治疗膝关节前交叉韧带损伤的组合物.pdf

本发明涉及膝关节前交叉韧带损伤治疗的药物组合物，具有抑制基质金属蛋白酶过度释放的作用。该组合物含有生长因子、基质金属蛋白酶抑制剂和炎症阻断剂。组合物的优化成分是：转化生长因子+维甲酸+四环素+NF-κB抑制剂。本发明由于有效的抑制了基质金属蛋白酶过度释放，开辟了膝关节前交叉韧带损伤治疗的新的有效途径，疗效显著，经修复韧带的张力强度恢复到正常状态。突破了现有技术对膝关节前交叉韧带损伤治采用的外科重建手术只限于“治”，而不能实现“愈”(特别是关节力学功能无法恢复)的严重缺陷。

权利要求书
1.  一种治疗膝关节前交叉韧带损伤的组合物，其特征是：它包括基质金属蛋白酶抑制因子或/和生长因子，按单位为质量/体积(m/v)，它们之间的配比关系为0～300∶0～1。

2.  根据权利要求1所述的一种治疗膝关节前交叉韧带损伤的组合物，其特征是：述组合物还包括炎症阻断剂，它与基质金属蛋白酶抑制因子或/和生长因子之间的配比关系是：按单位为质量/体积(m/v)，它们之间的配比关系为0～300∶0～1∶0～1。

3.  根据权利要求1所述的一种治疗膝关节前交叉韧带损伤的组合物，其特征是：所述的基质金属蛋白酶抑制因子选自维甲酸、四环素、AP-1的抑制剂姜黄素、NF-κB抑制剂、特异性c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125、Gi蛋白通道抑制剂百日咳毒素、P38信号通道抑制剂SB203580、ERK激酶1特异性抑制剂PD98059中的其中一种或者几种组合。

4.  根据权利要求1所述的一种治疗膝关节前交叉韧带损伤的组合物，其特征是：所述的生长因子可以是转化生长因子、表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子(IGF-1，IGF-2)、肿瘤坏死因子-β中的一种或几种组合。

5.  根据权利要求2所述的一种治疗膝关节前交叉韧带损伤的组合物，其特征是：所述的炎症阻断剂选自英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗中一种或者几种组合。

6.  根据权利要求1、3、4所述的一种治疗膝关节前交叉韧带损伤的组合物，其特征是：组合物由维甲酸50ng/ml四环素10-4M，姜黄素50μM，转化生长因子10ng/ml组成。

7.  根据权利要求1、3、4所述的一种治疗膝关节前交叉韧带损伤的组合物，其特征是：组合物由维甲酸50ng/ml、四环素10-4M、姜黄素50μM、转化生长因子30ng/ml组成。

8.  根据权利要求1、3、4所述的一种治疗膝关节前交叉韧带损伤的组合物，其特征是：组合物由转化生长因子30ng/ml构成。

9.  根据权利要求1、3、4所述的一种治疗膝关节前交叉韧带损伤的组合物，其特征是：组合物由维甲酸50ng/ml、四环素10-4M、NF-κB抑制剂50μM、转化生长因子30ng/ml构成

