1/14页5热敏纳米颗粒制剂及其制备方法技术领域0001本发明涉及一种热敏脂质体制剂，更特别地涉及一种包含磷脂和表面活性剂的脂质体制剂，其中所述脂质体支持在低于或等于约8的温度下长期储存，控制降解物形成以最大化产品效价，并且在温和的体温过高HYPERTHERMIC温度下释放其包含物。还描述了制备制剂的方法。背景技术0002脂质体是由至少一个包封水性内部隔室的脂质双层膜组成。脂质体可以通过膜类型和尺寸表征。小单层囊泡SUV具有单层膜且直径通常介于002至025M之间；大单层囊泡LUV通常大于0。
13、25M。寡层大囊泡OLIGOLAMELLARLARGEVESICLE和多层大囊泡具有多个、通常同心的膜层，并且通常大于025M。具有几个非同心膜的脂质体，即包含在较大囊泡内的几个小囊泡，称为多囊囊泡。0003脂质体可以配制成载有治疗剂、药物或其它活性剂，所述治疗剂、药物或其它活性剂包含在水性内部空间水溶性活性剂或分布在脂质双层内水不溶性活性剂。脂质体也可以结合允许活性剂递送到特定目标位置的抗体或靶分子。将药物包囊在脂质体中1降低了药物的毒性，2避免了身体的防御，所述防御通常识别外源颗粒并且将它们作为靶标通过肝和脾的网状内皮系统RES除去，和3使该药物载体靶向于作用的治疗位置，并且一旦到达该位置。
14、，快速释放药物以便其可以作用于靶组织。进一步，可以通过将聚乙二醇脂质引入到脂质体膜而抑制脂质体被网状内皮系统RES的细胞从血液清除；这些脂质抑制标识供RES摄取的脂质体的蛋白质吸附。0004脂质体可以设计为不渗漏的，但是如果该脂质体膜中出现小孔，或者如果该膜变成液体例如，发生从固相或凝胶相到液相的相变，或者如果该膜降解或溶解，则变成可渗漏的。这样的渗透性分解可以通过施加电场电穿孔或将脂质体暴露于酶或表面活性剂而诱发。另一种方法包括使膜的温度升高至其由凝胶向液相转化温度附近的温度，此时似乎在部分液体和部分固体膜中的相边界区域的孔缺陷能增加水、离子和小分子的跨膜转运。临床上体温升高称为体温过高HY。
15、PERTHERMIA。该过程用于升高受试者的目标部位的温度，并且如果热敏脂质体可以递送到该目标部位，则该温度升高可以触发脂质体内含物的释放，引起治疗剂在目标部位的选择性递送和释放，如YATVIN等人,SCIENCE2041881979最初描述的。然而，该技术受到其中脂质体的相变温度高于大于37正常组织温度的条件的限制。0005体温过高引起多种生物学变化。综述参考ISSELSRDHYPERTHERMIAADDSTOCHEMOTHERAPY,EUROPEANJOFCANCER20084425462554。温和的体温过高范围3944内的温度调节局部的生理变化，比如血流量、血管系统渗透性和组织氧合作用。
16、增加。支持实体瘤的血管系统的结构混乱，且内衬微血管系统的内皮细胞没有密封在一起，通常导致多孔性POROUSQUALITY。体温过高引起异常肿瘤微血管系统中的孔径增加，因此增强纳米尺寸分子比如直径约100NM的脂质体外渗到说明书CN104203216A2/14页6肿瘤间质中BATESDA,MACKILLOPWJHYPERTHERMIA,ADRIAMYCINTRANSPORT,ANDCYTOTOXICITYINDRUGSENSITIVEANDRESISTANTCHINESEHAMSTEROVARYCELLS,CANCERRES19864654775481；NAGAOKAS,KAWASAKIS,SA。
17、SAKIK,NAKANISHITINTRACELLULARUPTAKE,RETENTIONANDCYTOTOXICEFFECTOFADRIAMYCINCOMBINEDWITHHYPERTHERMIAINVITROJPNJCANCERRES198677205211。为此，温和的体温过高选择性地对肿瘤细胞致死，抗肿瘤效果随温度升高而增加。0006热敏性脂质体将高浓度的化疗剂运载至实体瘤，支持血管系统，并且当加热时局部释放药物。体温过高选择性地提高脂质体摄取、脂质体渗透性、刺激局部药物释放、增加药物流入肿瘤细胞中、和增加药物结合肿瘤细胞DNA后者对于许多化疗剂的作用机制很重要。0007为了开始使用体。
