修饰的编码植物中生长和/或发育相关蛋白的转基因.pdf

本发明提供通过表达修饰的编码生长和/或发育相关蛋白的转基因改变植物表型的方法和材料。表达修饰的转基因的转化植物与野生型植物相比，呈现包括增加的种子大小和/或数目的表型。

权利要求书
1.  一种包含具有突变的miRNA结合位点或一个或多个提前终止密码子的植物生长和
/或发育基因的转基因植物，其中所述植物生长和/或发育基因与胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子和任选地polyA序列可操作地连接，并且其中所述转基因植物与不包含突变的植物生长和/或发育基因的野生型植物相比，展示出产量、种子数和/或大小的增加。

2.  依照权利要求1所述的转基因植物，其中所述植物生长和/或发育基因是HD-Zip转录因子、含NAC的转录因子、BHLH转录因子、MYB转录因子、APETALA2-样转录因子、SBP-样转录因子、SCL转录因子、ARF转录因子、或F-盒蛋白。

3.  依照权利要求2所述的转基因植物，其中所述HD-Zip转录因子是REVOLUTA(REV)基因、PHABULOSA(PHB)、PHAVOLUTA(PHV)、ATHB8、或ATHB15；含NAC的转录因子是NAC1、CUC1、或CUC2；BHLH转录因子是TCP2、TCP3、TCP4、TCP10、或TCP24；MYB转录因子是MYB33、MYB65、或GAMYB；APETALA2-样转录因子是AP2、TOE1、TOE2、TOE3、或GL15；SBP-样转录因子是SPL3、SPL4、或SPL5；SCL转录因子是SCL6-II、或SCL6-III；ARF转录因子是ARF6、ARF10、ARF16、ARF17、或ARF18；或者F-盒蛋白是TIR1。

4.  依照权利要求3所述的转基因植物，其中所述REV基因来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)或玉米(Zeamays)、欧洲油菜(Brassicanapus)、亚麻荠、大豆、稻、高粱、或小麦。

5.  依照权利要求1所述的转基因植物，其中所述胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子与所述植物是异源的。

6.  依照权利要求1所述的转基因植物，其中所述胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子与所述植物是同源的。

7.  依照权利要求1所述的转基因植物，其中所述胚特异性启动子是与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶:去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAE1)、叶状子叶2基因(LEC2)、叶状子叶1基因(LEC1)、天冬氨酸蛋白酶基因(ASP)、或油质蛋白基因相关的早期特异性启动子；并且其中所述胚乳特异性启动子是与豆球蛋白
1A(LEG1A)基因相关的启动子；并且其中所述穗特异性启动子是与AGAMOUS基因或CLAVATA
1基因相关的启动子。

8.  依照权利要求7所述的转基因植物，其中所述AAP1启动子是来自拟南芥的AAP1启动子，油酸12-羟化酶:去饱和酶启动子是来自Lesquerellafendleri的油酸12-羟化酶:去饱和酶基因启动子(LFAH12)，2S2基因启动子来自拟南芥，脂肪酸延长酶基因启动子来自拟南芥，叶状子叶2基因启动子来自拟南芥，叶状子叶1基因启动子来自玉米(ZmLEC1)，天冬氨酸蛋白酶基因启动子来自稻或玉米(OsASP1或ZmASP1)，油质蛋白基因启动子来自玉米(ZmOLE)，豆球蛋白1A(LEG1A)基因启动子来自玉米(ZmLEG1A)，AGAMOUS基因来自玉米(ZmZAG1)，或CLAVATA1基因启动子来自玉米(ZmCLV1)。

9.  依照权利要求4所述的转基因植物，其中将拟南芥Revoluta编码序列(SEQIDNO：
8)突变使得在核苷酸567处的胸苷变为腺嘌呤，且在核苷酸570处的鸟嘌呤(Guanidine)变为腺嘌呤，或者其中将所述玉米REV编码序列(ZmRLD1，SEQIDNO：10)突变使得在核苷酸579处的胸苷变为腺嘌呤，且在核苷酸582处的鸟嘌呤变为腺嘌呤，或者其中将所述拟南芥Revoluta编码序列突变使得在氨基酸残基位置11和18处编码终止密码子。

10.  一种包含具有突变的miRNA结合位点或一个或多个提前终止密码子的植物生长和
/或发育基因的转化细胞或组织培养物，其中所述植物生长和/或发育基因与胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子和任选地polyA序列可操作地连接，并且其中所述转化细胞或组织培养物能够产生与不包含所述突变的植物生长和/或发育基因的野生型植物相比，在产量、种子数和/或大小上具有增加的转基因植物。

11.  依照权利要求10所述的转化细胞或组织培养物，其中所述植物生长和/或发育基因是HD-Zip转录因子、含NAC的转录因子、BHLH转录因子、MYB转录因子、APETALA2-样转录因子、SBP-样转录因子、SCL转录因子、ARF转录因子、F-盒蛋白。

12.  依照权利要求11所述的转化细胞或组织培养物，其中所述HD-Zip转录因子是REVOLUTA(REV)基因、PHABULOSA(PHB)、PHAVOLUTA(PHV)、ATHB8、或ATHB15；含NAC的转录因子是NAC1、CUC1、或CUC2；BHLH转录因子是TCP2、TCP3、TCP4、TCP10、或TCP24；MYB转录因子是MYB33、MYB65、或GAMYB；APETALA2-样转录因子是AP2、TOE1、TOE2、TOE3、或GL15；SBP-样转录因子是SPL3、SPL4、或SPL5；SCL转录因子是SCL6-II、或SCL6-III；ARF转录因子是ARF6、ARF10、ARF16、ARF17、或ARF18；或者F-盒蛋白是TIR1。

13.  依照权利要求12所述的转基因植物，其中所述REV基因来自拟南芥或玉米、欧洲油菜、亚麻荠、大豆、稻、高粱、或小麦。

14.  权利要求10所述的转化细胞或组织培养物，其中所述胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子与所述植物是同源或异源的。

15.  权利要求10所述的转化细胞或组织培养物，其中所述胚特异性启动子是与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶:去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAE1)、叶状子叶2基因(LEC2)、叶状子叶1(LEC1)基因、天冬氨酸蛋白酶基因(ASP)、或油质蛋白基因相关的早期特异性启动子；并且其中所述胚乳特异性启动子是与豆球蛋白
1A(LEG1A)基因相关的启动子；并且其中所述穗特异性启动子是与AGAMOUS基因或CLAVATA
1基因相关的启动子。

16.  权利要求15所述的转化细胞或组织培养物，其中所述AAP1启动子是来自拟南芥的AAP1启动子，油酸12-羟化酶:去饱和酶启动子是来自Lesquerellafendleri的油酸
12-羟化酶:去饱和酶基因启动子(LFAH12)，2S2基因启动子来自拟南芥，脂肪酸延长酶基因启动子来自拟南芥，叶状子叶2基因启动子来自拟南芥，叶状子叶1基因启动子来自玉米(ZmLEC1)，天冬氨酸蛋白酶基因启动子来自稻或玉米(OsASP1或ZmASP1)，油质蛋白基因启动子来自玉米(ZmOLE)，豆球蛋白1A(LEG1A)基因启动子来自玉米(ZmLEG1A)，AGAMOUS基因来自玉米(ZmZAG1)，或者CLAVATA1基因启动子来自玉米(ZmCLV1)。

17.  依照权利要求13所述的转化细胞或组织培养物，其中将拟南芥Revoluta编码序列(SEQIDNO：8)突变使得在核苷酸567处的胸苷变为腺嘌呤，且在核苷酸570处的鸟嘌呤变为腺嘌呤，或者其中将所述玉米REV编码序列(ZmRLD1，SEQIDNO：10)突变使得在核苷酸579处的胸苷变为腺嘌呤，且在核苷酸582处的鸟嘌呤变为腺嘌呤，或者其中将所述拟南芥Revoluta编码序列突变使得在氨基酸残基位置11和18处编码终止密码子。

18.  一种增加植物种子产量和/或种子大小的方法，其包括以下步骤：
a)鉴定至少一种包含一个或多个在微小RNA结合位点的突变，或一个或多个提前终止密码子的突变体植物生长和/或发育基因；
b)构建包含胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子与所述突变的植
物生长和/或发育基因可操作地连接的表达构建体；
c)使用步骤(b)的表达载体转化植物细胞；
d)选择包含步骤(b)的表达载体的植物细胞；
e)从包含步骤(b)的表达载体的植物细胞再生植物；
f)培育步骤(e)的植物以获得具有与不包含突变的植物生长和/或发育基因的野生型植物相比具有增加的种子产量和/或种子大小的表型的成熟植物。

19.  依照权利要求18所述的方法，其中所述植物生长和/或发育基因是HD-Zip转录因子、含NAC的转录因子、BHLH转录因子、MYB转录因子、APETALA2-样转录因子、SBP-样转录因子、SCL转录因子、ARF转录因子、或F-盒蛋白。

20.  依照权利要求19所述的方法，其中所述HD-Zip转录因子是REVOLUTA(REV)基因、PHB、PHV、ATHB8、或ATHB15；含NAC的转录因子是NAC1、CUC1、或CUC2；BHLH转录因子是TCP2、TCP3、TCP4、TCP10、或TCP24；MYB转录因子是MYB33、MYB65、或GAMYB；APETALA2-样转录因子是AP2、TOE1、TOE2、TOE3、或GL15；SBP-样转录因子是SPL3、SPL4、或SPL5；SCL转录因子是SCL6-II、或SCL6-III；ARF转录因子是ARF6、ARF10、ARF16、ARF17、或ARF18；或者F-盒蛋白是TIR1。

21.  依照权利要求20所述的方法，其中所述REV基因来自拟南芥或玉米、欧洲油菜、亚麻荠、大豆、稻、高粱、或小麦。

22.  依照权利要求18所述的方法，其中所述胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子与所述植物是异源的。

23.  依照权利要求18所述的方法，其中所述胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子与所述植物是同源的。

24.  依照权利要求18所述的方法，其中所述胚启动子是与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶:去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAE1)、叶状子叶2基因(LEC2)、叶状子叶1(LEC1)基因、天冬氨酸蛋白酶基因(ASP)、或油质蛋白基因相关的早期特异性启动子；并且其中所述胚乳特异性启动子是与豆球蛋白1A(LEG1A)基因相关的启动子；并且其中所述穗特异性启动子是与AGAMOUS基因或CLAVATA1基因相关的启动子。

25.  依照权利要求24所述的方法，其中所述AAP1启动子是来自拟南芥的AAP1启动子，油酸12-羟化酶:去饱和酶启动子是来自Lesquerellafendleri的油酸12-羟化酶:去饱和酶基因启动子(LFAH12)，2S2基因启动子来自拟南芥，脂肪酸延长酶基因启动子来自拟南芥，叶状子叶2基因启动子来自拟南芥，叶状子叶1基因启动子来自玉米(ZmLEC1)，天冬氨酸蛋白酶基因启动子来自稻或玉米(OsASP1或ZmASP1)，油质蛋白基因启动子来自玉米(ZmOLE)，豆球蛋白1A(LEG1A)基因启动子来自玉米(ZmLEG1A)，AGAMOUS基因是来自玉米的ZAG1基因(ZmZAG1)，或者CLAVATA1基因启动子来自玉米(ZmCLV1)。

26.  依照权利要求21所述的方法，其中将拟南芥Revoluta编码序列(SEQIDNO：8)突变使得在核苷酸567处的胸苷变为腺嘌呤，且在核苷酸570处的鸟嘌呤变为腺嘌呤，或者其中将所述玉米REV编码序列(ZmRLD1，SEQIDNO：10)突变使得在核苷酸579处的胸苷变为腺嘌呤，且在核苷酸582处的鸟嘌呤变为腺嘌呤，或者其中将所述拟南芥Revoluta编码
序列突变使得在氨基酸残基位置11和18处编码终止密码子。