10.  根据权利要求1、3、4所述的一种治疗膝关节前交叉韧带损伤的组合物，其特征是：组合物由转化生长因子10ng/ml、依那西普30ng/ml构成。

说明书治疗膝关节前交叉韧带损伤的组合物
技术领域
本发明涉及一种治疗软组织损伤的药物组合物，尤其涉及膝关节前交叉韧带损伤的治疗药物组合物，该组合物含有生长因子，基质金属蛋白酶抑制剂，和抗炎症因子。
技术背景
由于人在运动中频繁发生前交叉韧带与内侧副韧带的损伤，对关节功能造成很大影响。近三十多年来，研究人员与医生在膝关节韧带修复方面作了大量的研究工作，至上世纪末已广泛观察到的、最重要的临床现象是，前交叉韧带与内侧副韧带具有不同的愈合能力；韧带受力损伤后，同为由大多数成纤维细胞与纤维构成的内侧副韧带具有功能自我愈合性反应，而前交叉韧带在创伤后却不能发生功能性的修复。
膝关节前交叉韧带对膝关节起着重要的稳定和限制作用。它的修复重建一直是骨科和运动创伤领域内重要的研究课题。一根部分撕裂的ACL反复受损最终将导致ACL来源的严重关节疾病。虽然人们已经充分认识到这种事实，但是对于损伤ACL乃至其它较为复杂的组织的修复再生而言，至今尚无良策。
目前国内外对前交叉韧带的修复主要采用手术重建，前交叉韧带重建手术最常见是进行生物移植。使用的移植物分为三种：自体移植物、同种异体移植物和人工韧带。自体移植物应用最广，并取得了良好的临床效果，但也有其缺点，如常用的骨-髌腱-骨供体部位会出现膝前疼痛、髌腱挛缩、髌腱炎等并发症。同种异体移植物也存在疾病传播、免疫排斥等问题。而且两者需要康复时间长，对患者影响较大，尤其对运动员来说，还可因为移植物强度下降、被拉长而影响术后效果。人工韧带会随时间延长而失败，其并发症也较高。
经检索，对与“前交叉韧带”相关的170项文献进行分析，其中95％以上的技术与前交叉韧带重建手术相关，包括重建用器械，选用替代物，而与基质金属蛋白酶交叉的专利为0，也未见又以抑制基质金属蛋白酶来实现治愈前交叉韧带的任何专利申请与授权及相关文献的报道。
发明内容
针对现有技术存在上述的对前交叉韧带损伤修复技术的不足，本发明的目的是而提供一种用于治疗受损前交叉韧带的组合物。
目前，前交叉韧带的损伤与修复过程需要经历两个过程，即伤损组织的去除，新组织的生长；这两个过程必牵连到一群酶：既需要“消化”组织的酶，又需要“再生”组织的酶。胞外基质按照时序的崩解与淀积必须要得到适当的平衡，即由这些酶的合理参与，才能实现有效的愈合与组织再生。但是，组织受损时，炎因子与生长因子，发炎因子可以激活或调控许多酶的生成和释放(但未必有助于组织修复)；生长因子则可以促使组织加快修复。不过，生长因子也是“双刃剑”，既可激活“再生”组织的酶，也可激激“消化”组织的酶。因此，如果能有调控因子来实现抑制“消化”酶的过度激活，同时又不让生长因子失活“再生”酶，那么将有效地促进各种组织(尤其如ACL类组织)的自愈合进程。
本发明属于一种治疗受损前交叉韧带的组合物。其主要作用原理是防止受损的前交叉韧带与其周围组织释放大量MMP-2与其它基质金属蛋白酶(MMPs)，同时也要防止释放在膝关节腔中的MMPs破坏已经损伤的ACL。
本发明组合物是一种基于前交叉韧带组织消化与生长之间竞争的平衡策略，用以实现这种平衡策略的一个具体“载体”，它包括基质金属蛋白酶抑制因子或/和生长因子。
本发明的上述组合物和炎症阻断剂。
本发明所述的基质金属蛋白酶抑制因子主要起抑制基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及其他其它基质金属蛋白酶(MMPs)的作用。这类基质金属蛋白酶抑制因子可以是维甲酸、四环素、AP-1的抑制剂姜黄素、NF-κB抑制剂(BAY11-7082)、特异性c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125、Gi蛋白通道抑制剂百日咳毒素(PT)、P38信号通道抑制剂SB203580、ERK激酶1(MEK)特异性抑制剂PD98059等中的其中一种或者几种组合。
本发明所述的生长因子可以是转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGFs)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(aFGF，bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1，IGF-2)、肿瘤坏死因子一β(TNF-β)其中的一种或几种组合。
本发明所述的炎症阻断剂用来终止膝关节液中MMP活性，可以是英夫利昔单抗(cA2)、依那西普、阿达木单抗等其中一种或者几种组合。