18、温过高治疗深部肿瘤例如，前列腺、卵巢、结肠直肠和乳腺的肿瘤，因此，期望设计能够响应温和的体温过高条件即，在3945范围内的临床可得到的温度而递送治疗量的活性剂的脂质体制剂。0008美国专利NO6,726,925描述了对于周围环境温度的改变敏感的脂质体。该脂质体特别地载有多柔比星，一种批准且经常使用的治疗大量癌症的肿瘤药物。含有多柔比星的脂质体制剂是静脉内给药的，并且与体温过高组合可以提供局部肿瘤控制和改善生活质量。局部温和的体温过高39545摄氏温度从脂质体释放包埋的多柔比星。该递送技术使得高浓度的多柔比星优选地沉积在目标肿瘤中。美国专利NO7,901,709描述了一种用于热活化多柔比星的脂质。
19、体包囊的方法。0009公布的国际申请NOWO2007/024826描述了一种储存脂质体或纳米颗粒制剂的方法，其包括冷冻这样的制剂。所述制剂描述了储存具有增强的稳定性和储存特性的脂质体的方法。0010使体温过高活化的脂质体药物制剂有效所需的关键设计原理是1接近完全包囊活性剂，以使该药物在体循环中与脂质体结合，2设计成在正常体温37下保留药物且在温和的体温过高温度即4143下释放药物的膜，3膜组合物和粒度，其能使脂质体保持在体循环中足够长时间以允许应用加热模态触发药物释放至其目标，和4脂质体尺寸，其允许脂质体穿过渗漏性肿瘤微血管系统从血流外渗而使化疗药物靶向于肿瘤部位。0011本发明人发现关于多柔。
20、比星的脂质体制剂例如美国专利NO7,901,709中公开的一个另外的重要设计问题是多柔比星复合物共晶体或盐的形成对于最终药物产品稳定性的稳定作用。成功控制降解速率将导致对药物产品的储存温度和长期稳定性的显著影响。两种感兴趣的降解产物为8脱乙酰基8羧基柔红霉素和杂质A。0012本发明解决了多柔比星脂质体制剂中药物降解产生柠檬酸盐复合物共晶体或盐的长期存在的问题。已经发现柠檬酸盐复合物在多柔比星不稳定性和降解物形成方面起重要作用。更具体地，8脱乙酰基8羧基柔红霉素和杂质A的形成可以通过将柠檬酸盐复合物的形成改变成硫酸盐复合物共晶体或盐的形成而显著减少。另外，本发明保持了上述对于含有活性剂的有效的体。
21、温过高活化的脂质体制剂的关键设计原理。发明内容说明书CN104203216A3/14页70013在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含脂质体的悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和包埋在该脂质体内的多柔比星；所述脂质双层包含0014I一种或多种磷脂，选自磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；0015II一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和0016III一种或多种溶解脂质LYSOLIPID，选自单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基乙醇胺；0017其中所述脂质双层成分是以IIIIII为约809028218的摩尔比提供；其中该悬浮液中脂质体具有。
22、约50至约150NM之间的平均粒度，0018其中在约低于或等于8下储存6个月之后杂质A的相对浓度低于05，并且其中杂质A为当使用高效液相色谱HPLC进行分离时具有约14的相对保留时间的峰，所述高效液相色谱使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱缓冲液。0019在另一个方面，本发明提供一种将多柔比星负载到热敏脂质体的方法，其包括0020A制备脂质体的悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和在该脂质体内部的浓度大于其在该脂质体外部的浓度铵离子，所述脂质双层包含0021I一种或多种磷脂，选自磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；0022II一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和0023I。