说明书修饰的编码植物中生长和/或发育相关蛋白的转基因
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请主张2009年8月25日提交的美国临时申请案第61/236,830号和2009年
8月25日提交的第61/236,824号的权利，此处出于所有目的将其以整体引用的方式并入本文中。
技术领域
[0003] 本申请概括涉及植物分子生物学。特别地，其涉及调节靶向序列表达的组合物和方法。
背景技术
[0004]全球因素，诸如气候变化、人口增长，和采用作物作为生物燃料产生了对开发新方法以显著增加作物产量的必要性。在过去60年取得的显著的产量增加是通过改进农艺实践、大规模使用氮肥和农药以及改进遗传和杂种优势取得的。作物生产力的不断进步依赖于主要通过经典育种的种质改良。这种方法目前在主要粮食作物上每年增加产量在
1.0-1.5％的范围内(Calderini和Slafer1998，FieldCropsResearch，57(3)：335-347；Egli2008，AgronomyJournal，100：S79-S88)。由于人口迅速增长，发展中国家的收入增长，有限的土地可用和气候变化，实现可持续的食品安全会需要在农艺措施、育种和农业生物技术上的技术进步(Dyson1999，PNAS，96(11)：5929-5936；Pinstrup-Andersenetal
1999，WorldFoodProspects：CriticalissuesfortheEarlyTwenty-firstCentury，in2020VisionFoodPolicyReport)。在决定固有产量中发挥重要作用的特定基因的鉴定和操作可为在相对较短时间内获得大幅增产提供一条出路。
[0005] REVOLUTA(REV)是属于在植物发育中具有多种功能的超家族III的同源结构域亮氨酸拉链转录因子(HD-ZIPIII)。它控制分生组织和器官的生长，建立细胞的命运和极性并控制血管发育(Talbert等1995，Development，121(9)：2723-2735；Otsuga等2001，PlantJournal，25(2)：223-236；Zhong和Ye1999，PlantCell，11(11)：2139-2152)。[0006] REV，与其他HD-ZipIII家族成员一起，是受微小RNA(miRNA)调节的转录因子。miRNA来源于植物基因组内的不同位点，是短的非编码RNA(长度为20-24核苷酸(nt))，其功能是抑制限定的靶基因的表达(Rhoades等，Cell110：513-520，2002；Bonnet等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101：11511-11516，2004；Reinhart等，GenesDev.16：1616-1626，
2002)。miRNA是由Dicer-样(DCL)核糖核酸酶从较长的前体分子产生的，并纳入到核糖核酸蛋白沉默复合物中，所述复合物通过小分子RNA与其靶mRNA的碱基配对影响对靶mRNA的抑制(Chen，Science303：2022-2025，2004；Bao等，Dev.Cell.7：653-662，2004)。REV和HD-ZipIII家族的其他四个成员在它们的与命名为165和166的miRNA互补的START(甾醇脂质结合)结构域中具有miRNA结合位点。近年来大量研究都支持miRNA165/166以空间特异性的方式抑制Ⅲ类HD-ZipmiRNA，而且这种抑制在例如，正常的腹/背轴命运确定、腋芽顶端分生组织(SAMs)发育和血管发育中是必不可少的(McConnell和Barton，
Development125：2935-2942，1998；McConnell等，Nature411：709-713，2001；Emery等，
Curr.Biol.13：1768-1774，2003；Juarez等，Nature428：84-88，2004，Zhong和Ye，PlantCellPhysiol.45：369-385，2004；Kim等，PlantJ.42：84-94，2005；Ochando等，PlantPhysiol.141：607-619，2006；Zhou等，PlantCellPhysiol.48：391-404，2007；Ochando等，Int.J.Dev.Biol.52：953-961，2008)。
[0007]以胚特异性方式过表达拟南芥Revoluta(AtREV)转基因的双低菜(canola)在跨多年的重复产量试验中给出了15％的种子产量增加(WO20077079353)。这些结果的直接解释有两个：i)REV转基因在蛋白水平发挥功能导致产量增加，或ii)REV基因在转录水平发挥功能造成产量增加。
[0008] 为了区分相对的蛋白和转录模型，本发明产生了携带修饰的REV转基因的植物，修饰的REV转基因在miRNA结合位点中含有突变致使内源性miRNA不能再结合REV转基因；或者修饰的REV转基因不编码全长REV蛋白。将提前终止密码子引入这种翻译的REV突变体转基因将防止全长REV蛋白从转基因的表达。称为无义介导的降解(NMD)的mRNA监视系统存在于所有真核生物，包括植物，以降解天然mRNA具有早熟终止密码子的异源mRNA(Gutierrez等，TrendsPlantSci.4：429-438，1999；Maquat，Nat.Rev.Mol.CellBiol.5：89-99，2004；Baker和Parker，Curr.Opin.CellBiol.16：293-299，2004)。含有无义突变的mRNA的降解确保了潜在有害的小多肽不会累积在生物体内。
[0009]因此，本发明提供通过表达修饰的编码至少一种生长和/或发育相关蛋白的核酸
/基因，增加植物中种子数和/或大小导致提高的产量的组合物和方法。
[0010]发明概述
[0011]本发明提供了一种修饰的植物生长和/或发育基因。在一些实施方案中，修饰的基因具有突变的miRNA结合位点，或一个或多个提前终止密码子。
[0012]本发明提供包含一个或多个本发明的修饰的植物生长和/或发育核酸/基因的植物，以及组合物和生产这种植物的方法。在一些实施方案中，修饰的核酸/基因具有突变的miRNA结合位点，和/或一个或多个提前终止密码子(earlystopcodon)。在一些进一步的实施方案中，修饰的植物生长和/或发育核酸/基因与启动子，例如胚特异性启动子，胚乳特异性启动子，或穗特异性启动子，以及任选地与polyA序列可操作地连接，其中本发明的植物与不包含修饰的核酸/基因的野生型植物相比，在种子数和/或种子大小上具有增加。在一些实施方案中，胚特异性启动子是早期特异性的胚启动子。在一些实施方案中，由此产生的种子数和/或种子大小上的增加导致增加的产量。在一些实施方案中，本发明的植物是转基因植物。在一些其他的实施方案中，本发明的植物是非转基因植物，如例如，具有天然突变的植物，或从非转基因诱变产生的突变体植物。
[0013] 在一些实施方案中，植物生长和/或发育核酸/基因是一种HD-Zip转录因子、含NAC的转录因子、BHLH转录因子、MYB转录因子、APETALA2-样转录因子、SBP-样转录因子、SCL转录因子、ARF转录因子、F-盒蛋白。HD-Zip转录因子可以是REVOLUTA(REV)基因、PHABULOSA(PHB)、PHAVOLUTA(PHV)、ATHB8、或ATHB15；含NAC的转录因子可以是NAC1、CUC1、或CUC2；BHLH转录因子可以是TCP2、TCP3、TCP4、TCP10、或TCP24；MYB转录因子可以是MYB33、MYB65、或GAMYB；APETALA2-样转录因子可以是AP2、TOE1、TOE2、TOE3、或GL15；SBP-样转录因子可以是SPL3、SPL4、或SPL5，SCL转录因子可以是SCL6-II、或SCL6-III，
ARF转录因子可以是ARF6、ARF10、ARF16、ARF17、或ARF18；和F-盒蛋白可以是TIR1。在本
文描述的某些实施方案中，REV基因可以编码包含来自下述的全部或部分REV的多肽：拟南芥(例如SEQIDNO：1，由SEQIDNO：8编码)、欧洲油菜、亚麻荠、大豆、小麦、稻(例如，OsREV1，SEQIDNO：2，由SEQIDNO：38编码；OsREV2，SEQIDNO：3，由SEQIDNO：39编码；或TGIOsREV2，SEQIDNO：40，由SEQIDNO：41编码)、玉米(例如，ZmRLD1，SEQIDNO：
12，由SEQIDNO：10编码，或ZmRLD2，SEQIDNO：4，由SEQIDNO：5编码)、番茄(例如，SEQIDNO：7)或高粱。在一些实施方案中，REV基因可以编码衍生自拟南芥、欧洲油菜、亚麻荠、大豆、小麦、稻、玉米或高粱的REV的变体，其与其对应的野生型序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多的序列同一性。
[0014] 在一些实施方案中，本发明使用的启动子是与植物同源或异源的胚启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子。在一些实施方案中，胚特异性启动子是早期特异性胚启动子。早期特异性胚启动子可以是与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶:去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAE1)、叶状子叶2基因(LEC2)、叶状子叶1(LEC1)基因、天冬氨酸蛋白酶1基因(ASP1)、或油质蛋白基因相关的启动子，并且其中胚乳特异性启动子可以是与豆球蛋白1A(LEG1A)基因相关的启动子，并且其中穗特异性启动子可以是与AGAMOUS基因或CLAVATA1基因(CLV1)相关的启动子。例如，AAP1启动子是来自拟南芥的AAP1启动子(SEQIDNO：17)或其功能性部分，油酸12-羟化酶:去饱和酶启动子是来自Lesquerellafendleri的油酸12-羟化酶:去饱和酶基因启动子(LFAH12，SEQIDNO：14)或其功能性部分，2S2基因启动子来自拟南芥，脂肪酸延长酶基因启动子来自拟南芥，叶状子叶基因启动子来自拟南芥(SEQIDNO：16)或其功能性部分，油质蛋白基因启动子来自玉米(SEQIDNO：34)或其功能性部分，叶状子叶1(LEC1)基因启动子来自玉米(ZmLEC1)或是其功能性部分，天冬氨酸蛋白酶1(ASP1)基因启动子来自稻或玉米(OsAsp1；ZmAsp1)或是其功能性部分，豆球蛋白1A(LEG1A)基因启动子来自玉米(ZmLEG1A，SEQIDNO：35)或是其功能性部分，AGAMOUS基因启动子来自玉米(ZmZAG1，SEQIDNO：36)或是其部分功能性部分，或者CLAVATA1基因启动子来自玉米(ZmCLV1)或是其功能性部分。
[0015]在一些实施方案中，REV基因是来自拟南芥、玉米、欧洲油菜、亚麻荠、大豆、稻、高粱、或小麦。例如，在一个实施方案中，所述植物包含突变体拟南芥REV基因，其中将所述Revoluta编码序列(SEQIDNO：8)突变使得在核苷酸567处的胸苷变为腺嘌呤，且在核苷酸570处的鸟嘌呤(Guanidine)变为腺嘌呤。在另一实施方案中，所述植物包含玉米突变体REV基因，其中将所述Revoluta编码序列(ZmRLD1，SEQIDNO：10)突变使得在核苷酸
579处的胸苷变为腺嘌呤，且在核苷酸582处的鸟嘌呤变为腺嘌呤。仍在另一个实施方案中，所述植物包含突变体拟南芥REV基因，其中将Revoluta编码序列突变使得在氨基酸残基位置11和18处编码终止密码子。
[0016] 本发明还提供包含本发明的修饰的植物生长和/或发育核酸/基因的转化的细胞、组织培养物和/或植物部分。转化的细胞、组织培养物或植物部分可以衍生自可从胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、茎、柄、根、根尖、果实、种子、花、子叶或下胚轴再生的细胞。在一些实施方案中，修饰的植物生长和/或发育核酸/基因具有突变的miRNA结合位点，或一个或多个提前终止密码子。在一些实施方案中，修饰的植物生长和
/或发育核酸/基因与启动子，例如胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动
子，以及任选地与polyA序列可操作地连接，其中转化的细胞、组织培养物或植物部分可以带来与野生型植物或不包含所述突变的植物生长和/或发育核酸/基因的植物相比，种子数和/或种子大小增加的转基因植物。在一些实施方案中，胚特异性启动子是早期特异性胚启动子。在一些实施方案中，胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子是如本文所述的启动子。例如，所述启动子可以是来自拟南芥的AAP1启动子(AtAAP1)、来自Lesquerellafendleri的油酸12-羟化酶:去饱和酶基因启动子(LFAH12)、来自拟南芥的
2S2基因启动子(At2S2)、来自拟南芥的脂肪酸延长酶基因启动子(AtFAE1)、来自拟南芥的叶状子叶2基因启动子(AtLEC2)、来自玉米的叶状子叶1基因启动子(ZmLEC1)、来自稻或玉米的天冬氨酸蛋白酶1基因启动子(OsASP1或ZmASP1)、来自玉米的油质蛋白(OLE)基因启动子、来自玉米的豆球蛋白1A基因启动子(ZmLEG1A)、来自玉米的AGAMOUS基因启动子(ZmZAG1)、或来自玉米的CLAVATA1基因启动子(ZmCLV1)。在一些实施方案中，所述植物生长和/或发育核酸/基因是一种HD-Zip转录因子，例如REVOLUTA(REV)基因。在一些进一步的实施方案中，REV基因是来自拟南芥、玉米、欧洲油菜、亚麻荠、大豆、稻、高粱、或小麦。例如，将转化的细胞、组织培养物或植物部分包含突变体拟南芥REV基因，其中将Revoluta编码序列(SEQIDNO：8)突变使得在核苷酸567处的胸苷变为腺嘌呤，且在核苷酸570处的鸟嘌呤变为腺嘌呤；或包含玉米突变体REV基因，其中将所述玉米Revoluta编码序列(ZmRLD1，SEQIDNO：10)突变使得在核苷酸579处的胸苷变为腺嘌呤，且在核苷酸582处的鸟嘌呤变为腺嘌呤；或包含突变体拟南芥REV基因，其中将所述Revoluta编码序列突变使得在氨基酸残基位置11和18处编码终止密码子。
[0017] 本方法和组合物增加了植物中种子的大小和/或种子数。在一些实施方案中，本方法和组合物涉及使用植物中过表达的修饰的生长和/或发育调节核酸/基因。特别地，本方法和组合物涉及使用miRNA抗性的生长和/或发育调节核酸/基因，或在适当植物启动子控制下的包含一个或多个提前终止密码子的生长和/或发育调节核酸/基因。在一些实施方案中，植物启动子可以是胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子以提供植物的发育中的种子中基因和/或基因编码蛋白的过表达。在一些实施方案中，胚特异性启动子是早期特异性胚启动子。在一些实施方案中，该植物是转基因植物，而且修饰的生长和/或发育调节基因是转基因植物中的转基因。植物中修饰基因的过表达，例如，在植物种子发育的早期，提供了与野生型植物相比，在转基因植物中增加的种子产量和/或增加的种子大小。
[0018] 在一个具体的实施方案中，突变REVOLUTA(REV)核酸/基因的miRNA结合位点以显著降低或消除miRNA的结合和控制。在一些其他的实施方案中，突变生长和/或发育调节核酸/基因以具有一个或多个提前终止密码子。突变的转基因可以与胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子可操作地连接以提供在转基因植物的发育中的种子中REV蛋白的过表达。当使用如WO/2001/033944和美国专利7,056,739(以整体引用的方式分别并入本文)报道的组成型启动子在整个植物过表达REV时，REV的过表达，例如，在种子发育早期，令人惊讶的导致转基因植物中增加的种子大小和/或增加的种子数而没有看到有害的副作用。此外，WO/2007/079353和美国公开的专利申请号2008-0263727(以整体引用的方式分别并入本文)报道的，这种早期种子特异表达REV引起种子大小统计学上
显著的增加和增加的种子数。
[0019] 只要表达导致植物中增加的种子数和/或种子大小，本发明的修饰的生长和/或发育核酸/基因可以在任何适当的阶段，在植物的任何适当部分表达。在一些实施方案中，核酸/基因在早期胚发育过程中在种子中过度表达。在一些实施方案中，核酸/基因在胚、胚乳、或穗(雌花序)中过度表达。在一些其他实施方案中，核酸/基因在任何所需的发育阶段在除种子外的一个或多个植物部分中过度表达。
[0020] 在一些实施方案中，该方法包括：a)至少一种包含一个或多个在微小RNA结合位点的突变，或包含一个或多个提前终止密码子的突变体植物生长和/或发育基因；b)构建包含突变的植物生长和/或发育基因的表达构建体；c)用步骤(b)的表达载体转化植物细胞；d)选择包含步骤(b)的表达载体的植物细胞；e)从包含步骤(b)的表达载体的植物细胞再生植物；f)培育步骤(e)的植物以获得具有与野生型植物或不包含所述突变的植物生长和/或发育基因的植物相，具有增加的种子产量和/或种子大小的表型的成熟植物。可以通过突变野生型生长和/或发育相关基因获得突变体生长和/或发育相关基因。突变基因和筛选此突变的方法是本领域熟练技术人员所周知的。在一些其他的实施方案中，突变体生长和/或发育相关基因自然发生而无需使用人工诱变方法。这种突变体可以筛选和分离。特别地，该方法包括在种子中，在胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子控制下，表达miRNA抗性生长和/或发育相关基因，或具有一个或多个提前终止密码子的生长和/或发育相关的基因。在一些实施方案中，胚特异性启动子是早期特异性胚启动子。在一些实施方案中，胚特异性启动、胚乳特异性启动子，或穗特异性启动子与所述植物可以
是异源或同源的。在本发明的某些实施方案中，启动子是与氨基酸通透酶基因，例如AAP1；油酸12-羟化酶:去饱和酶基因；2S2白蛋白基因；脂肪酸延长酶基因，例如FAE1；叶状子叶基因；油质蛋白基因；或天冬氨酸蛋白酶基因相关的早期特异性胚启动子；胚乳特异性启动子可以是豆球蛋白1A(LEG1A)基因；而穗特异性启动子可以是AGAMOUS基因或CLAVATA
1基因。本发明中特别有用的启动子包括来自拟南芥的AAP1启动子(AtAAP1)或其功能性部分，来自Lesquerellafendleri的油酸12-羟化酶:去饱和酶启动子(LFAH12)或其功能性部分，来自拟南芥的2S2启动子(At2S2)或其功能性部分，来自拟南芥的脂肪酸延长酶基因启动子(AtFAE1)或其功能性部分，来自拟南芥的叶状子叶2启动子(AtLEC2)或其功能性部分，来自玉米的叶状子叶1启动子(ZmLEC1)或其功能性部分，来自稻或玉米的天冬氨酸蛋白酶1启动子(OsASP1或ZmASP1)或其功能性部分，来自玉米的油质蛋白(OLE)启动子或其功能性部分，来自玉米的豆球蛋白1A启动子(ZmLEG1A)或其功能性部分，来自玉米的AGAMOUS启动子(ZmZAG1)或其功能性部分，或来自玉米的CLAVATA1启动子(ZmCLV1)或其功能性部分。
[0021]在另一个实施方案中，修饰的REV基因与胚特异性启动子，例如，早期胚特异性启动子可操作地连接。在此方法中，修饰的REV基因在种子的早期发育中过表达并导致与野生型植物相比，种子大小和种子数的增加。在另一个实施方案中，修饰的REV基因与胚乳特异性启动子或穗特异性启动子可操作地连接。在此方法中，修饰的REV基因在胚乳或穗中过表达并导致与野生型植物相比，种子大小和种子数的增加。
[0022] 本文公开的方法和组合物可用于在表征为单子叶植物或双子叶植物的植物中增加种子大小和/或种子数。本发明的方法和组合物可用于在作为十字花科
(Brassicaceae，Cruciferae)、禾本科(Gramineae)、锦葵科(Malvaceae)或豆科-蝶形花亚
科(Leguminosae-Papilionoideae)成员的植物中增加种子大小和/或种子数。使用本发明的方法和组合物的一些感兴趣的实例植物包括，例如，双低菜、玉米、亚麻荠、棉花、苜蓿、大豆、小麦、稻、大麦等等。
[0023]还提供了包含与植物生长和/或发育相关的基因的核酸序列的遗传构建体，所述基因经修饰并可操作地与一个或多个调控序列相连，其中的一个或多个调控序列能够促进所述基因在植物中，例如，在胚发育过程中的表达。本文公开的遗传构建体可以包含包括胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子的调控序列。在一些实施方案中，胚特异性启动子是早期特异性胚启动子。早期特异性胚启动子可以包括，例如，与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶:去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAE1)、叶状子叶基因(LEC2)、叶状子叶1(LEC1)基因、天冬氨酸蛋白酶1基因(ASP1)、或油质蛋白基因相关的启动子。典型的遗传构建体包含来自拟南芥的AAP1基因启动子(SEQIDNO：17)或其功能性部分，来自Lesquerellafendleri的油酸12-羟化酶:去饱和酶启动子(LFAH12，SEQIDNO：14)或其功能性部分，来自拟南芥的2S2基因启动子或其功能性部分，来自拟南芥的脂肪酸延长酶基因启动子或其功能性部分，来自拟南芥(SEQIDNO：
16)的叶状子叶基因2启动子或其功能性部分，来自玉米的叶状子叶1启动子(ZmLEC1)或其功能性部分，来自稻或玉米的天冬氨酸蛋白酶1基因启动子(OsAsp1；ZmAsp1)或其功能性部分，或来自玉米的油质蛋白基因启动子(ZmOLE，SEQIDNO：34)或其功能性部分。胚乳特异性启动子可以是来自玉米的豆球蛋白1A基因启动子(ZmLEG1A，SEQIDNO：35)或其功能性部分。穗特异性启动子可以是来自玉米的ZAG1基因启动子(SEQIDNO：36)或部分功能性部分，或者来自玉米的CLAVATA1启动子(ZmCLV1)或其功能性部分。在一些实施方案中，本发明的遗传构建体包含与miRNA抗性REV基因或者具有来自拟南芥的一个或多个提前终止密码子的基因可操作连接的胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子。遗传构建体还可以包括可操作连接的polyA序列。与AAP1、2S2、FAE1、LEC2和LFAH12相关的启动子的非限制实例序列描述在WO/2007/079353中；与稻天冬氨酸蛋白酶1相关的启动子的非限制实例序列描述在Bi等(PlantCellPhysiol，2005，46(1)：87-98)中；与玉米油质蛋白基因相关的启动子的非限制实例序列描述在WO/1999/064579中；与玉米豆球蛋白基因相关的启动子的非限制实例序列描述在美国专利公开No.20060130184中；并且与玉米AGAMOUS(ZAG1)基因相关的启动子的非限制实例序列描述在Schmidt等(PlantCell，1993Jul；5(7)：729-37)中，上述各篇文献以整体引用方式并入本文。本领域熟练技术人员会能够确定和使用上面描述的启动子序列仍保持所需的启动子活性的功能性部分启动子序列。例如，在本发明中可以使用与AAP1、2S2、FAE1、LEC2、LFAH12、LEC1、ASP1、油质蛋白、LEG1A、或AGAMOUS或CLV1相关的启动子的截断形式，而仍能够获得与野生型植物相比，具有一定增加的种子产量和/或种子大小的转基因植物。
[0024]还提供了用于生产具有增加的种子大小和/或种子数的转基因植物的方法，其中所述方法包括将如上所述遗传构建体引入植物或植物细胞内，并在促进再生和成熟植物生长的条件下，培养包含所述遗传构建体的所述植物或植物细胞。通常，该方法产生当与相应的野生型植物相比较时具有增加的种子大小和/或种子数的转基因植物。包含所述遗传构建体的转基因植物可以是单子叶或双子叶植物，特别地其中所述单子叶植物是禾本科的成
员。一些示例性的来自禾本科的植物包括稻、燕麦、玉米或小麦。此外，本文描述的转基因
植物是十字花科、锦葵科或豆科-蝶形花亚科的植物。在一些实施方案中，所述转基因植物是大豆、棉花、亚麻荠、苜蓿、稻或双低菜。
[0025] 本发明还提供选择具有一个或多个修饰，在与胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子功能性相连时增加植物产量的核酸/基因的方法；其中所述方法包括构建包含与植物生长和/或发育相关、具有突变的miRNA结合位点，或一个或多个提前终止密码子，与胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子功能性相连的核酸/基因的表达载体，用所述表达载体转染植物细胞以形成转基因植物；培育所述转基因植物并选择那些具有增加的产量的转基因植物。在一些实施方案中，胚特异性启动子是早期胚特异性启动子。选择产生具有增加的产量的转基因植物的修饰的核酸/基因以进一步开发其他的转基因植物。用于本方法的基因包括但不限于，例如，HD-Zip转录因子(REVOLUTA(REV)、PHABULOSA(PHB)、PHAVOLUTA(PHV)、ATHB8、CORONA(ATHB15)等等)、含NAC的转录因子(例如，NAC1、CUC1、CUC2等等)、BHLH转录因子(包括例如，TCP2、TCP3、TCP4、TCP10、TCP24、等等)、MYB转录因子(例如，MYB33、MYB65、GAMYB等等)、APETALA2-样转录因子(例如，AP2、TOE1、TOE2、TOE3、GL15等等)、SBP-样转录因子(例如，SPL3、SPL4、SPL5等等)、SCL转录因子(例如，SCL6-II、SCL6-III等等)、ARF转录因子(例如，ARF6、ARF10、ARF16、ARF17、ARF18等等)、F-盒蛋白(例如TIR1等)、同源物、直向同源物或其变体。在
一个特定的实施方案中，REV基因编码包含来自拟南芥(例如，SEQIDNO：1，由SEQIDNO：
8编码)、欧洲油菜、亚麻荠、大豆、小麦、稻(例如，OsREV1，SEQIDNO：2，由SEQIDNO：38编码；OsREV2，SEQIDNO：3，由SEQIDNO：39编码，或TGIOsREV2，SEQIDNO：40，由SEQIDNO：41编码)、玉米(例如，ZmRLD1，SEQIDNO：12，由SEQIDNO：10编码；或ZmRLD2，SEQIDNO：4，由SEQIDNO：5编码)、番茄(例如SEQIDNO：7)或高粱的全部或部分REV的多肽，其是miRNA抗性的，或具有一个或多个提前终止密码子。在一些实施方案中，REV基因能够编码衍生自拟南芥、欧洲油菜、亚麻荠、大豆、小麦、稻、玉米或高粱中的REV的生物学活性变体，其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一些实施方案中，REV基因能够编码来自拟南芥、欧洲油菜、亚麻荠、大豆、小麦、稻、玉米、番茄、或高粱的REV的至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸，或更多个氨基酸。在另一实施方案中，REV基因编码衍生自拟南芥、欧洲油菜、亚麻荠、大豆、小麦、稻、玉米、番茄和/或高粱的REV的嵌合融合多肽。例如，嵌合融合多肽可以包含连成单个大分子的两个或多个异源REV蛋白或其部分。
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[0027] 电子提交的文本文件的内容通过述及整体并入本文：一份序列表的计算机可读形式拷贝(文件名：TARG01101US.txt，记录日期：2010年8月24日，文件大小130千字节)。[0028] 发明详述
[0029] 除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本文所述组合物和方法所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述那些相似的任何方法和
材料都可以用于实践或测试本方法和材料，但只对示例性方法和材料进行了描述。为了本
发明的目的，下列术语定义如下。
[0030] 如本文使用的，术语“一个/一种(a，an)”和“该/所述(the)”包含复数指示物，除非上下文另外清楚地指出。
[0031] siRNA在植物中首次发现(Hamilton和Baulcombe，Science286：950-952，1999；Llave等，PlantCell.14：1605-1619，2002)并且在拟南芥中是普遍存在的小RNA。siRNA具有防御病毒、抑制转基因或转座子表达、建立异染色质和转录后调节mRNA的功能。
[0032]miRNA是在许多生物体中(Lee等，Cell75：843-8541993；Wightman等，Cell
75：855-862，1993；Reinhart等，GenesDev.16：1616-1626，2002)发现的衍生自非编码miRNA基因的小(20-24nt)RNA分子。miRNA在它们的miRNA结合位点与靶mRNA序列碱基配对，且这种结合导致靶mRNA表达的下调。在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中发现了首例miRNA调节(Lee等，Cell75：843-854，1993；Wightman等，Cell75：855-862，
1993)，而且自那时以来，越来越多的miRNA在除酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)以外的不同真核生物中被发现。Revoluta和HD-ZipIII转录因子家族的其他四个成员(Phavoluta(Athb-9)，Phabulosa(Athb-14)，Corona(Athb-15)和Athb-8)在它们与拟南芥基因组中的miRNA165和166互补的START(甾醇脂质结合)结构域中具有微小RNA(miRNA)结合位点。将进化上保守的miRNA归入基因家族。如此，在拟南芥基因组中有两个miRNA
165(a和b)和7个miRNA166(a-g)(Reinhart等，GenesDev.16：1616-1626，2002，通过述及整体并入本文)调节HD-ZipIII转录因子家族成员。近年来大量研究都支持了miRNA
165/166以空间特定的方式抑制了Ⅲ类HD-Zip转录因子信使RNA(mRNA)并且该抑制对于正常的腹/背轴命运确定(adaxial/abaxialfatespecification)、腋芽顶端分生组织(axillaryshootapicalmeristem；SAMs)发育或血管发育是必不可少的(McConnell等，Development125：2935-2942，1998；McConnell等，Nature411：709-713，2001；Emery等，Curr.Biol.13：1768-1774，2003；Juarez等，Nature428：84-88，2004；Zhong和Ye，PlantCellPhysiol.45：369-385，2004；Kim等，PlantJ.42：84-94，2005；Ochando等，PlantPhysiol.141：607-619，2006；Zhou等，PlantCellPhysiol.48：391-404，2007；Ochando等，Int.J.Dev.Biol.52：953-961，2008))。无论是在体内和体外，均已进行研究以表明HD-ZIPIIImiRNA是在mRNA165/166存在下被切割的并且该切割依赖于miRNA结合位点序列(Tang等，GenesDev.17：49-63，2003；Floyd和Bowman，Nature428：485-486，2004；Zhong和Ye，PlantCellPhysiol.45：369-385，2004；Kim等，PlantJ.42：84-94，2005)，上述每一篇文献通过述及整体并入本文。
[0033]siRNA和miRNA在化学性质和功能上相类似。二者都是短的非编码RNA(长度为
20-24核苷酸(nt))，其功能是在动物和植物中抑制限定的靶基因的表达。两种RNA分子都是由Dicer-样(DCL)核糖核酸酶从较长的前体分子产生的，并纳入到核糖核酸蛋白沉默复合物，所述复合物通过小RNA与其靶mRNA的碱基配对实现对靶mRNA的抑制。沉默复合物需要Argonaute蛋白的活性。抑制可能通过靶mRNA的切割、或翻译的抑制(转录后调节)或靶基因的甲基化(转录调节)实现(Chen，Science303：2022-2025，2004；Bao等，Dev.Cell.7：653-662，2004)。
[0034]然而，siRNA和miRNA之间还有根本的区别。siRNA衍生自mRNA、转座子、异染色
质DNA或病毒，而miRNA起源自植物基因组的不同基因组。这些小RNA起源的不同也限定
了其不同的靶标。siRNA通常靶向它们衍生自的序列，而miRNA靶向与miRNA基因座无关的范围较广的序列。siRNA的生物合成涉及从长的双链RNA前体加工siRNA双链体，而miRNA的合成涉及从更长的不完整的茎环前体加工miRNA双链体。通常是由核糖核酸酶进行加工。DCL3或DCL4通常加工siRNA，而DCL1加工miRNA。siRNA的产生需要RNA依赖性RNA聚合酶而miRNA的产生不需要。
[0035] Revoluta(REV)和其他四个HD-ZipIII家族成员(Phavoluta(Athb-9)、Phabulosa(Athb-14)、(Athb-15)和Athb-8)在它们与命名为165和166的miRNA互补的START(甾醇脂质结合)结构域内具有miRNA结合位点。在植物中，miRNA及其靶mRNA之间具有高水平的互补性。因此，在不同植物中，miRNA结合位点(Floyd和Bowman，Nature428：
485-486，2004)和miRNA序列本身都是高度保守的并不令人惊奇(Rhoades等，Cell110：
513-520，2002；Bonnet等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101：11511-11516，2004)。将进化上保守的miRNA归入基因家族。如此，在拟南芥基因组中有两个miRNA165(a和b)和7个miRNA166(a-g)基因(Reinhart等，GenesDev.16：1616-1626，2002)，其调节HD-ZipIII家族成员。通过原位试验，知道REV定位于球形胚的顶端区域，然后集中于子叶的腹轴区并在以后的胚发育中位于下胚轴的脉管中(Otsuga等，PlantJ.25：223-236，2001；Emery等，Curr.Biol.13：1768-1774，2003；Juarez等，Nature428：84-88，2004；Williams等，Development132：3657-3668，2005)。
[0036]对III类HD-ZipmiRNA的表型研究通常集中于两种类型的突变体：i)miRNA抗性突变体，其包含转基因或在miRNA结合位点突变的内源性基因，和ii)miRNA过表达体(overexpressor)，其通过激活标签或通过转基因过表达miRNA。III类HD-Zip转录因子基因的miRNA结合位点中的突变产生功能获得性突变体，该突变体例如展示腹轴化的叶和茎(McConnell和Barton，Development125：2935-2942，1998；McConnell等，Nature
411：709-713，2001；Emery等，Curr.Biol.13：1768-1774，2003；Juarez等，Nature428：
84-88，2004，Zhong和Ye，PlantCellPhysiol.45：369-385，2004)、腋生SAM的异位发育
(McConnell和Barton，Development125：2935-2942，1998；McConnell等，Nature411：
709-713，2001)，或发育不良的脉管组织(Kim等，PlantJ.42：84-94，2005)。
[0037] miRNA结合位点突变呈现出在核苷酸水平上影响植物功能，因为在不改变氨基酸序列的位点内的突变仍产生同样的表型(Emery等，Curr.Biol.13：1768-1774，2003；Mallory等，EMBOJ.23(16)：3356-3364，2004)。因此，这些研究表明，HD-ZipIII家族成员对于极性建立、分生组织功能和脉管发育是很重要的，并且在RNA水平调节这些基因对于这些功能是重要的(McConnell等，Development125：2935-2942，1998；McConnell等，Nature411：709-713，2001；Emery等，Curr.Biol.13：1768-1774，2003；Juarez等，Nature428：84-88，2004；Zhong和Ye，PlantCellPhysiol.45：369-385，2004；Kim等，PlantJ.42：84-94，2005；Ochando等，PlantPhysiol.141：607-619，2006；Zhou等，PlantCellPhysiol.48：391-404，2007；Ochando等，Int.J.Dev.Biol.52：953-961，2008))。Juarez及其同事(Nature428：84-88，2004)通过原位杂交分析表明REV的玉米同源物(RLD1)和ZmmiRNA166a在叶原生殖细胞中具有互补的表达样式。在ZmREVmiRNA结合位点突变体中，Rld-O、Rld1mRNA在miRNA166a定位的初生叶以下的区域错误表
达(misexpress)，这表明ZmmiRNA166a通常抑制这一区域野生型RLD1的表达。同样，
McConnell及其同事(Nature411：709-713，2001)观察到，在miRNA抗性Phabulosa突变体中，PhabulosamRNA已延伸超出其叶中正常的腹轴位置，并在腹区积累。相反，过表达miRNA
165/166给出与那些功能缺失的HD-ZipIII转录因子突变体相类似的表型(Kim等，PlantJ.42：84-94，2005；Zhou等，PlantCellPhysiol.48：391-404，2007)。过表达miRNA165a导致所有五个HD-ZipIIImRNA的抑制并产生不形成芽顶端分生组织、器官极性和脉管发育紊乱、并拥有更少束间纤维的植物(Zhou等，PlantCellPhysiol.48：391-404，2007)。过量的miRNA166a不同程度上抑制五种HD-ZipIIImRNA并产生具有扁茎、破坏的脉管样式形成、扩大的分生组织和短心皮的矮化植物(Kim等，PlantJ.42：84-94，2005)。
[0038] 无论是在体内和体外，已经进行的研究表明HD-ZipIIImRNA是在mRNA165/166
存在下被切割的，并且该切割依赖于miRNA结合位点序列。Tang等(GenesDev.17：49-63，
2003)已经表明Phavoluta(PHV)和Phabulosa(PHB)mRNA可以在体外小麦胚芽提取系统中被切割并且这种切割依赖于miRNA166。5’RACE实验也表明REVmRNA在体内是在miRNA结合位点内的特定位置切割的(Floyd和Bowman，Nature428：485-486，2004，Zhong和Ye，PlantCellPhysiol.45：369-385，2004)，而在miRNA抗性REV突变体avb-1中没有这种切割。Kim等(PlantJ.42：84-94，2005)使用本氏烟(Nicotianabenthamiana)瞬时表达系统证明，在miRNA166a存在下Athb-15mRNA在植物中几乎被完全切割，而这种切割在使用在miRNA165/166靶序列携带突变的Athb-15mRNA时消失。他们还以5’RACE实验表明，Athb-15中的切割位点与REV和PHV的位点相匹配。
[0039] 称为无义介导的降解(NMD)的mRNA监视系统存在于所有真核生物，包括植物，以降解天然mRNA和具有早现终止密码子(prematureterminationcodon；PTC)的异源mRNA(Gutierrez等，TrendsPlantSci.4：429-438，1999；Maquat，Nat.Rev.Mol.CellBiol.5：89-99，2004；Baker和Parker，Curr.Opin.CellBiol.16：293-299，2004)。 含有无义突变的mRNA的降解确保了在生物体内不会积累潜在有害的小多肽。VanHoof和Green(PlantJ.10：415-424，1996)之前已经证实，豆类植物血凝素mRNA的稳定性依赖于编码区内早现终止密码子(PTC)的位置。他们发现，定位于在整个编码区20％、40％或60％处的早现终止密码子导致不稳定的mRNA，而位于整个编码区80％处的早现终止密码子产生了与野生型、全长mRNA同样稳定的mRNA。
[0040]以早期胚特异性方式过表达拟南芥REV(AtREV)转基因的双低菜在历时多年的重复产量试验中产生了15％种子产量增加。这些结果的直接解释有两种：i)REV转基因在蛋白水平发挥功能导致产量增加，或ii)REV基因在转录水平发挥功能造成产量增加。
[0041]蛋白质模型(上述i)假设REV是从转基因转录成mRNA，随后再翻译成蛋白质。相信是来自转基因的REV蛋白的过度表达导致产量增加，推测可能是通过过量的REV蛋白对抑制或激活下游靶基因的作用或通过掩蔽其他转录因子。
[0042]转录模型(上述ii)假设REV是从转基因转录成mRNA，而植物视过量的REVmRNA为异常。过量的REV转录物会通过通常称为共抑制的机制导致内源性双低菜REV基因座的沉默(Jorgensen等，PlantMol.Biol.31：957-973，1996；Que和Jorgensen，Dev.Genet.22：
100-910，1998)，并且因此，REV蛋白的缺乏不知何故导致种子产量增加。这种共抑制可能是转录基因沉默(例如，甲基化或改变的染色质结构)，通过降解内源性REVmRNA的转录后
基因沉默，或者两者皆有。此外，另一个的转录物模型假定来自转基因的REVmRNA充当内
源性miRNA165/166的miRNA池。因此，可用来抑制内源性REVmiRNA的miRNA165/166量会降低，使得内源性REV蛋白能够过表达。
[0043]为了区分相反的蛋白和转录物模型，本发明产生了转基因双低菜事件。在一个实施方案中，事件产生了携带不编码全长REV蛋白的修饰的REV转基因的植物。例如，工程化无内含子的拟南芥REV编码序列(SEQIDNO：8)以在接近编码序列的氨基末端处含有两个早现翻译终止密码子。在这个翻译的REV突变体转基因中引入提前终止密码子能够防止自该转基因表达全长REV蛋白。可以预期，因为没有功能性蛋白质会被翻译，这样修饰的REV转基因不能影响植物的表型。然而，本发明的发明人令人惊讶的发现，包含编码具有早现终止密码子的REV的转基因的转基因植物可以产生比野生型植物更多和/或更大或更重的种子。
[0044]同时，AtREVmiRNA结合位点的核苷酸序列与欧洲油菜REVmiRNA结合位点的核苷酸序列之间的比较揭示了仅有一个核苷酸差异。AtREVmiRNA结合序列中与miRNA
165/166互补的十八个核苷酸中的十七个在AtREV和BnREV之间是相同的。Zhou等(PlantCellPhysiol.48：391-404，2007)已经证实虽然在miRNA165a和CORONA(ATHB15)miRNA结合序列之间有一个核苷酸的差异，CORONAmRNA仍然在miRNA165a过表达时受到抑制。因此，在转基因双低菜植物中过表达AtREV转基因将受到双低菜REVmiRNA抑制是可能的。如果内源性双低菜REVmiRNA下调AtREV转基因，那么通过转基因能够产生的REV蛋白的最大量可能尚未实现。同样，如果有更多的REV蛋白产生，种子产量增加有可能大得多。因此，创造一个REVmiRNA突变体转基因可以绕过可能在转基因植物(例如双低菜)中存在的任何miRNA下调，导致更多来自该转基因的REVmRNA，并因此导致更多的REV蛋白。
[0045] 然而，事实上，以在AtREV启动子指导下过表达AtREVmiRNA抗性转基因revδmiRNA的拟南芥植物进行的发表的工作(Emery等，Curr.Biol.13：1768-1774，2003)证明，这些植物在茎和叶中的腹/背轴细胞命运确定上有问题。REV过表达植物的叶是腹轴化的，形成喇叭形器官。此外，也影响了revδmiRNA茎中的极性，导致韧皮部周围的木质部组织形成周木型维管束。Zhong和Ye(PlantCellPhysiol.45：369-385，2004)在调查过表达REV的拟南芥avb-1突变体时发现了相似的表型。发现avb-1突变体在miRNA结合位点具有氨基酸取代。考虑到过表达miRNA抗性REV基因的植物的典型异常表型，预期mRNA结合位点中突变的REV转基因的早期胚特异性表达有类似的异常表型是合理的。特别的是，可以预测过表达可能导致胚发育过程中的极性建立问题。
[0046]然而，与基于以上总结的之前教导得出的预期相反，目前公开的方法和材料意外却清楚地证明在跨多个地点的重复产量试验中，过表达miRNA抗性REV转基因导致比其相应的野生型显著增加的种子产量。在一些实施方案中，miRNA抗性REV转基因与胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子可操作地连接。此外，在本发明中REVmiRNA突变体表达不会在胚发育中导致有害作用。同样，本发明的方法和构建体提供了额外的手段以提高植物，尤其是那些重要的农业作物的生长和产量特征。
[0047]因此，本发明提供了对生产与野生型植物相比时具有显著增加的种子大小和/或增加的种子数的植物有用的方法和组合物。在一些实施方案中，如此增加种子大小和/或增加种子数可能会导致增加的产量。
[0048] 在一些实施方案中，所述方法和组合物涉及表达生长和/或发育相关蛋白的修饰
的转基因。在一个实施方案中，修饰的转基因是微小RNA抗性的。在另一个实施方案中，修饰的转基因在编码序列内编码一个或多个早现终止密码子。
[0049] 例如，在一些实施方案中，所述方法包括鉴定突变体生长和/或发育相关基因，所述基因在miRNA结合位点处包含一个或多个突变，使得所述miRNA基本上不结合或不完全结合编码突变体生长和/或发育基因的mRNA。因此，在miRNA结合位点包含一个或多个突变的突变体生长和/或发育相关基因是miRNA抗性的。可以通过突变野生型生长和/或发育相关基因获得miRNA抗性突变体生长和/或发育相关基因。突变基因和筛选此突变的方法是本领域技术人员所熟知的。在一些其他的实施方案中，突变体生长和/或发育相关基因自然发生而无需使用人工诱变方法。在一些其他的实施方案中，突变体生长和/或发育相关基因是由转基因诱变，如T-DNA插入、或者非转基因诱变，如化学诱变(例如，乙烷甲基磺酸(EMS)诱变)导致的。这种突变体可以被鉴定、筛选和分离。鉴定这种突变体的方法是本领域技术人员众所周知的(例如，PCR、测序、基因TILLING和更多)。此外，突变的生长和/或发育相关基因在表达质粒中与适当的启动子可操作地连接，并且随后转化到植物或植物细胞中。包含具有突变或改变的miRNA结合位点的miRNA抗性转基因的植物在植物的胚、胚乳、或穗中过表达植物生长和/或发育中涉及的蛋白，而且成熟的转基因植物与野生型相比呈现种子大小的显著增加和/或增加的种子数。在一些实施方案中，生长和/或发育相关基因是REVOLUTA基因。例如，突变REVOLUTA(REV)基因的微小RNA结合位点使得作为REV特异性miRNA的miRNA165/166不能结合，因此REV转基因是miRNA抗性的。此外，本文描述的方法中的REV转基因是在胚发育过程中启动表达的启动子调节下的，例如，特别是在早期特异性胚发育过程中启动表达。出乎意料的是，形成miRNA抗性REV转基因的微小RNA的突变和在早期胚发育中过表达REV转基因并没有导致腹/背轴叶和/或茎发育的异常，而是导致具有增加的种子数和/或种子大小的转基因植物。在一个实施方案中，REV基因来自拟南芥、欧洲油菜、玉米、稻、或番茄(Solanumlycopersicum)。
[0050] 尽管在一些其他的实施方案中，本发明提供的方法包括鉴定包含早现终止密码子
(PTC)的REV转基因，所述早现终止密码子定位于整个编码序列的少于80％、75％、70％、
65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少处。包含提前终止密码子的REV转基因(REVstop)的胚特异性过表达在植物中产生了增加的种子数和/或种子大小，这可能导致在跨多个地点的重复产量试验中种子产量的增加。不希望被理论约束，本发明的结果会表明增加的种子数和/或大小以及增加的产量增加不是由于过量REV蛋白的翻译，而可能是在RNA水平上REV转基因的某些影响。
[0051] 然而，因为上文所述以及例如，Jofuku等，PlantCell1：427-435，1989；Dickey等，PlantCell6：1171-6117，1994；Voelker等，EMBOJ.5：3075-3082，1986；Petracek等，PlantJ.21：563-569，2000关于植物中无义介导的降解(NMD)的理解，基于RNA的机制会是意想不到的。在这些早期的研究中，研究人员发现含PTC的等位基因导致它们mRNA丰度的减少。此外，所有这些基因均不包含内含子，表明植物中的NMD不依赖于内含子，而不像哺乳动物中的NMD那样。然而，对于含有内含子的植物基因NMD也可能会出现，正如Isshiki等(PlantPhysiol.125：1388-1395，2001)所见的。在所有真核生物中，PTC的识别需要翻译。此外，从在芽殖酵母酿酒酵母所做的研究来看，研究人员已经假定核糖体将终止密码子
识别为早现的，并且NMD是因两个顺式作用元件之一而引起的：i)下游序列元件(DSEs)或
ii)异常长的3’UTR，其原因是终止密码子和poly(A)尾之间改变的空间关系。在哺乳动物中，内含子被识别为NMD所需的顺式作用元件。因此，在植物如例如携带含早现终止密码子的REV转基因的双低菜中，应该没有由于PTC产生的REV蛋白，也应该没有由于NMD存在的任何显著量的来自转基因的REVmRNA。
[0052] 本发明还提供修饰的生长和/或发育相关蛋白编码序列和包含该序列的组合物。在一些实施方案中，生长和/或发育相关蛋白是HD-ZipIII家族成员。例如，生长和/或发育相关蛋白是REVOLUTA蛋白。在一些实施方案中，修饰的REV编码序列包含早现终止密码子，该密码子提供REV翻译突变体(REVstop)。在具体的实施方案中，此处证明的REV翻译突变体(REVstop)中的早现终止密码子位于拟南芥REV蛋白SEQIDNO：1的第11和18位氨基酸(在整个REV编码区的约1.3-约2.1％处)。因此，由于PTC在整个REV编码序列的少于约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约1％，或更少处，从REV突变体转基因转录的mRNA预期会降解，并没有REV蛋白会从该转基因产生。同样，会预期由于不存在足够的REVmRNA且植物没有产生REV蛋白，种子产量可能不会受到影响。与此相对，本发明提供了包含编码具有早现终止密码子的REV的转基因的转基因植物，所述转基因植物比野生型植物产生更多和/或更大的种子。在一些其他的实施方案中，此处所述的突变的植物生长和/或发育相关基因，例如REV基因，在miRNA结合位点内包含核苷酸变化。特别地，突变的目的是改变miRNA结合位点使得编码突变体REV的mRNA的破坏实质性地减少或完全受到抑制。在一些实施方案中，编码突变体REV的mRNA的破坏与编码野生型REV的mRNA的破坏相比，减少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约95％、约96％、约97％、约
98％、约99％或更高。此外，选择突变使得mRNA编码的氨基酸序列要么是不变的，如果改变也不会实质性改变产生的蛋白的REV活性。同样，突变可以创建被视为对通常存在于REV氨基酸序列同一位置的氨基酸残基为保守或非保守取代的氨基酸的密码子，只要与野生型植物相比，这种突变体基因的表达可以增加植物中种子的数量和/或种子大小。在一些实施方案中，突变体REV的活性是野生型REV的约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约
70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、或更少，这可以通过转录因子活性测量。在一个具体的实施方案中，突变体REV基因(SEQIDNO：9)包含在拟南芥REVOLUTA编码序列(野生型REV，SEQIDNO：8)中核苷酸567处的T至A的取代和在核苷酸570处的G至
A的取代，而突变体REV基因仍然编码野生型拟南芥REV蛋白(SEQIDNO：1)。在另一实施方案中，突变体REV基因(SEQIDNO：11)包含在玉米REVOLUTA编码序列(ZmRLD1，SEQIDNO：10)中核苷酸579处的T至A的取代和核苷酸582处的G至A的取代，而突变体REV基因仍然编码野生型玉米REV蛋白(SEQIDNO：12)。这些核苷酸改变不影响编码的REVOLUTA蛋白的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的生长和/或发育相关蛋白编码序列的转基因包含修饰，所述修饰以其他方式(otherwise)减少和/或中断miRNA对生长和/或发育相关蛋白的调节能力，使得当在植物中表达时，所述转基因导致植物中增加的种子大小和/或种子数。减少和/或中断植物中的miRNA调节机制的方法是本领域技术人员众所周知的。下表1列出了可用于本发明的在数种REV编码序列中产生miRNA结合位点突变的核苷酸变化的更多的非限制性实例。本领域技术人员能够根据本发明的教导创造出更多的突变。
[0053] 表1.在多种REV编码序列中创建miRNA结合位点突变的核苷酸改变
[0054]