基于发明，基质金属蛋白酶抑制因子所包括的维甲酸(retinoid acid，RA)是维生素A在体内的活性代谢产物，属维生素A类物质。RA在胚胎及成年组织中有多种生物学活性，如在细胞增生、凋亡、分化、生殖、维持细胞正常功能等方面发挥重要作用。作为一种抗肿瘤剂RA已成功用于肺、肝、皮肤、膀胱和乳腺肿瘤动物模型，并作为急性早幼粒细胞白血病(APL)的治疗药物应用于临床。近年来RA在肾脏疾病中的应用受到国外学者的关注，多种肾脏疾病动物实验证实RA有减少蛋白尿和抗纤维化和细胞增生作用。
上述维甲酸在生物个体发育及维持正常生理状态中有重要作用，有介导细胞分化、增殖、凋亡及调节免疫等功能。其发挥生物学效应是通过如下机制实现的：RA在细胞核内有两组核受体：RAR和RXR，均属类固醇激素受体家族，分别有α、β、γ三种亚型。RARs与RXRs通常形成异二聚体，与目的基因启动子特异性RAR反应元件(RAREs)结合启动目的基因转录。RXRs还以同源二聚体或与其他核受体形成异二聚体发挥作用，这些核受体包括过氧化物增殖激活受体(PPAR)、甲状腺激素受体(ThR)、维生素D受体(VDR)以及孤核受体(orphan nuclear receptor)，与相应靶基因位点结合发挥作用。RA特异性调节基因转录是通过特异性的核受体反应元件实现的。RARE一般由间隔2个或5个核苷酸(DR2或DR5)的直接重复序列AGGTCA组成，，RXRs的反应元件主要由间隔1个核苷酸(DR1)的直接重复序列AGGTCA组成。
维甲酸RA可通过共价键与蛋白结合参与蛋白翻译后修饰，RA通过硫酯键使RA酰化，影响蛋白质功能。RA可影响多种蛋白激酶活性，如PKC各种亚型，MAPK-ERK1/2，JNK和p38。RA活化的RAR/RXR二聚体正性或负性调节其他信号途径介导的基因激活如转录因子激活蛋白(AP-1)，NF-κB。许多机制参与RA介导抗AP-1活性：如①抑制c-Fos、c-Jun的表达②抑制JNK的活性③干扰c-Fos与c-Jun聚合④特异性抑制含JunB的二聚体⑤抑制JunD磷酸化和RNA聚合酶2的结合，解离CREB结合蛋白CBP和ERKs与AP-1的结合位点⑥与AP-1竞争结合位点。RA抗AP-1活性可以抑制氧化应激介导的系膜细胞凋亡。
基质金属蛋白酶抑制因子包括的姜黄素是姜黄的黄色物质，是姜黄发挥药理作用的主要成分。姜黄素溶于乙醇、碱、醋酸、丙酮和氯仿等有机溶剂，不溶于水，其分子式为C21H20O6，其主链为不饱和脂族及芳香族基团。姜黄素可抑制炎性细胞前炎症细胞因子：肿瘤坏死因子TNF-α、白介素-1β和白介素-8的产生。1984年姜黄素作为有效的非甾体消炎药进入II期临床试验阶段，对18个风湿性关节炎和骨关节炎病人做短期、双盲、交叉试验，显示了令人满意的结果。
本发明涉及的生长因子中所述的转化生长因子是一大类异质性多肽，主要为TGF-α和TGF-β。TGF-α是一种由50个氨基酸组成的多肽，分子量为5.6 kD的一条单链，具有促进细胞生长和转化能力，在许多细胞转化途径及肿瘤细胞生长过程中TGF-α作为自分泌生长因子起着重要的作用。TGF-β是巨噬细胞分泌的一种活性多肽，其分子量为25kD，TGF-β是一种具有多种功能的蛋白多肽，是一种能促进细胞生长、分化及形态发生的超家族因子中的代表性成员，TGF-β超家族的成员广泛地分布于脊椎动物和非脊椎动物中，以自分泌和旁分泌的形式调节细胞的增殖、凋亡和细胞外基质的分泌，在细胞分化、胚胎发育、炎症反应和损伤修复过程中发挥重要的作用。
本发明由于提供上述组合物而产生的积极效果使显而易见的。即：上述组合物具有明显抑制基质金属蛋白酶过度释放的作用。开辟了膝关节前交叉韧带损伤治疗的新的有效途径，疗效显著，经修复后的韧带的张力强度恢复到正常状态。突破了现有技术对膝关节前交叉韧带损伤治采用的外科重建手术只限于“治”，而不能实现“愈”，特别是关节力学功能无法恢复的严重缺陷。
附图说明
附图1是对比实验中大鼠前交叉韧带断裂后只进行缝合的效果观察图；
附图2为对比实验中大鼠前交叉韧带断裂缝合后再添加本发明组合物实施例1治疗后的的效果观察图；
附图3为对比实验中大鼠前交叉韧带断裂缝合后再添加本发明组合物实施例2治疗后的的效果观察图；
附图4为对比实验中大鼠前交叉韧带断裂缝合后再添加本发明组合物实施例3治疗后的的效果观察图；
附图5为对比实验中大鼠前交叉韧带断裂缝合后再添加本发明组合物实施例4治疗后的的效果观察图。
具体实施方式
本发明通过基于下列非限定性的实施例更详细地解释。
实施例1：组合物配方1
组合物成分：维甲酸50ng/ml、四环素10-4M、姜黄素50μM、转化生长因子10ng/ml。
配制方法：
用2.5mL冷冻的PBS稀释，用0.2M的NaOH将pH值调到7.4，并保持在250-300毫渗摩尔(mOsm)。把组合物加入调好pH的溶液中，使最终总浓度达到2mg/mL。
试验动物：Wistar大鼠体重220±20g，雄性，共三组，每组10只。
对两组大鼠进行ACL断裂手术，再对其进行逢合。