23、II一种或多种溶解脂质，选自单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基乙醇胺；0024其中所述脂质双层成分以IIIIII为约809028218的摩尔比提供；并且0025其中所述制备包括将悬浮液中脂质体大小减小至在约50和约150NM之间的平均粒度；0026B将多柔比星的溶液加入到脂质体的悬浮液中，其中所述多柔比星被吸收到所述脂质体中。0027在另一个方面，本发明包括通过上述方法制备的脂质体制剂。0028在另一个方面，本发明包括包含多柔比星和显像剂的脂质体制剂。在仍然另一个方面，本发明包括包含多柔比星和另一种药物的脂质体制剂。0029本发明的这些及其它方面和优点为下文详。
24、细描述的。附图说明0030图1图解表示含有二棕榈酰基磷脂酰胆碱DPPC作为磷脂、1,2二硬脂酰基SN甘油基3磷酸乙醇胺N聚乙二醇2000DSPEMPEG和单硬脂酰基磷脂酰胆碱MSPC作为溶解脂质的双层膜的脂质体。指示出溶解脂质单体的定向及其存在于该脂质双层的内层和外层中。0031图2为铵负载的多柔比星脂质体的制备方法的示意图。0032图3为通过挤压法形成的NH4负载的多柔比星脂质体的粒度分布。0033图4描绘使用本领域已知的方法制备的PH负载的脂质体的差示扫描量热法图表说明书CN104203216A4/14页8扫描速率2/分钟。0034图5描绘本发明的NH4负载的脂质体的差示扫描量热法图表扫描。
25、速率2/分钟。0035图6描绘根据本领域已知的方法制备的PH负载的脂质体的穿隧型电子显微镜照片。0036图7描绘根据本发明制备的NH4负载的脂质体的穿隧型TUNNELING电子显微镜照片。0037图8显示基于PH负载的和NH4负载的脂质体的溶液温度的多柔比星释放曲线的比较。0038图9A和9B显示分别在PH负载的和NH4负载的多柔比星脂质体中8脱乙酰基8羧基柔红霉素和杂质A的水平的比较。“A”和“B”条指示使用源自不同供应商的赋形剂制备的制剂的杂质水平。图9A和9B也显示三个重复运行的根据本发明制备的NH4负载的多柔比星脂质体的杂质8脱乙酰基8羧基柔红霉素和杂质A的水平。0039图10显示在2。
26、8下长时间储存时在PH负载的和NH4负载的多柔比星脂质体中多柔比星的水平。0040图11显示在28下长时间储存时在PH负载的和NH4负载的多柔比星脂质体中降解物生长的水平。0041图12显示在20下长时间储存时在PH负载的和NH4负载的多柔比星脂质体中多柔比星的水平。0042图13显示在20下长时间储存时在PH负载的和NH4负载的多柔比星脂质体中降解物生长的水平。0043发明详述0044现在，将参照本文给出的实施方案和附图来描述本发明。这些实施方案仅仅是用于举例说明的目的，不应当解释为如权利要求所定义的限制本发明。0045在一个方面，本发明提供一种脂质体的制剂，其包含脂质体悬浮液，所述脂质体具。
27、有凝胶相脂质双层和包埋在该脂质体内的活性剂；所述脂质双层包含0046I一种或多种磷脂，选自磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；0047II一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和0048III一种或多种溶解脂质，选自单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基乙醇胺；0049其中所述活性剂选自多柔比星、博来霉素、达卡巴嗪、柔红霉素、更生霉素、氟达拉滨、吉西他滨、伊达比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱、长春瑞滨和长春新碱，并且0050其中所述脂质双层成分是以约809028218的摩尔比提供；并且其中该悬浮液中脂质体大小在约50和约150NM之间。00。