[0055]
[0056] 本发明的突变体多核苷酸可以通过本领域熟知的诱变方法人工产生，或所述突变
体生长和/或发育相关基因自然发生而未使用人工诱变方法。早现终止密码子后，多核苷酸将进一步包含将编码来自生长和/或发育蛋白的氨基酸(如果蛋白质表达的话)的核苷酸序列。所述终止密码子后的核苷酸可以编码多至全长蛋白的氨基酸，但也可以编码具有插入或缺失一个或多个氨基酸残基的生长和/或发育蛋白。早现终止密码子插入编码序列阻止了终止密码子后的核苷酸序列编码的氨基酸的翻译，并且不翻译出功能性蛋白。[0057] 此外，突变的生长和/或发育相关蛋白与表达质粒中的早期胚特异性启动子可操
作地连接。随后，可以转化包含所述突变的基因和启动子的表达质粒进入植物或植物细胞。不可预知的是，包含所述具有改变的mRNA的突变转基因的植物或植物细胞产生展现出种子大小增加和/或种子数增加的植物。在一个具体的实施方案中，突变REVOLUTA(REV)基因的mRNA以在REV蛋白中包含一个或多个终止密码子，例如，在对应拟南芥REV蛋白(SEQIDNO：1)的氨基酸11和18的氨基酸残基位置包含两个终止密码子。此外，此处公开的方
法中突变的REV转基因(REVstop)是在胚发育、胚乳发育、或穗发育过程中启动表达的启动
子的调节下，例如，特别是在早期特异性胚发育过程中启动表达。在早期胚发育中表达的具有提前终止密码子(REVstop)的REV转基因不导致在转基因成熟植物的腹/背轴叶和/或茎发育中的异常。
[0058] 应当指出，本发明还包含其他包含提前终止密码子的生长和发育相关基因的突变体，其导致转基因植物具有由增加的产量，如由种子大小和/或种子数的增加所代表的。如本文所使用的，植物生长和/或发育相关基因是这样的基因，其在决定植物的生长速率、总体大小、组织大小或组织数目中起作用，或者在导致组织身份和形态的决定的植物发育程序中起作用。当通过突变、过表达、或表达的抑制来修饰其功能导致改变的植物生长速率、总体植物大小、组织大小或数目、或改变的发育时，鉴定出这样的生长和发育相关基因。植物生长和/或发育相关基因可以通过许多机制发挥其效应，其中一些包括细胞周期的调节、植物激素合成/分解途径、对植物激素的敏感性、细胞壁生物合成、细胞身份决定等。在本公开中，突变植物生长和/或发育基因以在编码序列最先的约20％至不到80％内包含一个或多个提前终止密码子。
[0059]通过过表达或抑制分析，许多植物基因已显示在生长和/或发育中起作用。已知参与生长和/或发育并且可以在本发明的方法中使用或测试的基因中的一些但并非所有的实施例在下文中讨论。拟南芥CAP基因编码参与Ras-cAMP信号传导和肌动蛋白细胞骨架的调节的环化酶相关蛋白。由于表皮和叶肉细胞的延伸减少，CAP在糖皮质激素诱导型启动子下的过表达引起肌动蛋白丝的丧失和叶大小的减少(Barrero等，AnnalsofBotany
91：599-603，2003)。棉花中蔗糖合酶基因表达的抑制导致减少的细胞纤维长度以及更小且更少的纤维细胞(Yong-LingRuan等，PlantCell15：952-964，2003)。使用ABA诱导型启动子在转基因稻中过表达稻组蛋白脱乙酰酶1基因导致与野生型相比具有生长速率的增加以及异常的苗和根组织发育的植物(In-CheolJang等，PlantJ.33：531-541，2003)。在拟南芥中经由RNAi对于E2Fc的抑制增加了叶、分生组织和中柱鞘细胞中的增殖活性。器官中的细胞比野生型中更小但更众多，并且在叶中存在减少的倍性水平(delPozo等，PlantCell18：2224-2235，2006)。经由RNAi对于BKI基因的抑制导致具有增加的下胚轴长度的幼苗，并且BKI的过表达产生矮化植物(Xuelu和Chory，Science313：1118-1122，2006)。此外，表达部分组成性的类固醇受体BRI1的转基因植物具有更长的下胚轴(Wang等，Dev.Cell8：855-865，2005)。拟南芥中Argos-Like(ARL)的抑制产生更小的子叶、叶和其他侧生器官，而过表达产生相反的效应。器官大小的变化可以归因于细胞大小而不是细胞数目(Hu等，PlantJ.47：1-9，2006)。
[0060]对于具有导致改变的生长和/或发育表型的突变的植物所进行的分析已鉴定出了许多在植物生长和发育中起作用的基因。影响油菜素类固醇激素感受(即bri1-5)的突变导致矮化植物(Wang等，Dev.Cell8：855-865，2005)。在编码酰基-酰基载体蛋白硫酯酶的拟南芥FATB基因中的T-DNA插入(敲除)导致减少的生长速率、减少的鲜重和低种子存活力(Bonaventure等，PlantCell15：1020-1033，2003)。Pepino(一种推定的抗-磷酸酶)中的功能丧失突变在苗顶端分生组织处显示出肿瘤样细胞增殖并且产生多余的异常叶(Haberer等，Dev.GenesEvol.212：542-550，2002)。拟南芥RGS基因(G蛋白信号传导的调节剂)具有G蛋白偶联受体(GPCR)的结构并且包含RGS盒。RGS蛋白加速Gα亚
基的失活并因此降低GPCR信号传导。无效rgs突变体(nullrgsmutant)在黑暗中生长
时在下胚轴中具有增加的细胞延长，而在光照下生长时在根中具有增加的细胞产生(Chen等，Science301：1728-1731，2003)。拟南芥TIP1基因在根毛发育中以及还在细胞生长中起作用。tip1-2突变体具有更小的莲座型叶、减少的高度和更短的节间(Ryan等，NewPhytol.138：49-58，1998；和Hemsley等，PlantCell17：2554-2563，2005)。产生极少或不产生BigBrothermRNA的BigBrother(BB)基因的突变体(染色体重排或T-DNA插入)发育出更大的花器官、更多的花生物量和更粗的茎。相对地，BigBrother的过表达导致更小的花器官、更少的花生物量、更细的茎和减少的叶大小。BB可以改变细胞数(Disch等，Curr.Biol.16：272-279，2006)。
[0061]此外，RHD2基因编码对于活性氧类物质在根毛中的积聚和钙通道的后续活化而言重要的NADPH氧化酶。rhd2突变体在根的尖端生长中细胞的细胞膨胀方面具有缺陷(Foreman等，Nature422：442-446，2003)。玉米中的微小突变引起由INCW2基因表达的细胞壁转化酶的丧失。mn1突变体的细胞比野生型更小，且mn1种子突变体仅具有野生型种子的胚乳重量的20％。膨胀可在mn1胚乳的周围层的细胞中受损，并且可以导致这些细胞减少的有丝分裂活性(Vilhar等，PlantPhysiol.129：23-30，2002)。WAK2的T-DNA插入突变体wak2-1在根中具有减少的细胞延长。WAK2可以通过调节液泡转化酶活性来控制细胞膨胀。在植物中WAK2或WAK4的诱导型反义物的表达阻止了细胞延长并产生矮化植物(Wagner和Kohom，PlantCell13：303-318，2001；Lally等，PlantCell13：1317-1331，
2001；和Kohom等，PlantJ.46：307-316，2006)。拟南芥基因AP2在花器官身份中和在花分生组织身份的建立中起作用。与野生型相比较，AP2中的功能丧失突变产生增加的种子质量(Masa-Ohto等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA102：3123-3128，2005)。teb突变体具有较短的根、锯齿状的叶和扁化。它们显示出在细胞分裂方面的缺陷，这可能是由于在G2/M细胞周期进展方面的缺陷而引起的(Inagaki等，PlantCell18：879-892，2006)。
[0062]植物中的REVOLUTA以前已经描述过。例如，参见PCT专利公开号WO2001/033944A1，WO2007/079353A1，WO2004/063379A1，Talbert等，“TheREVOLUTAgeneisnecessaryforapicalmeristemdevelopmentandforlimitingcelldivisions
intheleavesandstemsofArabidopsisthaliana.”Development.1995Sep；
121(9)：2723-35；Otsuga等，“REVOLUTAregulatesmeristeminitiationatlateralpositions”，PlantJ.2001Jan；25(2)：223-36；和Prigge等，“ClassIIIHomeodomain-LeucineZipperGeneFamilyMembersHaveOverlapping，Antagonistic，andDistinctRolesinArabidopsisDevelopment，”ThePlantCell，Vol.17，61-76，将每一篇文献通过述及整体并入本文。
[0063]如本文所使用的，植物生长和/或发育相关基因是这样的基因，其在决定植物的生长速率、总体大小、组织大小或组织数目中起作用，或者在导致组织身份和形态的决定的植物发育程序中起作用。当通过突变、过表达、或表达的抑制来修饰其功能而导致改变的植物生长速率、总体植物大小、组织大小或数目、或改变的发育时，鉴定出这样的生长和发育相关基因。植物生长和/或发育相关基因可以通过许多机制发挥其效应，其中一些包括细胞周期的调节、植物激素合成/分解途径、对植物激素的敏感性、细胞壁生物合成、细胞身份决定等。适合用于本公开方法的植物生长和/或发育相关基因还包含miRNA结合位点，而
且所述基因的表达和/或活性是由一个或多个miRNA的结合控制的。同样，如本文所使用
的突变的植物生长和/或发育相关基因是在编码miRNA结合位点的核苷酸序列中有改变，使得控制性miRNA无法显著地结合至其结合位点的植物生长和/或发育基因。因此，突变的植物生长和/或发育相关基因编码的蛋白是过表达的。
[0064]通过过表达或抑制分析，已经表明大量其他植物基因在生长和/或发育中发挥作用，并通过核苷酸序列分析表明这些基因包含miRNA结合位点。本文下面对一些，但并非所有的，已知涉及生长和/或发育并能够在本发明的方法中使用或测试的基因的实施例进行了讨论。
[0065]对具有导致改变的生长和/或发育表型的突变的植物进行的分析已鉴定了大量在植物生长和发育中发挥作用的包含miRNA结合位点的基因。以下转载自Wang等(inEncyclopediaofLifeSciences，JohnWileyandSons，Ltd.，2007)的表2列出了大量包含miRNA结合位点并与发育和/或生长相关表型相关的基因的实施例。从Reinhart等转载的表3列出了分离自拟南芥的miRNA。
[0066]