一组再其逢合后，为减轻大鼠手术后的疼痛，在开始5天，每12小时注射0.01-0.05mg/ml的止痛剂，让其自动恢复。
另一组进行手术逢合后，取3μL已配好消毒的胶原凝胶涂被在ACL-ACL的缝合处。50分钟后，取5μL已配好的组合物溶液，注射到大鼠的关节腔内。开始三天，每天都注射同样的量，之后的3个周内，每5天注射一次。为减轻大鼠手术后的疼痛，也在开始5天，每12小时注射0.01-0.05mg/ml的止痛剂。
6周后。将所有的大鼠处死，取出其骨-韧带-骨复合物，见图2，测量其韧带的拉伸强度。结果表一：
表一
 组别  浓度  动物数  (只)  平均值±SD  拉伸强度(N)  修复(％) 正常组织  -  10  35±7.7  - ACL缝合  -  10  5.5±2.6  14 维甲酸+四环素姜黄 素+转化生长因子  50ng/ml+10-4M  +50μM+10ng/ml  10  24.0±3.9  65.1
实施例2：组合物配方2
成分：维甲酸50ng/ml、四环素10-4M、姜黄素50μM、转化生长因子30ng/ml。
配制方法：同实施例1
试验动物：Wistar大鼠体重220±20g，雄性，共三组。
试验过程：同实施例1
6周后。将所有的大鼠处死，取出其骨-韧带-骨复合物，见图3，测量其韧带的拉伸强度。结果表二：
表二
 组别  浓度  动物数  (只)  平均值±SD  拉伸强度(N)  修复(％) 正常组织  -  5  36±3.5  - ACL缝合  -  7  5.2±7.2  13.7 维甲酸+四环 素姜黄素+转化生 长因子(3X)  50ng/ml+10-4M  +50μM+30ng/ml  8  26.4±1.7  83
实施例3：组合物配方3
组合物成分：维甲酸50ng/ml、四环素10-4M、NF-κB抑制剂50μM、转化生长因子30ng/ml。
配制方法：同实施例1
试验动物：Wistar大鼠体重220±20g，雄性，共三组。
试验过程：同实施例1
6周后。将所有的大鼠处死，取出其骨-韧带-骨复合物，见图4，测量其韧带的拉伸强度。结果表三：
表三
  组别  浓度  动物数  (只)  平均值±SD  拉伸强度(N)  修复(％)  正常组织  -  5  36±1.2  -  ACL缝合  -  7  5.1±4.7  13.0  维甲酸+四环素  NF-κB抑制剂+转  化生长因子(3X)  50ng/ml+10-4M  +50μM+30ng/ml  6  29.5±5.3  84.3
实施例4：组合物配方4
成分：转化生长因子30ng/ml
配制方法：同实施例1
试验动物：Wistar大鼠体重220±20g，雄性，共三组。
试验过程：同实施例1
6周后。将所有的大鼠处死，取出其骨-韧带-骨复合物，见图4，测量其韧带的拉伸强度。结果表四：
表四
  组别  浓度  动物数(只) 平均值±SD拉伸强度(N)  修复(％)  正常组织  -  5 35±2.2  -  ACL缝合  -  7 5.2±1.7  13.0  转化生长因子  30ng/ml  6 5.7±4.3  14.3
实施例5：组合物配方5
成分：维甲酸50ng/ml、四环素10-4M、NF-κB抑制剂50μM、转化生长因子30ng/ml。
配制方法：同实施例1
试验动物：Wistar大鼠体重220±20g，雄性，共三组。
试验过程：同实施例1
6周后。将所有的大鼠处死，取出其骨-韧带-骨复合物，见图5，测量其韧带的拉伸强度。结果表五：
表五
  组别  浓度  动物数(只) 平均值±SD拉伸强度(N)  修复(％)  正常组织  -  6 36±1.2  -  ACL缝合  -  8 5.1±4.7  13.0  维甲酸+四环素  +NF-κB抑制剂+  转化生长因子  50ng/ml+10-4M  +50μM+30ng/ml  5 11.8±4.1  33.7
实施例6：组合物配方6
组合物成分：转化生长因子10ng/ml、依那西普30ng/ml。
配制方法：同实施例1
试验动物：Wistar大鼠体重220±20g，雄性，共三组。
试验过程：同实施例1
6周后。将所有的大鼠处死，取出其骨-韧带-骨复合物，测量其韧带的拉伸强度。结果表六：
表六
  组别  浓度  动物数  (只)  平均值±SD  拉伸强度(N)  修复(％)  正常组织  -  5  35±2.0  -  ACL缝合  -  7  5.2±1.3  13.0  转化生长因  子+依那西普  10ng/ml+30ng/ml  6  5.8±4.3  15.2
从上述实施例，及我们对4000多个大鼠试验样本的统计结果可得出。组合物的优化组分为：维甲酸+四环素+NF-κB抑制剂+转化生长因子，从大鼠前交叉韧带断裂缝合后再添加本发明组合物实施例中的解剖图能够直观观察到这点。