28、51在一个实施方案中，所述活性剂为多柔比星，并且在低于或等于8下储存6个月之后杂质A的相对浓度低于05，其中杂质A为在高效液相色谱HPLC中相对保留时间为约14的峰，所述高效液相色谱使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件。说明书CN104203216A5/14页90052在一个实施方案中，在低于或等于8下储存6个月之后杂质A的相对浓度为低于约05、或低于04、或低于03、或低于02。在另一个实施方案中，在低于或等于8下储存一年之后杂质A的相对浓度为低于约05、或低于04、或低于03、或低于02。在另一个实施方案中，在低于或等于8下储存约2年之后杂质A的相对浓度为低于约1、075、05、或。
29、低于04、或低于03、或低于02。0053在一个实施方案中，在低于或等于8下储存6个月之后8脱乙酰基8羧基柔红霉素的相对浓度为低于约05、低于04、低于03或低于02。在另一个实施方案中，其中在低于或等于8下储存约一年之后8脱乙酰基8羧基柔红霉素的相对浓度为低于约05、低于04、低于03或低于02。在另一个实施方案中，在低于或等于8下储存约2年之后8脱乙酰基8羧基柔红霉素的相对浓度为低于约20、低于16、低于15、低于10、低于05、低于04、低于03或低于02。0054在一个进一步的实施方案中，在约低于或等于8的温度下储存150天之后多柔比星的浓度为初始多柔比星浓度的大于95、大于96、大于。
30、97、大于98、大于99或大于995，如通过HPLC使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。在另一个实施方案中，在约低于或等于8的温度下储存约六个月之后多柔比星的浓度为初始多柔比星浓度的大于95、大于96、大于97、大于98、大于99或大于995，如通过HPLC使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。在另一个实施方案中，在约低于或等于8的温度下储存约一年之后多柔比星的浓度为初始多柔比星浓度的大于95、大于96、大于97、大于98、大于99或大于995，如通过HPLC使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。在另一个实施方案中，在约低于或等于8的温度下储存约两年。
31、之后多柔比星的浓度为初始多柔比星浓度的大于95、大于96、大于97、大于98、大于99或大于995，如通过HPLC使用C18反相柱与乙酸/甲醇溶剂梯度洗脱条件测定的。0055在另一个实施方案中，本发明为一种药物组合物，其中在约低于或等于8的温度下储存150天之后形成的总降解产物为低于1、或低于05。在一个进一步的实施方案中，本发明是一种药物组合物，其中在约低于或等于8的温度下储存约六个月之后形成的总降解产物为低于1或低于05。在一个进一步的实施方案中，本发明是一种药物组合物，其中在约低于或等于8的温度下储存约一年之后形成的总降解产物为低于1或低于05。在一个进一步的实施方案中，本发明是一种药物。
32、组合物，其中在约低于或等于8的温度下储存约两年之后形成的总降解产物为低于25、低于1或低于05。0056在仍然另一实施方案中，脂质体悬浮在包含糖的缓冲液中。所述糖可以是单糖，比如乳糖，或二糖，比如蔗糖。在另一个实施方案中，所述缓冲液进一步包含组氨酸。0057在另一个方面，本发明提供一种将活性剂负载到热敏脂质体的方法，其包括0058A制备脂质体悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和在该脂质体内部的浓度大于其在该脂质体外部的浓度的铵离子，所述脂质双层包含0059I一种或多种磷脂，选自磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；0060II一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和0061III。
33、一种或多种溶解脂质，选自单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰说明书CN104203216A6/14页10基磷脂酰肌醇和单酰基磷脂酰基乙醇胺；0062其中所述脂质双层成分以IIIIII为约809028218的摩尔比提供；并且0063其中所述制备包括将悬浮液中脂质体大小减小至在约50和约150NM之间的平均粒度；0064B将活性剂的溶液加入到脂质体的悬浮液中，其中所述活性剂被吸收到所述脂质体中，0065其中所述活性剂选自多柔比星、博来霉素、达卡巴嗪、柔红霉素、更生霉素、氟达拉滨、吉西他滨、伊达比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱、长春瑞滨和长春新碱。0066在一个实施方案中，所述活性剂为。