[0067]
[0068] 表3拟南芥微小RNA
[0069]

[0070]术语“生长和/或发育基因”或“生长和/或发育转基因”在本文中用于指任何这
样的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码或促进由该基因编码的核苷酸或蛋白质的表达和/或产生。因此，术语“生长和/或发育基因”或“生长和/或发育转基因”可以包括位于核苷酸和/或蛋白质编码序列侧翼的序列。例如，所述序列可以包括下述那些核苷酸序列，所述核苷酸序列为蛋白质编码序列(外显子)、间插序列(内含子)、包含对于该基因正常表达而言所需的序列的侧翼5’和3’DNA区(即，分别为启动子和polyA添加区，以及任何增强子序列)。
[0071]术语“生长和/或发育蛋白质”、“生长和/或发育同源物”或“生长和/或发育相关直向同源物”在本文中用于指这样的蛋白质，所述蛋白质具有调节植物的生长速率、总体大小、组织大小或组织数目或者调节植物发育程序(其导致组织身份和形态的决定)的能
力(当在本发明方法的实践中使用时)，和具有与所述蛋白质的氨基酸序列至少约70％相
同、更通常地至少约75％相同、和更通常地至少约80％相同的氨基酸序列的蛋白质。
[0072] 如本文所使用的，“胚特异性基因”是在植物中的胚发育期间优先表达的基因。对本公开内容而言，胚发育从合子中的第一次细胞分裂开始，并持续至整个胚发育的晚期
(特征在于成熟、干燥和休眠)，并且以产生成熟且干燥的种子作为结束。胚特异性基因可以进一步分类为“早期特异性的”和“晚期特异性的”。早期特异性基因是直至胚形态发生结束时在胚中表达的那些基因。晚期特异性基因是在从成熟直到产生成熟且干燥的种子时表达的那些基因。在早期胚发育期间起始表达并且为早期特异性的胚特异性基因的实施例是本领域已知的。参见例如，WO2007/079353和US5,965,793，每篇通过述及整体并入本文。这些胚特异性基因的启动子可用于表达包含突变的miRNA结合位点的生长和/或发育相关基因。早期特异性胚启动子可以包括，例如，与氨基酸通透酶基因(AAP1)、油酸12-羟化酶:去饱和酶基因、2S2白蛋白基因(2S2)、脂肪酸延长酶基因(FAE1)、叶状子叶2基因(LEC2)、叶状子叶1基因(LEC1)、天冬氨酸蛋白酶基因(ASP)、或油质蛋白基因相关的启动子。本公开的典型的遗传构建体包含来自拟南芥的AAP1启动子、来自Lesquerellafendleri的油酸12-羟化酶:去饱和酶启动子(LFAH12)，来自拟南芥的2S2基因启动子，来自拟南芥的脂肪酸延长酶基因启动子，来自拟南芥的叶状子叶2基因启动子，来自玉米的叶状子叶1基因启动子(ZmLEC1)，来自稻或玉米的天冬氨酸蛋白酶1基因启动子(OsAsp1或ZmAsp1)，或来自玉米的油质蛋白基因启动子(ZmOLE)。
[0073]如本文所使用的“胚乳特异性基因”是在植物胚乳中优先表达的基因。胚乳特异性基因的非限制性实施例包括稻谷蛋白GluB-1基因、稻谷蛋白GluB-4基因、醇溶蛋白基因、麦醇溶蛋白和大麦醇溶蛋白基因(Forde等，NucleicAcidsResearch，1985，13，
7327-7339)，来自多种物种的贮藏蛋白基因、玉米醇溶基因(Quayle和Faix，Molecularand
GeneralGenetics，1992，231，369-374)，和豆球蛋白1A(LEG1A)基因。
[0074] 如本文所使用的“穗特异性基因”是在植物穗(雌花序)中优先表达的基因。穗特异性基因的非限制性实施例包括玉米ZAG1基因(ZmZAG1)和玉米CLAVATA1基因。[0075] “异源序列”是来源于不同物种的寡核苷酸序列，或者如果来自相同物种，则距其最初形式在实质上得到了修饰。例如，与结构基因可操作地连接的异源启动子来自与该结构基因所源自的物种不同的物种，或者如果来自相同物种，则距其最初形式在实质上得到了修饰。
[0076] 术语“载体”指通常为双链的DNA片段，其可以在其内插入外源DNA片段。载体或复制子可以例如是质粒或病毒来源的。载体包含有助于载体在宿主细胞中自主复制的“复制子”多核苷酸序列。在本公开内容的语境下，术语“复制子”还包括靶向或者以其他方式促进载体序列重组入宿主染色体中的多核苷酸序列区。此外，虽然可以在最初将外源DNA插入到例如DNA病毒载体中，但是将病毒载体DNA转化到宿主细胞中可导致病毒DNA转换成病毒RNA载体分子。外源DNA被定义为异源DNA，其是在宿主细胞中天然不存在的DNA，其例如复制载体分子、编码可选择或可筛选标记或转基因。载体用于将外源或异源DNA运输到合适的宿主细胞内。一旦在宿主细胞中，载体就可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，并且可以产生载体及其插入的DNA的数个拷贝。备选地，载体可以将外源或异源DNA靶向插入至宿主染色体中。此外，载体还可以包含必需元件，所述元件
允许所插入的DNA转录成mRNA分子，或者以其他方式引起所插入的DNA复制成多个拷贝的
RNA。某些表达载体另外还包含与所插入的DNA邻近的序列元件，其允许mRNA翻译成蛋白质分子。因此，可以快速合成许多由所插入的DNA编码的mRNA和多肽分子。
[0077] 术语“转基因载体”指包含所插入的DNA区段(即“转基因”)的载体，所述DNA区段在宿主细胞内转录成mRNA或复制为RNA。术语“转基因”不仅指所插入的DNA的被转化成RNA的那个部分，还指载体中对于所述RNA的转录或复制而言所必需的那些部分。此外，转基因不一定包含这样的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含能够产生蛋白质的开放读码框。
[0078]术语“转化的宿主细胞”、“转化的”和“转化”指将DNA引入细胞中。该细胞称为“宿主细胞”，并且它可以是原核或真核细胞。典型的原核宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)的各种菌株。典型的真核宿主细胞是植物细胞(例如，双低菜、棉花、亚麻荠、苜蓿、大豆、甘蔗、稻、燕麦、小麦、大麦或玉米细胞等)、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。引入的DNA通常为包含插入的DNA片段的载体形式。引入的DNA序列可以来自与宿主细胞相同的物种或者来自与宿主细胞不同的物种，或者它可以是包含一些外源DNA和一些源自宿主物种的DNA的杂合DNA序列。
[0079]术语“植物”包括整株植物、植物器官(例如，叶、茎、花、根等)、种子和植物细胞(包括组织培养细胞)及其后代。可以在本发明公开的方法中使用的植物类别一般与顺应于转化技术的高等植物类别一样广泛，包括单子叶和双子叶植物，以及某些低等植物如藻类，如蓝细菌等等。它包括各种倍性水平的植物，包含多倍体、二倍体、六倍体、四倍体、单倍体等等。
[0080] “异源序列”是来源于外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则距其最初形式在实质上得到了修饰。例如，与结构基因可操作地连接的异源启动子来自与该结构基因所源自的物种不同的物种，或者如果来自相同物种，则距其最初形式在实质上得到了修饰。[0081] 术语“REVOLUTA基因”、“REV”或“REVOLUTA转基因”在本文中用于指编码或促进REVOLUTA蛋白的表达和/或产生的任何多核苷酸序列。因此，术语“REVOLUTA基因”或“REVOLUTA转基因”可以包括REVOLUTA蛋白编码序列侧翼的序列。例如，所述序列可以包括下述那些核苷酸序列，所述核苷酸序列为蛋白质编码序列(外显子)、间插序列(内含子)、包含对于REVOLUTA基因正常表达而言所需的序列的侧翼5′和3′DNA区(即，分别为启动子和polyA添加区，和任何增强子序列)。如本文所使用的突变REVOLUTA基因在包含miRNA结合位点的核苷酸序列中具有改变，使得控制性miRNA不显著地结合到它们的结合位点。因此，突变REVOLUTA基因编码的REVOLUTA蛋白是过表达的。
[0082]术语“REVOLUTA蛋白”、“REV”、“REVOLUTA同源物”或“REVOLUTA直向同源物”在本文中用于指具有调节植物细胞分裂的能力(当在本发明公开的方法的实践中使用时)的蛋白质、同源结构域、亮氨酸拉链区、和具有与在WO01/33944和WO04/63379(通过提及而整体合并入本文)中所述的REVOLUTA的氨基酸序列至少约70％相同、更通常地至少约
75％相同、和更通常地至少约80％相同的氨基酸序列的蛋白质。如本文所述，术语“同源物(homolog/homologue)”是指具有类似于来自另一物种的核酸或肽序列的共同起源和功能的核酸或肽序列。
[0083]备选地，术语“REVOLUTA蛋白”、“REV”、“REVOLUTA同源物”或“REVOLUTA直向同源
物”在本文中用于指被鉴定为与HD-ZIPIII类的植物转录因子的非REVOLUTA成员不同的
REVOLUTA蛋白。HD-ZIPIII类的蛋白质的REVOLUTA成员的特征在于，缺乏或不存在在WO
01/33944(通过提及而整体合并入本文)的图4A中所描述的REVOLUTA氨基酸序列的氨基酸残基143和144之间的、存在于非REVOLUTAHD-ZIPIII蛋白中的特征性氨基酸序列插入。命名为Athb-8、Athb-9(Phavaluta)、Athb-14(Phabulosa)和Athb-15(Corona)的来自拟南芥的同源异型框转录因子是非REVOLUTAHD-ZIPIII蛋白，并且全部在REVOLUTA氨基酸序列的氨基酸残基143和144之间具有特征性的氨基酸序列插入。WO01/33944中公开的拟南芥、稻和番茄的5种REVOLUTA氨基酸序列全部在REVOLUTA氨基酸序列中的这个位置处缺乏4-6个氨基酸残基插入。这种氨基酸序列插入的缺乏是REVOLUTA蛋白的区别性和定义性的特征。如本文所使用的术语，任何编码REVOLUTA蛋白的多核苷酸序列的miRNA结合位点的改变导致所述蛋白的过表达，并且通常导致包括与包含野生型REVOLUTA基因的植物相比增加的种子大小和/或种子数的植物表型。
[0084] 术语“百分比同一性”是指当使用计算机程序例如下文鉴定的程序来并排比对2个氨基酸序列或2个核酸序列时，占据相同的相对位置的氨基酸或核苷酸的百分比。术语“百分比相似性”是2个所比较的蛋白质序列的相关程度的统计学量度。百分比相似性通过计算机程序来进行计算，所述计算机程序为每个进行比较的氨基酸对指定一个数值，其基于化学相似性(例如，所比较的氨基酸是否是酸性的、碱性的、亲水性的、芳香族的等)和
/或进化距离(如通过使编码所比较的氨基酸对的一个成员的密码子转变成编码该对的另一个成员的密码子所需的最低数目的碱基对改变所测量的)。在已通过迭代比较所有可能的比对而凭经验进行了2个序列的最佳拟合比对后，进行计算(参见例如，Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915-10919，1992)。
[0085] 多核苷酸序列的“基本同一性(substantialidentity)”这一术语是指，使用下文描述的程序并使用标准参数与参考序列相比较时，多核苷酸包含具有至少60％序列同一性、通常地至少70％、更通常地至少80％和最通常地至少90％的序列。技术人员应认识到，这些值可以进行适当调整以确定由2个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性，其中考虑了密码子简并性、氨基酸相似性、读码框定位等。
[0086]氨基酸序列同一性可以例如以下述方式进行测定。由生长和/或发育相关基因例如REVOLUTA编码的蛋白质的氨基酸序列的部分，可以用于搜索核酸序列数据库，例如GenBank数据库，其使用程序BLASTP版本2.0.9(Atschul等，Nucl.AcidsRes.25：
3389-3402，1997)。2个(或更多)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过在“比较窗”上比较2个序列的序列来进行，以鉴定并比较具有序列相似性的局部区域。如本文所使用的，“比较窗”指至少约20个连续位置、通常地约50-约200个、更通常地约100-约150个的区段，其中在2个序列进行最佳比对后，可以将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列相比较。
[0087]用于比较的序列最佳比对可以通过下述方式来进行：局部同一性或相似性算法，例如在Smith等，Adv.Appl.Math.2：482，1981中描述的那些；Needleman等，J.Mol.Biol.48：443-453，1970的同源性比对算法；Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：
2444-2448，1988的相似性搜索方法；这些算法的计算机化执行(WisconsinGenetics
SoftwarePackage，GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，WI中的GAP、
BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或目视检查。
[0088]有用的算法的一个实施例是PILEUP。PILEUP使用渐进的、成对比对而由一组相关序列产生多重序列比对，以显示相互关系和序列百分比同一性。它还绘制显示出用于产生比对的聚类关系的树或树状图。PILEUP使用简化的Feng等，J.Mol.Evol.35：351-360，
1987的渐进比对方法。所使用的方法类似于由Higgins等，CABIOS5：151-153，1989描述的方法。该程序可以比对高达300个序列，每个序列的最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。多重比对过程从2个最相关序列的成对比对开始。这个聚簇(cluster)随后与下一个最相关序列或经比对的序列的聚簇进行比对。2个序列聚簇可以通过2个单独序列的成对比对的简单延伸来进行比对。最终比对通过一系列渐进的、成对比对来完成。该程序通过指定序列比较区域的特定序列及其核苷酸或氨基酸坐标(coordinate)和通过指定程序参数来运行。例如，可以将参考序列与其他测试序列进行比较以测定序列百分比同一性关系，其使用下述参数：缺省缺口权重(3.00)、缺省缺口长度权重(0.10)、和加权末端缺口。[0089] 适合于测定序列百分比同一性和序列相似性的算法的另一个实施例是BLAST算法，其在Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990中得到描述。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公开获得。这种算法包括，首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字(shortword)来鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，所述HSP匹配或满足某一正值阈值得分T。T称为邻近字得分阈值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschul等，同上)。这些最初邻近字的命中用作起始搜索的种子，以找到包含它们的更长的HSP。随后，字命中(wordhit)沿着每个序列在两个方向上进行延伸，直到可以增加累积比对得分。在下列情况时，停止字命中在每个方向上的延伸：累积比对得分比其达到的最大值减少X量；由于一个或多个负得分残基比对的积聚，累积得分变成零或零以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序作为缺省使用：字长(W)为11、BLOSUM62评分矩阵(参见，Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915-10919，1992)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。
[0090]除了计算序列百分比同一性外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计分析(参见，例如Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877，1993)。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小加和概率(P(N))，它提供了对两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的概率指示。例如，如果比较测试中的最小加和概率小于约0.1、更优选地小于约0.01、和最优选地小于约0.001，那么核酸被视为与参考序列类似。用于序列比对和序列相似性分析的另外方法和算法是技术人员众所周知的。
[0091]在所插入的编码miRNA抗性生长和/或发育基因的多核苷酸序列进行转录和翻译以产生功能性多肽的情况下，技术人员会认识到，由于密码子简并性，许多多核苷酸序列将编码相同的多肽。这些变体特别地由术语“生长和/或发育基因”和“生长和/或发育转基因”，以及具体地由“REVOLUTA基因”和“REVOLUTA转基因”所涵盖。此外，这些术语特别地包括那些全长序列，所述全长序列与基因序列基本上相同并且编码保留了该基因产物例如REVOLUTA的功能的蛋白质。如果如上所述就最大对应性(correspondence)进行比对时，两个序列中的核苷酸或氨基酸残基的序列分别相同时，那么这两个核酸序列或多核苷酸被说
成是“相同的”。术语“与......互补”在本文中用于指，互补序列与参考多核苷酸序列的
全部或部分是相同的。
[0092]生长和/或发育相关基因和生长和/或发育相关蛋白质，例如REVOLUTA基因和REVOLUTA蛋白序列的氨基酸序列中的变异和改变在WO01/33944中得到描述，所述专利通过提及而合并入本文。目的基因例如REVOLUTA基因、多核苷酸或多核苷酸序列可以从任何植物物种中进行分离或获得。在本发明公开的一个具体实施方案中，所使用的REVOLUTA基因序列是来自拟南芥的，但也可以使用来自其他感兴趣物种的REVOLUTA基因。例如，来自玉米(玉蜀黍(Zeamays))的REVOLUTA的核苷酸序列和氨基酸序列在WO2004/063379(通过提及而整体合并入本文)中得到描述，稻、番茄、大豆、亚麻等等。同样，来自一种植物的生长和/或发育基因可用于另一种植物，即异源转化，或来自一个植物物种的生长和/或发育基因可以突变和用于转化同一植物物种，即同源转化。在其他实施方案中，可以修饰或突变来自单子叶植物的生长和/或发育基因并用于转化另一种单子叶植物，或者可以修饰或突变来自双子叶植物的生长和/或发育基因并用于转化另一种双子叶植物。在其他实施方案中，可以修饰或突变来自单子叶植物的生长和/或发育基因并用于转化双子叶植物，反之亦然。
[0093]术语“生物学活性”、“生物学上具有活性的”、“活性”、“具有活性的”、“生物学功能”、“REV生物学活性”和“功能上具有活性的”指目的蛋白质例如REVOLUTA蛋白进行二聚化(或以其他方式装配成蛋白质寡聚体)的能力，或者调节或以其他方式影响天然野生型(例如，内源的)REVOLUTA蛋白二聚化的能力。然而，所述术语还意欲包括目的蛋白质例如
REVOLUTA蛋白与其他分子结合和/或相互作用的能力，所述其他分子包括例如但不限于，包含由该蛋白质例如REVOLUTA蛋白所识别的在启动子区中的特异性核苷酸序列的DNA，并且所述结合和/或相互作用事件介导植物细胞分裂并最终赋予表型；或者包括调节或以其他方式影响其他分子与天然野生型蛋白质结合和/或相互作用的能力，并且所述结合和/或相互作用事件介导植物细胞分裂并最终赋予与该目的基因相关的表型。本领域技术人员能够产生衍生自本发明中的REV蛋白、具有一个或多个修饰的生物学活性的REV变体及其编码REV基因。如本文所述，术语“蛋白质修饰”是指本领域熟知的，例如，氨基酸取代、氨基酸修饰、缺失、和/或插入。修饰可以是保守取代或非保守取代。下表展示示例性保守氨基酸取代。
[0094]表4.保守氨基酸取代
[0095]