34、多柔比星。在另一个实施方案中，溶液中存在的至少90、至少91、至少92、至少93、至少94、至少95、至少96、至少97、或至少98的多柔比星被吸收到脂质体中。0067在另一个实施方案中，被吸收到脂质体中的多柔比星的浓度为约1MM至约200MM，优选地约10至约65MM，最优选地约45MM至约55MM。在一个进一步的实施方案中，被吸收到脂质体中的多柔比星的浓度为约50MM。在另一个实施方案中，被吸收到脂质体中的多柔比星的浓度为约75MM。0068本发明的脂质体由选自磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺的磷脂组成。所述磷脂优选地具有在体温过高范围例如，约38至约45的范围的较低端的。
35、从固体或凝胶形式向液态的转变温度。更优选的是其酰基基团是饱和的磷脂。在一个实施方案中，所述一种或多种磷脂具有两个相同或不同的C14C20酰基，比如例如二棕榈酰基磷脂酰胆碱DPPC、二硬脂酰基磷脂酰甘油DSPG、或其组合。0069本发明的脂质体由一种或多种溶解脂质组成。在一个实施方案中，所述溶解脂质为单棕榈酰基磷脂酰胆碱MPPC、单月桂酰基磷脂酰胆碱MLPC、单肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱MMPC、单硬脂酰基磷脂酰胆碱MSPC、或其混合物。0070在本发明的一个实施方案中，最终脂质体制剂中脂质的总浓度为约1050MG/ML、约2050MG/ML、约3040MG/ML、约20MG/ML、约30MG/ML、。
36、或40MG/ML。在另一个实施方案中，所述脂质体制剂中多柔比星的浓度为约0240MG/ML、约0530MG/ML、约120MG/ML、约210MG/ML、约1MG/ML、约2MG/ML、约3MG/ML、约4MG/ML或约5MG/ML。在本发明的一个实施方案中，多柔比星与脂质的比例为00210、约005、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10。0071本发明的脂质体包括聚合物衍生的脂质以减少被RES摄取的脂质体，从而增加脂质体的循环时间。合适的聚合物包括亲水性聚合物，比如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、低。
37、聚糖、以及上述的混合物。在一个实施方案中，所述一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂为聚乙二醇衍生的PEG化的脂质。优选地，所述PEG化的脂质为1,2二硬脂酰基SN甘油基3磷酸乙醇胺N聚乙二醇2000。0072在一个实施方案中，本发明提供一种使脂质体负载活性剂的方法，所述活性剂为博来霉素、达卡巴嗪、柔红霉素、更生霉素、氟达拉滨、吉西他滨、伊达比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春碱、长春瑞滨或长春新碱。说明书CN104203216A107/14页110073在一个实施方案中，所述制备包括在铵盐以硫酸铵溶液提供的存在下制备脂质体。在一个实施方案中，所述溶液中硫酸铵的浓度为约100MM至约300MM。
38、，优选约200MM。0074在另一个实施方案中，所述铵盐以如下酸的盐提供己二酸、L抗坏血酸、L天门冬氨酸、柠檬酸、富马酸、谷氨酸、戊二酸、马尿酸、盐酸、D,L乳酸、马来酸、L苹果酸、磷酸、琥珀酸、或L酒石酸。在一个进一步的实施方案中，所述溶液中的铵盐为约100MM至约300MM，优选约200MM。0075脂质体外部的铵离子被单糖或二糖溶液替代。在一个进一步的实施方案中，所述单糖或二糖溶液的浓度为约515，优选约10。该替代或交换可以通过技术比如透析或渗滤进行。0076在一个进一步的实施方案中，在脂质体外部的铵离子被单糖溶液替代，比如例如乳糖溶液。在另一个实施方案中，在脂质体外部的铵离子被二糖溶。