[0096] 如本文所使用的，REV表型意指由REV核酸或蛋白质所赋予的表型，并且特别包含其中展示出种子大小或种子数增加的特性。通常，REV表型通过检查在胚发育期间，例如，在早期特异性胚发育期间，过表达REV的植物来确定，其中可以将来自所述植物的种子数和大小与在亲本或野生型植物的相应组织中的种子数和大小进行比较。在具有代表性数目的植物的植物群体内，具有REV表型的植物在种子数和/或大小方面具有统计上显著的变化。在本发明的一些实施方案中，本发明的转基因植物的种子大小与对照植物，例如，野生型植物或包含对照载体(例如，在本发明的启动子控制下不表达REV基因的载体)的植物相比，增加了约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约
65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约150％、约200％、约
250％、约300％、约350％、约400％、或更多。在一些其他实施方案中，本发明的转基因植物的种子数，以每株植物或每英亩计算，与对照植物，例如，野生型植物或包含对照载体的植物相比，增加了约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约
65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约150％、约200％、约
250％、约300％、约350％、约400％、或更多。仍然在一些实施方案中，与对照植物，例如，野生型植物或包含对照载体的植物相比，本发明的转基因植物的种子大小和种子数均增加了。
[0097]本发明的突变的植物生长和/或发育相关基因，例如REVstop转基因，包含提前终止密码子插入编码REV的核苷酸序列的核苷酸改变。特别地，突变意图终止编码REV的氨基酸序列的产生，但产生与REV编码序列大致相似的RNA序列。然而不想被特定的作用
机制约束，两种机制是可能的。首先，包含提前终止密码子的REV转基因(REVstop)转录
成mRNA而过量的REVstopmRNA可能被植物视为异常的。随后，过量的REVstopmRNA可能导致内源性REV基因座的沉默，例如通过共抑制，因此，REV蛋白的缺乏将导致种子产量增加。或者，REVstopmRNA确实包含miRNA结合位点的序列，使得植物中存在的内源性miRNA
165/166可能结合到统计学上高百分比的突变体REVstopmRNA上。同样，可用于抑制内源性REVmRNA的miRNA165/166的量将降低，导致统计学上显著量的内源性野生型REVmRNA不由miRNA165/166实质性结合。这一修饰将允许内源性REV蛋白的过表达而且转基因植物产生的种子的数目和/或大小将在统计学上增加。此外，核苷酸序列的进一步突变或改变，而因此，可以选出氨基酸序列以使得mRNA编码的氨基酸序列要么是不变的，或者如果改变也不会实质性改变产生蛋白的REV氨基酸序列。同样，突变可以创建被视为对通常发现于REV氨基酸序列同一位置的氨基酸残基的保守取代的氨基酸的密码子。在本发明一个具体实施方案中，诱变在拟南芥REV编码序列(SEQIDNO：8)中创建了在核苷酸31处A到T的改变和在核苷酸52处A到T的改变，导致拟南芥REV蛋白(SEQIDNO：1)的氨基酸位置11和18上的精氨酸转化为终止密码子并形成REVstop转基因(SEQIDNO：42)。除了在氨基酸残基位置11和18插入提前终止密码子外，这些改变不影响mRNA编码的REV的整体氨基酸序列。
[0098]可以通过各种诱变方法中的任一种产生感兴趣的蛋白的编码序列的突变。上述多种方法是本领域已知的，包括位点定向诱变、寡核苷酸定向诱变和许多其他方法。例如，Smith(Ann.Rev.Genet.19：423-462，1985)及其参考文献；Botstein&Shortle(Science
229：1193-1201，1985)；和Carter(Biochem.J.237：1-7，1986)描述了位点定向诱变。例如，Zoller&Smith(Nucl.AcidsRes.10：6487-6500，1982)描述了寡核苷酸定向诱变。例如，Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492，1985)和Taylor等(Nucl.AcidsRes.13：
8765-8787，1985)描述了使用修饰碱基的诱变。例如，Kramer等(Nucl.AcidsRes.12：
9441-9460，1984)描述了使用带缺口的双链体DNA的诱变。例如，Kramer等(Cell38：
879-887，1984)描述了点错配诱变。例如，Mandecki(Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：
7177-7181，1986)，和Arnold(CurrentOpinioninBiotechnology4：450-455，1993)描述了双链断裂诱变。例如，Carter等(Nucl.AcidsRes.13：4431-4443，1985)描述了使用修复缺陷宿主菌株的诱变。例如，Nambiar等(Science223：1299-1301，1984)描述了通过全基因合成的诱变。例如，Stemmer(Nature370：389-391，1994)和Stemmer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751，1994)描述了DNA改组。
[0099]MethodsinEnzymologyVolume154，entitled“RecombinantDNA，PartE”，
1988中进一步描述了上述方法中的许多种，还描述了解决各种诱变方法中的问题的有用的对照。用于诱变、文库构建和其他多样性产生方法的试剂盒也是市售的。例如，试剂盒可获得自AmershamInternationalplc(Piscataway，N.J.)(例如，使用上述的Eckstein方 法)，Bio/CanScientific(Mississauga，Ontario，CANADA)，Bio-RadLaboratories(Hercules，CA)(例如，使用上述的Kunkel方法)，BoehringerMannheimCorp.(Ridgefield，Conn.)，ClonetechLaboratoriesofBDBiosciences(PaloAlto，Calif.)，DNATechnologies(Gaithersburg，Md.)，EpicentreTechnologies(Madison，Wis.)(例如，5prime3prime试剂盒)；GenpakInc.(StonyBrook，N.Y.)，Lemargo
Inc(Toronto，CANADA)，InvitrogenLifeTechnologies(Carlsbad，Calif.)，New
EnglandBiolabs(Beverly，Mass.)，PharmaciaBiotech(Peapack，N.J.)，PromegaCorp.(Madison，Wis.)，QBiogene(Carlsbad，Calif.)，和Stratagene(LaJolla，Calif.)(例如，QuickChangeTM位点定向诱变试剂盒和ChameleonTM双链、位点定向诱变试剂盒)。
[0100]通常，适合于与植物生长和/或发育相关基因可操作地连接并使用所描述的本发明方法表达的启动子通常在胚中具有更大的表达，而在其他植物组织中具有更低的表达或无表达。特别感兴趣的是在胚发育中，例如早期特异性胚发育中起始表达的那些启动子序列。早期特异性启动子是在拟南芥中在授粉后第7天(手杖(walkingstick))前或者在另一个植物物种中的等同阶段起始蛋白质表达的启动子。特别感兴趣的启动子序列的实施例包括用于氨基酸通透酶基因(APP1)的启动子(例如，来自拟南芥的AAP1启动子)(Hirner等，PlantJ.14：535-544，1998)，用于油酸12-羟化酶:去饱和酶基因的启动子(例如，来自Lesquerellafendleri的被命名为LFAH12的启动子)(Broun等，PlantJ.13：201-210，
1998)，用于2S2白蛋白基因的启动子(例如，来自拟南芥的2S2启动子)(Guerche等，Plantcell2：469-478，1990)，脂肪酸延长酶基因启动子(FAE1)(例如，来自拟南芥的FAE1启动子)(Rossak等，PlantMol.Biol.46：717-715，2001)，和叶状子叶基因启动子(LEC2)
(例如，来自拟南芥的LEC2基因启动子)(Kroj等，Development130：6065-6073，2003)。其他感兴趣的早期胚特异性启动子包括但不限于，ZmLEC1(Zhang等，Planta215(2)：
191-194)，OsASP1(Bi等，PlantCellPhysiol4691)：87-98)，Seedstick(Pinyopich等，Nature424：85-88，2003)，Fbp7和Fbp11(牵牛(Petunia)Seedstick)(Colombo等，PlantCell.9：703-715，1997)，Banyuls(Devic等，PlantJ.19：387-398，1999)，ag1-15和ag1-18(Lehti-Shiu等，PlantMol.Biol.58：89-107，2005)，Phe1(Kohler等，Genes
Develop.17：1540-1553，2003)，Per1(Haslekas等，PlantMolBiol.36：833-845，1998；
Haslekas等，PlantMol.Biol.53：313-326，2003)，emb175(Cushing等，Planta221：
424-436，2005)，L11(Kwong等，PlantCell15：5-18，2003)，Lec1(Lotan等，Cell93：
1195-1205，1998)，Fusca3(Kroj等，Development130：6065-6073，2003)，tt12(Debeaujon等，PlantCell13：853-871，2001)，tt16(Nesi等，PlantCell14：2463-2479，2002)，A-RZf(Zou和Taylor，Gene196：291-295，1997)，TtG1(Walker等，PlantCell11：
1337-1350，1999；Tsuchiya等，PlantJ.37：73-81，2004)，Tt1(Sagasser等，GenesDev.16：138-149，2002)，TT8(Nesi等，PlantCell12：1863-1878，2000)，Gea-8(胡萝卜)(Lin和Zimmerman，J.Exp.Botany50：1139-1147，1999)，Knox(稻)(Postma-Haarsma等，PlantMol.Biol.39：257-271，1999)，油质蛋白(Plant等，PlantMol.Biol.25：193-205，
1994；Keddie等，PlantMol.Biol.24：327-340，1994)，ABI3(Ng等，PlantMol.Biol.54：
25-38，2004；Parcy等，PlantCell6：1567-1582，1994)，等等。
[0101]适合于在本方法中使用的启动子可以来自与待转化的植物相同的物种或可以来自异源物种。此外，启动子可以来自与待使用REV转基因的相同的物种，或者它可以来自异源物种。在本发明的方法中使用的启动子还可以包括嵌合启动子，其可以包括与上述那些中的一种或多种具有相同的表达谱的启动子的组合。在本发明的一个实施方案中，将来自拟南芥的AAP1基因启动子，或其功能性部分与拟南芥REV基因相组合，并用于构建转基因双低菜(欧洲油菜)。此外，在本发明的另外一个实施方案中，来自Lesquerellafendleri
的油酸12-羟化酶:去饱和酶基因启动子LFAH12，或其功能性部分与拟南芥REV基因可操
作地连接，并用于构建转基因双低菜(欧洲油菜)。上述转基因植物中的每一种显示了本发明方法的REV表型特征，其中修饰的REV在早期胚发育中过表达，导致增加的种子大小和/或种子数。在其他实施方案中，修饰的REV基因与胚乳特异性启动子(例如，ZmLEG1A基因启动子)，或者穗特异性启动子(例如，ZmZAG1基因启动子或ZmCLV1基因启动子)可操作地连接。
[0102] 应当指出，上述的启动子仅仅是可以在本发明的方法中使用的代表性启动子。用于鉴定和表征植物基因组DNA中的启动子区的方法是技术人员众所周知的，并且包含例如，由Jordano等，PlantCell1：855-866，1989；Bustos等，PlantCell1：839-854，1989；Green等，EMBOJ.7：4035-4044，1988；Meier等，PlantCell3：309-316，1991；和Zhang等，PlantPhysiol.110：1069-1079，1996描述的那些。其他类型植物启动子，包括但不限于，组成型启动子、非组成型启动子、器官特异性启动子、细胞类型特异性启动子、人工启动子均可用于本发明，只要在此启动子控制下的表达导致增加的种子数和/或种子大小，而不导致任何对植物发育的副作用即可。如本文所述，术语“植物启动子”是指能够在植物中驱动基因表达的启动子。
[0103]在胚发育，例如，早期特异性胚发育过程中从本发明的突变序列表达REV，或者在胚乳中、或穗(雌花序)中从本发明的突变序列表达REV的转基因植物可以例如通过将转基因载体(例如，质粒、病毒等)转移至植物中来获得，所述转基因载体编码与编码所述突变的REVOLUTA的基因可操作地连接的胚启动子、胚乳特异性启动子或穗特异性启动子。在一些实施方案中，所述胚特异性启动子是早期特异性胚启动子。通常，当载体是质粒时，所述载体还包含选择标记基因，例如编码对于卡那霉素的抗性的新霉素磷酸转移酶基因。如Hoeckeme等(Nature303：179-181，1983)中所描述的，最常见的植物转化方法通过下列方式来进行：将靶转基因克隆到植物转化载体中，随后将所述植物转化载体转化到包含辅助Ti-质粒的根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumifaciens)中。另外的方法例如描述在Maloney等，PlantCellReports8：238，1989中。如由An等(PlantPhysiol.81：301-305，
1986；Hooykaas，PlantMol.Biol.13：327-336，1989)所描述的，可以将包含转基因载体的土壤杆菌细胞与待转化的植物的叶切片一起温育。如上所述，培养的植物宿主细胞的转化通常通过根癌土壤杆菌来完成。通常使用磷酸钙法来转化不具有坚硬的细胞膜屏障的宿主细胞的培养物，如由Graham等(Virology52：546，1978)最初描述，并如Sambrook等(MolecularCloning：ALaboratoryManual(第2版，1989ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，NY)中所述进行修改。然而，也可以使用用于将DNA引入细胞内的其他方法，例如聚凝胺(Polybrene)(Kawai等，Mol.Cell.Biol.4：1172，1984)，原生质体融合(Schaffner，Proc.Netl.Acead.Sci.USA77：2163，1980)，电穿孔(Neumann等，EMBOJ.1：841，1982)，和直接显微注射到核内(Capecchi，Cell22：479，1980)。可以通过选择标记经由在培养基上培养细胞来选择出经转化的植物愈伤组织，所述培养基包含例如卡那霉素，以及合适量的植物激素例如萘乙酸和苄基腺嘌呤以用于愈伤组织和苗诱导。随后，可以使用本领域技术人员众所周知的技术来再生植物细胞，并将所得到的植物转移至土壤中。[0104]除了上述方法外，大量关于将克隆的DNA转移到广泛多样的植物物种内的方法是本领域众所周知的，所述植物物种包括裸子植物、被子植物、单子叶植物和双子叶
植物(参见例如Glick和Thompson，编辑，MethodsinPlantMolecularBiologyand
Biotechnology，CRCPress，BocaRaton，Florida，1993；Vasil，PlantMol.Biol.，25：
925-937，1994；和Komai等，CurrentOpinionsPlantBiol.1：161-165，1998(综合性的综述)；Loopstra等，PlantMol.Biol.15：1-9，1990；和Brasileiro等，PlantMol.Biol.17：
441-452，1990(树的转化)；Eimert等，PlantMol.Biol.19：485-490，1992(芸苔的转化)；Hiei等，PlantJ.6：271-282，1994；Hiei等，PlantMol.Biol.35：205-218，1997；Chan等，PlantMol.Biol.22：491-506，1993；美国专利号5,516,668和5,824,857(稻的转化)；以及美国专利号5,955,362(小麦的转化)；5,969,213(单子叶植物的转化)；5,780,798(玉米的转化)；5,959,179和5,914,451(大豆的转化)。代表性的实施例包括由电穿孔促进的原生质体对于DNA的摄取(Rhodes等，Science240：204-207，1988；Bates，Meth.Mol.Biol.111：359-366，1999；D′Halluin等，Meth.Mol.Biol.111：367-373，1999；美国专利号5,914,451)；用聚乙二醇处理原生质体(Lyznik等，PlantMol.Biol.13：151-161，
1989；Datta等，Meth.Mol.Biol.，111：335-334，1999)；和用装载有DNA的微粒轰击细胞(Klein等，PlantPhysiol.91：440-444，1989；Boynton等，Science240：1534-1538，1988；Register等，PlantMol.Biol.25：951-961，1994；Barcelo等，PlantJ.5：583-592，1994；Vasil等，Meth.Mol.Biol.111：349-358，1999；Christou，PlantMol.Biol.35：197-203，
1997；Finer等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.240：59-80，1999)。另外，植物转化策略和技术在Birch，Ann.Rev.PlantPhys.PlantMol.Biol.48：297，1997；Forester等，Exp.Agric.33：15-33，1997中进行了综述。较小的变化使得这些技术可应用于广泛范围的植物物种。
[0105]在单子叶植物转化的情况下，粒子轰击通常是所选择的方法。然而，单子叶植物例如玉米也可以通过使用在美国专利5,591,616中所述土壤杆菌转化法来进行转化。实现单子叶植物例如玉米的转化的另一种方法将来自胚发生悬浮培养物的细胞与纤维(5％w/v，SilarSC-9须晶)和质粒DNA(1μg/μl)的悬浮液相混合，并且随后置于涡旋混合器上的多样品头中，或水平置于牙科汞合金混合器的夹持器中。然后，可以通过以全速混合或以固定速度振荡1秒来进行转化。这个过程导致产生可以从其中选择出稳定转化体的细胞群体。从经稳定转化的愈伤组织中再生出植物，并且这些植物及其后代能够通过Southern杂交分析显示为转基因的。该方法的主要优点是其简单性和低成本。与粒子轰击不同，不需要昂贵的设备和供应。对于转化植物细胞特别是玉米而使用的须晶(whisker)例如在美国专利5,464,765中得到描述。
[0106]美国专利5,968,830描述了转化和再生大豆的方法。美国专利5,969,215描述了用于产生转化的甜菜(Betavulgaris)植物例如糖用甜菜的转化技术。
[0107]上述转化技术中的每一种均具有优点和缺点。在每种技术中，对来自质粒的DNA进行遗传改造，从而使得它不仅包含目的基因，还包含可选择和可筛选标记基因。可选择标记基因用于仅选择出具有该质粒的整合拷贝的那些细胞(构建是这样的，即使得目的基因以及可选择和可筛选基因作为一个单元进行转移)。可筛选基因对于仅成功培养携带目的基因的那些细胞提供了另一种检查。
[0108]具有抗生素抗性选择标记的常规的土壤杆菌转化可能是有问题的，因为对于此类植物引起将抗生素耐受性扩散至动物和人的过度风险存在着公众反对意见。此类抗生素标
记可以通过使用类似于在美国专利5,731,179中描述的那些的土壤杆菌技术转化植物而
从植物中消除。抗生素抗性问题还可以通过使用bar或pat编码序列而有效地避免，例如在美国专利号5,712,135中所描述的。这些优选的标记DNA编码第二种蛋白质或多肽，其抑制或中和谷氨酰胺合成酶抑制剂类除草剂膦丝菌素(草铵膦)和草铵膦铵盐(BastaIgnite)的作用。
[0109]通过任何前述技术将包含一种或多种这些基因的质粒引入植物原生质体或愈伤组织细胞中。如果标记基因是可选择基因，那么只有已合并入了所述DNA包(DNApackage)的那些细胞在使用合适的植物毒性剂进行选择的条件下存活。一旦合适的细胞得到鉴定并繁殖后，就再生出植物。来自转化的植物的后代必须进行测试以确保所述DNA包已成功整合到植物基因组中。
[0110]存在影响转化的成功的许多因素。外源基因构建体及其调节元件的设计和构建影响外源序列整合到植物细胞核的染色体DNA内和转基因被细胞表达的能力。用于以非致死方式将外源基因构建体引入植物细胞核内的合适方法是必需的。重要的是，如果回收了全植物，那么将构建体引入其中的细胞的类型必须是顺应于再生的类型，其中考虑了合适的再生方案。
[0111]原生生物也可以用作宿主细胞以用于本发明的初始克隆步骤。可以用于这些初始克隆和扩展步骤的方法、载体、质粒和宿主细胞系统是技术人员众所周知的，并且在本文中不进行描述。
[0112]在本发明的另一实施方案中，可以在要使用技术人员公知的方法转化的植物中插入胚特异性启动子、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子，从而可操作地连接至编码miRNA抗性植物生长和/或发育相关基因的基因或具有一个或多个早现终止密码子的植物生长和/或发育相关基因，例如REV。在一些实施方案中，胚启动子是早期特异性胚启动子。启动子插入将允许在转基因植物发育种子之前或期间，所述基因，例如，修饰的REV的胚特异性表达、胚乳特异性表达、或穗特异性表达。不希望被理论约束，包含修饰的REV编码mRNA的mRNA可能，例如，在植物细胞中具有更长的半衰期，导致产生比野生型植物实质性更大和/或更多种子的植物；或者，包含修饰的REV编码mRNA的mRNA可能结合植物细胞中的mRNA，允许所述植物细胞中的内源野生型REVmRNA具有的更长半衰期，并由此允许更多的REV蛋白，导致产生比野生型植物实质性更大和更多种子的转基因植物。另外的对修饰的REV活性的共抑制机制是本文所阐述的。
[0113]在本发明公开的方法中特别感兴趣的转基因植物包括但不限于单子叶植物和双子叶植物，特别是来自十字花科(Crucifereae)、禾本科、锦葵科或豆科-蝶形花亚科的。在这些科中特别感兴趣的植物包括但不限于，双低菜、玉米、亚麻荠、棉花、小麦、稻、大豆、大麦及其他产生种子的植物，以及具有农业利益的其他植物，包括但不限于苜蓿、甘蔗等，其在本发明的一个具体实施方案中包含，例如对于miRNA具有降低的结合亲和力的miRNA抗性REV转基因，或者在合适启动子，例如胚特异性启动子(例如，早期特异性胚启动子)、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子控制下的REVstop转基因。转基因可以来自与转基因植物相同的物种，或者转基因可以来自异源植物。特别感兴趣的是包含来自拟南芥或玉米的修饰的REV转基因的转基因植物。胚特异性启动子(例如，早期特异性胚启动子)、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子也可以来自与转基因植物相同的物种，或者来自异源植物。
例如，胚特异性启动子(例如，早期特异性胚启动子)、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动
子可以来自与REV转基因相同的植物物种，或甚至来自另一个植物物种。特别感兴趣的是来自拟南芥或Lesquerellafendleri的早期特异性胚启动子，但早期特异性启动子可以得自另一个植物物种。已发现适合于本发明公开的方法的早期特异性启动子和突变的REV转基因的特定组合包括但不限于(a)LesquerellafendleriLFAH12启动子/修饰的拟南芥REV；(b)拟南芥AAP1启动子/修饰的拟南芥REV；(c)拟南芥LEC2启动子/修饰的拟南芥REV；和(d)拟南芥2S2启动子/修饰的拟南芥REV。在一些其他实施方案中，可以使用胚乳特异性启动子(例如，豆球蛋白1A(LEG1A)基因启动子)，或者穗特异性启动子(例如，AGAMOUS基因启动子或CLAVATA1基因启动子)。本发明的一个具体实施方案中，这些突变的转基因构建体已用于转化双低菜，但可以用于转化其他植物物种。特别地，它们可以用于在大豆、玉米、棉花、亚麻荠、稻、小麦、大麦、苜蓿和其他具有农业利益的作物中产生具有增加的种子大小和/或种子数的转基因植物。
[0114] 本公开还提供选择增加植物产量的生长和/或发育相关基因的方法。在该方法中，序列搜索程序可以用来搜索感兴趣的基因中的miRNA结合位点，并且突变选择的感兴趣的基因以编码不结合miRNA，或者包含一个或多个提前终止密码子的mRNA，并且所述突变的感兴趣的基因在表达质粒或载体中与合适的启动子，例如，胚特异性启动子(例如，早期特异性胚启动子)、胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子功能性相连。使用本领域已知的方法将包含突变的感兴趣的基因的表达质粒或载体转化入植物细胞以形成转基因细胞。用包括上面公开的那些的已知方法培养包含突变的转基因的细胞并再生为转基因植物直到获得转基因植物。与野生型植物相比，对转基因植物观察到增加的产量，并选择那些用于获得具有增加的产量的转基因植物的生长和/或发育相关基因进行进一步开发。包含选择的生长和/或发育相关基因的转基因植物可以进一步被开发以提供比野生型植物产量高的具有农业重要性的植物。在一些实施方案中，本发明的转基因植物的植物产量，以每株植物或每英亩计算，与对照植物，例如，野生型植物或包含对照载体的植物相比，增加了约
1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约
75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约350％、约400％、或更多。
[0115] 本发明的具有增加的种子数和/或种子大小，可能导致增加的产量的转基因植物可以用于其他目的。例如，转基因植物可以进行本领域公知的育种技术以通过基因叠加创建新的植物，其中新植物继承本发明的转基因，具有一种或多种其他在农业上期望的性状。如本文所述，“农业上重要性状”包括任意对于人类使用有用或有利的植物或植物部分中的表型。农业上重要性状的实施例包括但不限于那些导致增加的生物量产生、特殊的生物燃料的产生、增加的粮食生产、提高的粮食品质等。其他农业上重要性状的实施例包括害虫抗性、活力、发育时间(收获时间)、增加的营养含量、新的生长模式、口味或颜色、盐、热、干旱和冷的耐受等等。农业上重要性状不包括可选择标记基因(例如，仅用于促进转化细胞的检测或选择的编码除草剂或抗生素抗性的基因)、导致植物激素(例如，仅用于选择的植物生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯)产生的激素生物合成基因、或报告基因(例如，萤光素酶、β-葡萄糖醛酸酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)等)。一个或多个其他农业上期
望的性状可以是由于自然基因、突变体和/或转基因。
[0116]育种方法
[0117]开放授粉群体(Open-PollinatedPopulation)。作物如黑麦、许多玉米和甜菜、草本草(herbagegrass)、豆类如苜蓿和三叶草、和热带树作物如可可、椰子、油棕和一些橡胶等的开放授粉群体的改善，主要依赖于针对有利等位基因的固定改变基因频率，同时保持高度(但远未最大)的杂合性。在这些群体中的均质性(uniformity)是不可能的，而且开放授粉品种中的真实-类型(trueness-to-type)是群体作为一个整体的统计学特征，而不是个别植物的特征。因此，开放授粉群体的异质性与近交系、克隆和杂种的同质性(或实质上如此)相对。
[0118] 群体改进方法自然地分为两组，那些基于纯粹的表型选择的，通常称为混合选择(massselection)，和那些基于使用后代测试的选择。种群间改善利用了开放育种种群的概念，允许基因从一个群体流动到另一个。一个群体中的植物(栽培种、品系、生态型、或任何种质源)要么自然地(例如，由风)，要么通过手工或通过蜜蜂(通常为蜜蜂(ApismelliferaL.)或苜蓿切叶蜂(MegachilerotundataF.))与其他群体的植物杂交。通过分离具有来自两个来源的期望性状的植物将选择用于改善一个(或有时两个)群体。[0119] 基本上有两种主要的改良开放授粉群体改善的方法。首先，存在通过选定的选择程序整体(enmasse)改变群体的情况。结果是一种通过在隔离中在其本身内随机交配而无限繁殖的改进的群体。其次，合成品种达到相同的最终结果作为群体改善，但其本身并不是可以照此繁殖的，它必须从亲系或克隆重建。这些用于改进开放授粉群体的植物育种程序是本领域技术人员所周知的，而且大量的文献和文章中提供了常规地用于改善交叉授粉植物的育种程序的全面的综述，包括：Allard，PrinciplesofPlantBreeding，JohnWiley&Sons，Inc.(1960)；Simmonds，PrinciplesofCropImprovement，LongmanGroupLimited(1979)；Hallauer和Miranda，QuantitativeGeneticsinMaizeBreeding，IowaStateUniversityPress(1981)；和Jensen，PlantBreedingMethodology，JohnWiley&Sons，Inc.(1988)。
[0120]混合选择。在混合选择中，选择、收获理想的单株植物，并在不进行后代检测的情况下形成种子(seedcomposited)以产生下一世代。由于选择仅基于母本，而在授粉上没有控制，混合选择相当于(amountto)带有选择的随机交配。如上所述，混合选择的目的是增加群体中优越基因型的比例。
[0121]合成品。通过在针对良好组合能力而选择的多种基因型之间以所有可能的杂交组合杂交产生了合成品种，后续通过开放授粉对该品种进行维持。如在一些甜菜和豆类(蚕豆(Vicia))或克隆中，如在草本草、三叶草和苜蓿中，亲本是否是(或多或少近交系)种子繁殖系原则上没有区别。以一般的组合能力选择亲本，有时通过测试杂交或顶交，更通常通过多系杂交。亲本种子系可以有意地自交(例如通过自交或同胞杂交)。然而，即使亲本不刻意近交，在品系保持期间品系内部的选择将确保一些近交的发生。当然，克隆亲本将保持不变和高度杂合。
[0122]合成品是否可以直接从亲本种子生产实验到农民处，还是必须先经过一轮或两轮的繁殖，取决于种子生产和对种子的需求规模。在实践中，草和三叶草一般繁殖一次或两次，并因此从原始的合成品大大地移开。
[0123]虽然有时使用混合选择，对于多系杂交通常优选后代检测，因为其操作的简便性
和明显的目标相关性，即利用合成品中的一般结合能力。
[0124]进入合成品的亲本系或克隆的数量变化很大。在实践中，亲本系的数目从10到几百，平均是100-200。从100个或更多的克隆形成的基础广泛的合成品预计在种子繁殖过程中比窄基合成品更稳定。
[0125]杂种。杂种是不同基因型的亲本之间的杂交产生的个体植物。现在商业化的杂种广泛地用于许多作物，包括玉米(maize)、高粱、甜菜、向日葵和花椰菜。杂种可以许多不同的方式形成，包含通过直接杂交两个亲本(单杂交杂种)，通过单杂交杂种与另一亲本的杂交(三方或三重杂交杂种)，或通过两个不同杂种的杂交(四方或双重杂交杂种)。
[0126]严格来说，远交(例如，开放授粉)群体中的大多数个体是杂种，但该术语通常保留用于这样的情况，即其中的亲本是其基因组足够独特到使他们被认为是不同的物种或亚种的个体。杂种可能是可繁殖的或不育的，取决于两个亲本的基因组中的定性和/或定量差异。杂种优势或杂种活力，通常与增加的杂合性相关，其导致与用于形成杂种的亲本系相比杂种的生长、存活和生育活力提高。通常通过将两个遗传上不同的、高度近交系杂交来实现最大优势。
[0127]杂种的生产是一个发达的产业，涉及分别产生亲本系双方和由杂交这些品系产生的杂种。关于杂种生产过程的详细讨论，请参阅，例如，Wright，CommercialHybridSeedProduction8：161-176，InHybridizationofCropPlants。
[0128] 混合分组分析(bulksegregationanalysis；BSA)。BSA(又名bulkedsegregationanalysis或bulksegregantanalysis)，是Michelmore等(Michelmore等，
1991，Identificationofmarkerslinkedtodisease-resistancegenesbybulkedsegregantanalysis：arapidmethodtodetectmarkersinspecificgenomicregionsbyusingsegregatingpopulations.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，USA，99：9828-9832)和Quarrie等(Quarrie等，Bulksegregantanalysiswithmolecularmarkersanditsuseforimprovingdroughtresistanceinmaize，
1999，JournalofExperimentalBotany，50(337)：1299-1306)描述的方法。
[0129]对于感兴趣的性状的BSA，选择具有特定不同表型的亲本系并杂交产生F2代、加倍单倍体或重组近交群体，其中用QTL分析。接着对群体进行表型分型以鉴定具有性状的高或低表达的个体植物或品系。准备两个DNA混合(DNAbulk)，一个来自具有一个表型(例如，抗病毒)的个体，而另一个来自具有相反表型(例如，易感病毒)的个体，并以分子标记分析等位基因频率。如果标记是显性的(例如，RAPD)，每个混合只需要少数个体(例如，每个10株)。当标记是共显性(例如，RFLP)时需要更多的个体。可以鉴定与表型连锁的标记并用于育种和QTL作图。
[0130] 应当理解，本文所述实施例和实施方案仅用于举例说明目的，并且根据其的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的，且应包含在本申请的精神和范围内。[0131] 组织培养
[0132]现代植物组织培养是在无菌条件下在过滤空气下进行。来自环境的活的植物材料在其表面上(且有时在内部)自然受到微生物的污染，因此需要在化学溶液(通常为醇或漂白剂)中表面灭菌起始材料(外植体)。接着通常将外植体放置在固体培养基表面，但有
时直接放入液体培养基，尤其是当需要细胞悬浮培养时。固体和液体培养基通常均由无机
盐加上少量有机营养物质、维生素和植物激素组成。固体培养基是由液体培养基加入胶凝剂(通常是纯化的琼脂)制备的。
[0133]培养基的组成，特别是植物激素和氮源(硝酸盐对比铵盐或氨基酸)对从最初的外植体长出的组织的形态具有深远的影响。例如，过量的植物生长素往往会导致根增殖，而细胞分裂素过量可能产生芽(shoot)。植物生长素和细胞分裂素两者的平衡，往往会产生细胞或愈伤组织的无组织生长，但生长物的形态会取决于植物种类以及培养基组成。随着培养物的生长，通常是切下小块并转移到新培养基(传代培养)以容许生长或改变培养物的形态。在判断培养哪块丢弃哪块时，组织培养者的技能和经验是重要的。由于苗从培养物中出现，可将它们切下并使用植物生长素生根以产生小植株，当成熟时，可以转移到盆装土壤中以供作为正常植物在温室中进一步生长。
[0134]为了培养从获得的组织被称为外植体。基于使用特定模式系统(尤其是烟草)的工作，经常声称的是全能的外植体可以从植物的任何部分长出。然而，这一观念在实践中已失效。在许多物种中，各种器官的外植体在其生长和再生的速率方面不同，而一些根本不生长。外植体材料的选择也决定了通过组织培养发育的小植株是单倍体或二倍体。用不适当的外植体微生物污染的风险也是增加的。因此，组织培养前进行外植体的适当选择非常重要。
[0135]不同器官和外植体在再生潜力上的特定差异有各种解释。重要的因素包括细胞周期中细胞阶段的差异、内源生长调节剂的可用性或运输能力、和细胞的代谢能力。最常用的组织外植体是植物的分生末端，像茎尖、腋芽尖端和根尖。这些组织具有高细胞分裂率并且集中或生产所需的生长调节物质，包括植物生长素和细胞分裂素。一些外植体，如根尖，是很难分离的并被土壤微生物群污染，这成为组织培养过程中的问题。某些土壤微生物群可以与根系统形成紧密关联，或者甚至在根内生长。结合到根上的土壤颗粒难以不损伤根就除去，然后损伤会允许微生物的攻击。这些相关的微生物群通常会在植物组织出现显著生长之前长满组织培养基。气生(土壤上)外植体也富含不希望的微生物群。然而，通过轻柔漂洗它们更容易从外植体上去除，而且残余的通常可以通过表面灭菌杀死。大多数表面微生物群没有与植物组织形成紧密关联。这类联合通常可以通过目视检查发现，如外植体表面上的花斑(mosaic)、脱色或局部坏死。
[0136]取得未受污染的外植体的替代方法是从表面灭菌的种子无菌生长出的幼苗获得外植体。种子坚硬的表面不太会渗透严苛的表面灭菌剂，如次氯酸盐，因此用于种子灭菌的可接受的条件比用于植物性组织的条件严格得多。
[0137] 组织培养的植物是克隆，如果用于生产第一外植体的初始母本植株对病原体或环境条件易感，那么整个作物可能会对同样的问题易感，相反任何积极的特征也将保持在品系中。植物组织培养在植物科学中广泛应用，其也具有各种商业用途。应用领域包含：[0138] 1、微型繁殖(micropropagation)广泛应用于林业和花卉。微型繁殖也可用于保留珍稀或濒危植物物种。
[0139]2、植物育种者可使用组织培养以筛选细胞而不是植物的有利特性，例如病原体抗性/耐受。
[0140]3、植物细胞在生物反应器内的液体培养基中的大规模生长作为次级产品，如用作
生物药物的重组蛋白的原料。
[0141] 4、通过原生质体融合和新型杂种的再生来杂交关系较远的物种。
[0142] 5、交叉授粉关系较远的物种，然后组织培养所产生的胚，所述胚若非如此通常会死忘(胚抢救)。
[0143] 6、从单倍体培养生产加倍的单倍体(双单倍体)植物，以在育种程序上更快速地获得纯合系，通常通过用秋水仙碱处理导致染色体数目加倍。
[0144] 7、作为用于转化的组织，接着是遗传构建体的短期测试或转基因植株的再生。[0145] 8、某些技术，如分生组织尖端培养可用于从遭受病毒的原种产生清洁的植物材料，例如土豆和许多软果物种。
[0146] 9、使用分生组织和苗培养物生产大量相同个体的微型繁殖。
[0147] 仅作为本发明公开的各个方面的举例说明提供了下述实施例，它们不应解释为以任何方式限制了本文使用的方法或材料。
[0148] 尽管不希望被特定的理论所约束，本发明的修饰的植物生长和/或发育核酸/基因在植物细胞中具有更长的半衰期，导致产生的植物比野生型植物产生实质上更大和/或更多的种子。这一机制与植物中REVmiRNA结合突变体转基因的表达相一致。miRNA抗性转基因不结合内源植物miRNA，所以所述转基因表达不受miRNA调节抑制。这导致更多的突变体转基因被转录和翻译，并因此导致更多的REV蛋白，以带来种子产量和/或大小的增加。或者，修饰的植物生长和/或发育基因编码在植物细胞中可以结合miRNA的mRNA，允许植物细胞中内源野生型植物生长和/或发育基因mRNA具有更长的半衰期，并因此允许植物中存在更多的植物生长和/或发育蛋白可用，使得其产生比野生型植物实质性更大和更多的种子。这一机制与包含一个或多个终止密码子的REV转基因的表达相一致。REVstop转基因依然具有完整的miRNA结合位点，所以所述转基因作为池以供结合内源植物miRNA。REVstop转基因的这种海绵效应允许内源野生型REV的更多转录和翻译，导致增加的种子产量和/或种子大小。但是，也不能排除REVstopmRNA被看作异常物质并引起内源野生型REV的共抑制，这可能导致增加的种子产量和/或种子大小。
实施例
[0149]下面的实施例描述了包含适当的启动子和在植物的生长和/或发育中有作用的修饰的基因的表达载体的构建。特别地，在一些实施方案中，将胚特异性启动子LesquerellafendleriLFAH12与命名为REVstop的在氨基酸位置11和18含有两个早现终止密码子的拟南芥REVOLUTA(REV)编码区(cds)，或者与包含在miRNA结合位点处的一个或多个突变的拟南芥REVOLUTA(REV)编码区(cds)的可操作地连接。这种构建体用于产生转基因双低菜植物或玉米植物。在一些其他的实施方案中，使用胚乳特异性启动子、或穗特异性启动子。
[0150] 实施例1
[0151] 转基因双低菜植物，其表达被设计为赋予含突变的miRNA结合位点的REVOLUTA编码区的胚特异性表达的转基因构建体。
[0152] 下面的实施例描述包含早期胚特异性启动子和在植物生长和/或发育中有作用的表达载体的构建。特别地，将胚特异性启动子LesquerellafendleriLFAH12与在微小
RNA(miRNA)结合位点包含两个核苷酸改变的拟南芥REVOLUTA(REV)编码区(cds)可操作地
连接。该构建体用于产生转基因双低菜植物。
[0153]在跨多地和多年的重复田间试验中，相对于无效同胞双低菜植物(nullsiblingcanolaplant)，转基因欧洲油菜(双低菜)植物中拟南芥REV基因的胚特异性过表达导致增加的种子产量(WO2007/079353，通过提及并入本文中)。为了确定REV转基因是在RNA水平还是蛋白水平发挥功能影响种子产量的增加，创建了在miRNA结合位点包含两个核苷酸改变的突变体REV转基因。预测在转基因的miRNA结合位点中的突变将防止转基因REVRNA的降解，因为突变已经破坏了内源双低菜miRNA对该位点的结合。如果种子产量的增加是由于更多的REV蛋白从转基因表达，REVmiRNA突变体转基因会导致甚至更多的REV蛋白产生并由此导致更高的种子产量。
[0154]选择一个赋予胚特异性表达的启动子用于表达构建体中，所述构建体设计为在早期胚发育过程中在双低菜胚(欧洲油菜)中提供REVmiRNA突变体编码序列的转基因表达。选择LFAH12启动子(来自Lesquerellafendleri的油酸12-羟化酶:脱氢酶基因)(Broun等，PlantJ.13：201-210，1998，US5,965,793，每篇通过提及而整体并入本文中)并如下所述与在miRNA结合位点具有突变的拟南芥REV的编码序列可操作地连接。
[0155]LFAH12启动子-AtREVcdsmiRNA突变体-rev3’UTR(TG42)的构建
[0156]对质粒pTG230中的AtREVcds(SEQIDNO：8)进行位点定向诱变以在微小RNA结合区创建两个突变。突变的REV(SEQIDNO：9)中的突变在拟南芥Revoluta编码序列中的核苷酸567处创建了T到A的突变并在核苷酸570处创建了G到A的突变；这些改变并没有影响氨基酸序列。通过测序验证了这两个突变的存在。产生的在pCR-Blunt(Invitrogen)载体中的AtREVmiRNA突变体被命名为质粒pTG509。用EcoRV和NotI从命名为pTG234的质粒切出AtREV3’UTR(SEQIDNO：15)并克隆到质粒pTG509中的相同位点处以获得命名为pTG518的质粒。作为SpeI-KpnI片段从质粒pTG518取得AtREVcdsmiRNA突变体-rev
3’UTR盒，并与来自质粒pTG143的LFAH12启动子(SEQIDNO：14)KpnI-SpeI片段一起，以三路连接而连接到已被KpnI切割的pCGN1547二元载体(McBride等，PlantMol.Biol.14：
269-276，1990)，以创建带有植物NPTII标记盒的LFAH12启动子-AtREVcdsmiRNA突变体-rev3’UTR(从头到尾方向)，得到命名为pTG520的质粒，其也被命名为TG42。
[0157]双低菜(欧洲油菜)转化
[0158] 用REVmiRNA突变体转基因表达构建体转化双单倍体双低菜品种DH12075，其中使用基于Maloney等(PlantCellReports8：238，1989)的土壤杆菌介导的转化方法。[0159] 使经灭菌的种子在15X60mm培养皿中在含有1％蔗糖的1/2MS(Murashige&Skoog)培养基上萌发5天，每个平板约40至约60粒种子。对于转化构建体，使总共约1500粒种子萌发。种子并不完全浸入萌发培养基中。使萌发的幼苗于25℃、16小时光照/8小时黑暗循环下生长。
[0160]正好在顶端分生组织之上切割子叶，而不获得任何分生组织。这通过紧邻顶端分生组织区之上用镊子轻轻夹住2个叶柄来进行。小心不要用镊子压碎叶柄。使用镊子的尖端作为引导，使用具有锐利的NO.12刀片的解剖刀切割叶柄。将子叶放到15X100mm的共培养培养基平板上。正确切割的子叶容易分开。如果它们不是这样，那么非常可能已获得了分生组织，并且不使用这样的子叶。每个平板容纳约20片子叶。在每次制备了少量平板后
用土壤杆菌接种子叶外植体以避免萎蔫，萎蔫会对方案的随后阶段产生负面影响。
[0161]通过电穿孔将REVmiRNA突变体构建体引入根癌土壤杆菌中。将具有REVmiRNA突变体构建体的土壤杆菌在含有合适抗生素的AB培养基中于28℃摇动培养2天。为了接种子叶外植体，将少量体积的土壤杆菌培养物加入至10×35mm培养皿中。将每个外植体的叶柄浸泡在土壤杆菌培养物中，并且将切割末端放入培养皿中的共培养培养基内。将平板密封，并于25℃、16小时光照/8小时黑暗下培养3天。
[0162] 3天后，将外植体以每组10个转移到包含苗诱导培养基的新鲜的25×100mm培养皿。这种培养基包含选择剂(20mg/l卡那霉素)和激素(4.5mg/l油菜素类固醇(BA))。只转移看上去健康的外植体。使外植体在苗诱导培养基上保持14-21天。在这时，观察到绿色的愈伤组织并且有可能观察到某些苗发育以及某些未转化的苗。通过其白和紫的颜色容易识别出未转化的苗。卡那霉素敏感性苗通过将其切掉来去除，并且将所有看上去健康的愈伤组织转移至新鲜的苗诱导培养基平板中。使外植体在这些平板上再保持14-21天。[0163] 2-3周后，将颜色为深绿色的苗转移至包含苗伸长培养基的平板。这种培养基包含选择剂(20mg/l卡那霉素)，但不包含任何激素。将5个苗转移至每个平板。将平板密封并放回组织培养室。将看起来有活力的转化的苗转移至包含间苯三酚(150mg/l)的苗伸长培养基。将长得健康和绿色的苗放回苗伸长培养基平板。在某些情况下需要将有活力的苗反复转移至相同培养基的新鲜平板，以获得外表正常的苗。
[0164] 将具有正常形态的苗转移到具有生根培养基的4盎司罐中，所述生根培养基含有
0.5mg/l吲哚丁酸。当将苗转移至罐时，将任何多余的愈伤组织切掉。通过大约每6周将其转移至包含0.2mg/l吲哚丁酸的新鲜罐中，可以将苗无限期地维持在罐中。
[0165] 一旦形成了良好的根系，就将T0代苗从罐中取出，将琼脂从根除去，并且将小植株转移至盆装土壤中。每个独立的T0小植株代表了转基因插入至双低菜基因组中的独立发生，并被称为事件。将透明杯置于小植株上数日，以允许植物适应新环境。一旦植物变硬，就将杯移去。然后，使T0转基因事件生长至成熟，并且收集T1种子。
[0166] T0事件的表征
[0167] 通过Southern分析来测定每个事件中转基因插入位点基因座的数目。通过实时PCR来测量在T0事件中的REVmiRNA突变体转基因表达。在授粉后19天(19DAP)，对于胚发育中的单个时间点，获得了REV表达数据。从这些数据中得出结论，在这个发育时间点，LFAH12启动子驱动REVmiRNA突变体RNA产生。
[0168] 对于REVmiRNA突变体构建体成功地产生了T0植物。
[0169] 实施例2
[0170] 本实施例中，在田间试验中测试包含在胚特异性LFAH12启动子控制下的拟南芥
REVmiRNA突变体转基因的转基因双低菜植物。
[0171] 转基因REVmiRNA突变体事件进展至田间试验
[0172]基于转基因表达和转基因插入基因座数目的组合来选择T0事件以用于进展至田间试验。将具有经验证的转基因表达和单个转基因插入基因座的事件指定为待推进至田间测试的最高优先级。在某些情况下，如果多个基因的存在由于基因剂量而产生高的总体转基因表达水平，那么选择具有多个插入基因座的事件。
[0173] 使来自所选事件的T1种子在田间地块中作为分离性T1群体(segregatingT1
populations)生长。将每个事件种植为2行、24个植物的地块。对于具有单个转基因插入
基因座的事件，在所述24个T1植物中的转基因分离将产生大约6个缺乏所述转基因的无效植物、12个杂合植物和6个纯合植物的分布。在开花前将每个T1植物单独地装入袋中以防止异型杂交。分开收获来自所述24个T1植物中每一个的T2种子。
[0174]将T2种子原种用于鉴定所述24个亲本T1植物中的哪些是无效的、杂合的或纯合的。使来自每个T1植物的大约30粒T2种子在培养皿中的滤纸上进行萌发，所述培养皿具有包含抗生素G418(一种卡那霉素的类似物)的溶液。因为使用nptII抗性基因作为选择标记来共转化植物，所以只有携带所述转基因的那些种子会萌发并继续生长。如果平板上的所有种子均对于G418敏感，那么该T1亲本被鉴定为无效品系。如果平板上的所有种子对于G418具有抗性，那么该T1亲本被鉴定为纯合品系。如果平板上大约四分之一的种子是敏感的而其余具有抗性，那么该T1亲本被鉴定为杂合品系。将从来自相同转化事件的纯合T1亲本获得的T2种子混合在一起，以产生用于田间试验测试的纯合种子原种。将从来自相同转化事件的无效T1亲本获得的T2种子混合在一起，以产生用于田间试验测试的无效同胞种子原种。
[0175]田间试验设计
[0176]通过在大规模重复试验中，在田间使每种转基因品系直接与其无效同胞进行比较，在转基因双低菜品系中测试了LFAH12胚特异性启动子驱动的REVmiRNA突变体转基因对种子产量增加和种子大小的影响。因为无效同胞产生自T1代中转基因的分离，所以无效和纯合同胞在遗传上几乎是相同的。唯一的显著差异是REVmiRNA突变体转基因的存在或不存在。这种相近的遗传身份使得无效同胞成为用于评估REVmiRNA突变体转基因的效果的最佳对照。因为试验的主要目的是比较来自事件的转基因品系与其无效分离子，所以选择对开地块(splitplot)设计。这种设计提供对转基因和非转基因分项之间的相互作用以及事件间的转基因副地块之间的差异(副地块(subplot)和主地块(mainplot)的相互作用)的高水平评估，以及对总体事件或主地块之间差异的较低水平评估。
[0177]田间试验在跨越牧场环境的多个地点进行，以在双低菜所通常生长的环境条件范围下评估产量表型。在所有地点处，将每个转基因事件与在邻近地块中的其无效同胞进行物理配对。纯合和无效同胞的每个地块对(plotpair)在每个试验地点处重复4次。将在每个试验中的4个重复地块对的地点在每个试验地点处随机分布。地块为1.6m×6m，并且以约142粒种子/平方米的密度种植。使用对于双低菜的商业生产而言典型的标准农学实践来使植物生长至成熟。
[0178]实施例3
[0179]在本实施例中，测定在数个牧场环境中的多个田间试验中，从胚特异性启动子表达REVmiRNA突变体转基因的转基因双低菜的种子产量。
[0180] 在每个产量田间试验地点的所有地块用联合收割机(combine)单独地进行收割。作为来自每个地块的就水份含量进行了调整的种子总重量，收集种子总产量数据。对于每次试验中的每个转基因事件，将来自每个纯合品系的4个重复地块的总产量的平均值与来自相关的无效同胞品系的4个重复地块的总产量的平均值比较。将这种比较用于评估REVmiRNA突变体转基因对于种子总产量的影响。将来自多个试验地点中每一个地点的结果相组合，以产生REVmiRNA突变体转基因对种子总产量的影响的整体试验分析(across
trialanalysis)。在每个试验地点处的统计学方差分析允许对纯合转基因品系与其无效
同胞之间的种子总产量中的差异指定显著性阈值(P＝0.05)。
[0181]测试了6种完整的转基因REVmiRNA突变体双低菜事件。全部6种事件代表双低菜基因组中独立的随机整合。与其他5种事件(测试T0组织)相比，通过实时PCR，对于一种命名为TG42-07的转基因事件的拟南芥REVmiRNA突变体转基因的相对RNA水平是最高的。这一事件在所有地点的总产量上显示统计学显著的增加(表5)。这一结果表明，使用胚特异性启动子过表达REVmiRNA突变体导致了增加的种子产量。
[0182]表5.相对于其无效同胞而言纯合LFAH12启动子-AtREVmiRNA突变体植物中种子总产量的变化。所有值均为统计学上显著的(P＝0.05)。
[0183]