39、液替代，比如例如蔗糖溶液。0077在一个实施方案中，在步骤B之后，将组氨酸缓冲液加入到脂质体制剂中。在一个进一步的实施方案中，组氨酸缓冲液的浓度为约5MM至约15MM，优选约10MM。0078根据本发明，制备脂质体制剂的方法包括在合适的有机溶剂中，0079以合适的比例混合双层组分。有用的溶剂包括氯仿、丙酮、甲醇或二氯甲烷。然后，蒸发溶剂以形成干燥的脂质膜。使用含有平衡量的溶解脂质和期望的活性剂例如多柔比星的水溶液，将该膜再水合在高于脂质混合物的相变温度的温度下。将在再水合之后形成的脂质体挤出形成期望尺寸的脂质体。例如，当制备由8020DPPCMSPC组成的脂质体时，在高于该特定脂质混合物的相变。
40、温度的温度高于39下进行再水合。用于再水合脂质膜的水溶液包括平衡量的溶解脂质单体例如，浓度等于MSPC的临界胶束浓度，约1微摩尔。0080建议的制备方法和控制的说明0081用于铵负载的制剂的大规模批次的制备方法描述如下。该方法可以用于制备各种规模批次的制剂，例如22000L规模批次。所建议的制备方法以示意图图解在图2中。0082逐步制备方法00831通过将合适量的硫酸铵溶于注射用水WFI中，接着进行生物负荷减少过滤BIOBURDENREDUCTIONLTRATION。缓冲液的摩尔浓度可以为例如200MM。00842在高温4570下，利用来自步骤1的硫酸铵缓冲液水合该脂质合适的时间段。例如，在6。
41、0下水合该脂质1小时。00853在高温下，通过具有特定孔径的滤膜挤出水合的混合物，以便获得期望尺寸的脂质体。例如，将该水合的脂质混合物在65下挤压穿过80NM的聚碳酸酯滤器，形成100NM的脂质体。00864对着糖类溶液例如10蔗糖溶液，交换非脂质体包埋的硫酸铵，接着通过预热的过滤器比如SARTOBRANP过滤器无菌过滤。00875通过将合适量的组氨酸HCL溶解在WFI中，接着无菌过滤来制备组氨酸HCL缓冲液，例如100MMPH6的组氨酸缓冲液。00886通过将合适量的多柔比星HCL溶于WFI中，接着无菌过滤，制备多柔比星HCL溶液，例如50MG/ML的浓度。说明书CN104203216A11。
42、8/14页1200897混合10份的无菌脂质体与08份的无菌多柔比星HCL溶液，并在35下温育4小时。00908加入02份无菌组氨酸缓冲液，并充分混合。0091在一个实施方案中，本发明是通过将多柔比星负载到热敏脂质体中的方法制备的脂质体的制剂，其包含0092A制备脂质体的悬浮液，所述脂质体具有凝胶相脂质双层和在该脂质体内部的浓度大于其在该脂质体外部的浓度的铵离子，所述脂质双层包含0093I一种或多种磷脂，选自磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、和磷脂酰乙醇胺；0094II一种或多种用亲水性聚合物衍生的磷脂；和0095III一种或多种溶解脂质，选自单酰基磷脂酰胆碱、单酰基磷脂酰甘油、单酰基磷脂酰。
43、肌醇和单酰基磷脂酰基乙醇胺；0096其中所述脂质双层成分以IIIIII为约809028218的摩尔比提供；和0097其中所述制备包括将悬浮液中脂质体大小减小至在约50和约150NM之间的平均粒度；0098B将多柔比星的溶液加入到脂质体的悬浮液中，其中所述多柔比星被吸收到所述脂质体中。0099已经报道了直径为005和03微米之间的脂质体适用于肿瘤给药ALLEN等人的美国专利NO5,527,528。根据本发明的脂质体大小分级可以根据本领域已知的方法进行，并且考虑其中所含的活性剂及所期望的效果参见，例如MARTIN等人的美国专利NO5,225,212；ALLEN等人的美国专利5,527,528，将其。
44、公开内容以整体通过引用并入本文。在本发明的一个优选的实施方案中，脂质体的直径为约005微米或约01微米，至直径为约03微米或约04微米。脂质体制剂可以包含不同尺寸大小的脂质体。有利地，这些脂质体包括本文所述脂质混合物，因此如所述的是热敏的、具有释放所包含药物的能力。0100在本发明的一个方面，脂质体制备成具有在所选择尺寸大小范围内基本上均匀的尺寸。一种有效的尺寸分级方法包括将脂质体的水性悬浮液挤出穿过一系列具有所选择的均匀孔径的聚碳酸酯膜；该膜的孔径将大致对应于挤出穿过所述膜所产生的脂质体的平均尺寸。参见例如美国专利NO4,737,323。0101在本发明的另一个优选的实施方案中，脂质体的直径。