[0184]实施例4
[0185]在本实施例中，测定在数种环境的多个田间试验中，从3种组织特异性启动子表达ZmREVmiRNA突变体转基因的转基因玉米的种子产量。
[0186] ZmOLE启动子-ZmRLD1cdsmiRNA突变体-ZmREV3′UTR-PINII3’UTR(TGZM67)，ZmLEG1A启动子-ZmRLD1cdsmiRNA突变体-ZmREV3’UTR-PINII3’UTR(TGZM66)和ZmZAG1启动子-ZmRLD1cdsmiRNA突变体-ZmREV3’UTR-PINII3’UTR(TGZM65)的构建[0187] 构建了由胚特异性Zm油质蛋白(ZmOLE)启动子(SEQIDNO：34)、胚乳特异性Zm豆球蛋白1A(ZmLEG1A)启动子(SEQIDNO：35)和穗特异性ZmZAG1启动子(SEQIDNO：
36)驱动的ZmRLD1编码序列(ZmRLD1cds，SEQIDNO：10，对应GenBankAY501430，其包含ZmRLD1的5’UTR、编码区和3’UTR，SEQIDNO：13)构建体。位点定向诱变pCRBlent中的ZmRLD1cds-ZmRLD13’UTR以在微小RNA结合区创建2个突变。ZmRLD13’UTR’s包含SEQIDNO.37。突变玉米REV(SEQIDNO：11)中的突变在玉米卷叶1(RLD1)编码序列中的核苷酸579处创建T到A的改变并在核苷酸582处创建G到A改变，这些改变不影响氨基酸序列。通过测序证实了这些突变的存在。产生的在载体pCR-Blunt(Invitrogen)中的ZmRLD
1miRNA突变体-ZmRLD3’UTR被命名为pTG1091。从pTG1091切出ZmRLD1miRNA突变体cds-ZmRLD13’UTR并克隆入PHP34354质粒以得到ZmZAG1启动子-ZmRLD1miRNA突变体cds-ZmRLD13’UTR-PINII3’UTR(pTG1358)，或者克隆入PHP34025质粒以得到ZmLEG1A启动子-ZmRLD1miRNA突变体cds-ZmRLD13’UTR-PINII3’UTR(pTG1359)。为创建ZmOLE启动子-ZmRLD1miRNA突变体cds-ZmRLD13’UTR-PINII3’UTR(pTG1366)，从pTG1359切出ZmRLD1miRNA突变体cds-ZmRLD13’UTR片段并克隆入PHP34006。最后，将来自pTG1358、pTG1359、和pTG1366的所有3个启动子-ZmRLD1miRNA突变体cds-ZmRLD13’UTR-PINII
3’UTR盒移入含有植物可选择标记的PHP22964以得到TGZM65(pTG1379，ZmZAG1启动子-ZmRLD1cdsmiRNA突变体-ZmREV3’UTR-PINII3’UTR)、TGZM66(pTG1380，ZmLEG1A启动子-ZmRLD1cdsmiRNA突变体-ZmREV3’UTR-PINII3’UTR)和TGZM67(pTG1381，ZmOLE
启动子-ZmRLD1cdsmiRNA突变体-ZmREV3′UTR-PINII3’UTR)。
[0188]2010玉米田间试验
[0189]对于3种构建体的每一种，生成了多表达、单拷贝事件。杂合事件的表现将与作为随机化完整区块(randomizedcompleteblock)的实验设计的合适检查项相比较。在北美在多地点、多次重复试验中测试事件的产量。收集的数据包括在收获时的直立数(standcount)、开花日期(选定的地点)、不孕数(选定的地点)、谷粒产量、和谷粒水分。使用混合模型分析来分析所有数据。
[0190]实施例5
[0191]在本实施例中，测定在数种牧场环境的多个田间试验中，从胚特异性启动子表达
REVmiRNA突变体转基因的转基因双低菜的种子大小。
[0192]在每个田间试验地点的所有地块用联合收割机单独地进行收割。LFAH12/REVmiRNA事件，TG42-07，在各试验中按照由千种子重量测量，显示出相对于无效分离同胞在种子大小上的统计学显著增加。结果总结于表6。
[0193]表6.相对于其无效同胞而言纯合LFAH12启动子-AtREVmiRNA突变体植物中种子大小的变化。所有值均为统计学上显著的(P＝0.05)。
[0194]