45、为约50NM、100NM、120NM、130NM、140NM或150NM、至多约175NM、180NM、200NM、250NM、300NM、350NM、400NM或500NM。0102在一个实施方案中，本发明的脂质体制剂储存在低于或等于8、约2至约8、约80至约15、约30至约15或约15至约2的温度下。0103在另一个方面，所述脂质体制剂包括多柔比星和成像或诊断剂。由于许多原因，需要将显像剂包囊在脂质体中或包囊显像剂与治疗剂的组合物的能力。首先，活性剂的治疗效果将随着显影的显像剂的释放且因此推断药物释放的能力而提高。这可提供确定药物的组织渗透和浓度的工具。进一步，将药物与显像剂结合在脂质体中。
46、允许监测和定量药物随时间推移的释放、组织分布和药物清除。其次，携带和释放显像剂的脂质体将使得有机会预说明书CN104203216A129/14页13筛选患者。例如，选择患者人群可以确定为可能受益于基于肿瘤血管系统的“渗漏性”的治疗性脂质体。如使用显像剂显影的渗漏性是该活性剂外渗穿过微血管系统和任何纤维变性组织以达到和治疗肿瘤的能力的指示物。可以使用的显像剂或诊断剂的实例包括，但不限于X射线成像、磁共振成像MRI、超声成像或核医学成像的试剂。0104在X射线成像包括应用比如计算机断层扫描CT和数字式减影血管造影DSA中，对比度是基于电子密度的差异。在本发明的一个方面，脂质体制剂包含多柔比星和X射。
47、线造影剂。X射线造影剂通常是基于重元素，且包括可用于增强胃肠系统的显影的钡盐比如硫酸钡，和可用于胃肠系统的显影和肠胃外研究中的碘化造影剂。碘化的X射线造影剂包括，但不限于碘海醇、碘喷托、碘帕醇、碘克沙醇、碘普胺、碘曲仑、甲泛葡胺、甲泛影酸、二叠氮酸DIATRIAZOICACID、碘他拉酸、碘克沙酸及这些酸的盐。0105在本发明的另一个方面，所述脂质体制剂包含多柔比星和MRI造影剂。MRI造影剂包括顺磁性螯合物，例如基于锰2、钆3或铁3。亲水性螯合物比如GDDTPA、GDDOTA、GDHPDO3A和GDDTPABMA分布在细胞外且由肾脏清除。这样的化合物用于例如显影中枢神经系统中的损伤。更多其它。
48、的器官或组织特异性试剂包括MNDPDP、GDBOPA、GDEOBDTPA、顺磁性卟啉、大分子化合物、颗粒和脂质体。0106在本发明的仍然另一个方面，脂质体制剂包含多柔比星和超声显像剂。超声显像是基于超声波例如，在110MHZ的频率范围中经由传感器穿透进入人或动物受试者中，该超声波与身体组织和流体的界面相互作用。超声成像中的对比度得自在这样的界面上声波的差示反射/吸收；结果可以使用多普勒技术增强，包括使用彩色多普勒以评估血流。超声造影剂的实例包括基于含气体的半乳糖微晶的包含涂有脂肪酸的含气体的半乳糖微晶的和包含通过部分变性的人血清白蛋白包囊的气泡的0107在本发明中可以使用的其他显像剂或诊断剂包。
49、括，但不限于荧光剂比如6羧基荧光素、放射性试剂比如放射性同位素或包含放射性同位素的化合物，包括碘代辛烷、卤化碳和泛影葡胺钠RENOGRAN等。0108在本发明的另一个方面，脂质体制剂进一步包含另外的活性剂，例如另外的化疗药物。具体实施方案0109实施例10110通过NH4负载制备负载多柔比星的热敏脂质体0111通过下述技术制备包含1,2二棕榈酰基SN甘油基3磷脂酰胆碱DPPC的脂质体，其包含86MOLE的脂质体膜；约4摩尔的1,2二硬脂酰基SN甘油基3磷酸乙醇胺N聚乙二醇2000DSPEMPEG；和约10摩尔的1硬脂酰基2羟基SN甘油磷脂酰胆碱MSPC首先，在200MM的硫酸铵缓冲液中水合合适的脂质组合物，形成多层脂质体。然后，通过挤出穿过80NM过滤器形成小单层脂质体，以在200MM的硫酸铵缓冲液中形成约100NM球体。0112然后，使之前步骤中制备的脂质体进行透析或渗滤步骤，以用10蔗糖溶液交换脂质体外部的硫酸铵，形成跨脂质体膜的铵浓度梯度即，。