[0195]实施例6
[0196]转基因双低菜植物，其表达设计为赋予REVOLUTA翻译突变体编码区的胚特异性表达的转基因构建体。
[0197]跨多地点和多年的重复田间试验中，相对于无效同胞双低菜植物，拟南芥REV
基因在转基因欧洲油菜(双低菜)植物中的胚特异性过表达导致增加的种子产量(WO
2007/079353，通过提及并入本文中)。创建了在编码区早期含有两个早现终止密码子的突变REV转基因(REVstop，包含SEQIDNO：42)以确定这种突变体转基因的表达是否能够导致任何其他对种子大小和/或数目的影响。预测早现终止密码子的存在会防止包含所述两个终止密码子的REVmRNA翻译为全长REV蛋白。
[0198]选择一个赋予胚特异性表达的启动子用于一个被设计为在早期胚发育阶段在双低菜胚(油菜)中转基因表达REVstop翻译突变体cds的构建体中。在特定实施例中，使用LFAH12启动子(来自Lesquerellafendleri的油酸12-羟化酶:脱氢酶基因)(Broun等，PlantJ.13：201-210，1998)，SEQIDNO：14，作为胚特异性启动子。
[0199] 选择赋予胚特异性表达的一种启动子用于表达构建体，所述表达构建体设计为提供在早期胚发育期间REVstop翻译突变体cds在双低菜胚(欧洲油菜)中的转基因表达。在特定的实施方案中，使用LFAH12(来自Lesquerellafendleri的油酸12-羟化酶:去饱和酶基因)(Broun等，PlantJ.13：：201-210，1998)(SEQIDNo：14)作为胚特异性启动子。
[0200]LFAH12启动子-AtREVstop转基因-rev3’UTR(TG45)的构建
[0201] 对质粒pTG230中的REV编码序列(AtREVcds，SEQIDNO：8)进行位点定向诱
变以在编码区早期创建两个符合读码框(in-frame)的早现终止密码子。使用诱变在拟南芥REVOLUTA编码序列的核苷酸31处创建A到T的突变并在核苷酸52处创建A到T的突变，导致第11位的精氨酸和第18位的精氨酸变为终止密码子。通过测序验证了这些终止密码子的存在。产生的在质粒pCR-Blunt(Invitrogen)中具有早现终止密码子的AtREVcds(REVstop转基因)被命名为质粒pTG480。用限制酶EcoRV和NotI从质粒pTG234切出AtREV3’UTR(SEQIDNO：15)并克隆到质粒pTG480中的相同位点处得到质粒pTH496。将所述AtREVstop-rev3′UTR盒作为SpeI-KpnI片段从质粒pTG496取得，连同LFAH12启动子(来自质粒pTG143的KpnI-SpeI片段)，以三路连接而连接到已经用KpnI切割的pCGN1547二元载体(McBride等，PlantMol.Biol.14：269-276，1990)，创建LFAH12启动子-AtREVstop-rev3′UTR，从头到尾方向具有植物NPTII标记盒，得到质粒pTG505，也命名为TG45。
[0202] 双低菜(欧洲油菜)转化
[0203] 用REVstop转基因表达构建体转化双单倍体双低菜品种DH12075，其中使用基于
Maloney等(PlantCellReports8：238，1989)的土壤杆菌介导的转化方法。
[0204] 使经灭菌的种子在15×60mm培养皿中在含有1％蔗糖的
1/2MS(Murashige&Skoog)培养基上萌发5天，每个平板大约40-大约60粒种子。对于转化构建体，使总共约1500粒种子萌发。种子并不完全浸入萌发培养基中。使萌发的幼苗于
25℃进行生长，采用16小时光照/8小时黑暗循环。
[0205]正好在顶端分生组织之上切割子叶，而不获得任何分生组织。这通过紧邻顶端分生组织区之上用镊子轻轻夹住2个叶柄来进行。小心不要用镊子压碎叶柄。使用镊子的尖端作为引导，使用锐利的解剖刀刀片切割叶柄。将子叶放到15X100mm的共培养培养基平板上。正确切割的子叶容易分开。如果它们不是这样，那么非常可能已获得了分生组织，并且不使用这样的子叶。每个平板容纳约20片子叶。在每次制备了少量平板后用土壤杆菌接种子叶外植体以避免萎蔫，萎蔫会对方案的随后阶段产生负面影响。
[0206]通过电穿孔将REVstop构建体引入根癌土壤杆菌中。将具有REVstop构建体的土壤杆菌在含有合适抗生素的AB培养基中于28℃摇动培养2天。为了接种子叶外植体，将少量体积的土壤杆菌培养物加入至10×35mm培养皿中。将每个外植体的叶柄浸泡在土壤杆菌培养物中，并且将切割末端放入培养皿中的共培养培养基内。将平板密封，并于25℃、16小时光照/8小时黑暗下培养3天。
[0207] 3天后，将外植体以每组10个转移到包含苗诱导培养基的新鲜的25×100mm培养皿。这种培养基包含选择剂(20mg/l卡那霉素)和激素(4.5mg/l油菜素类固醇(BA))。只转移看上去健康的外植体。使外植体在苗诱导培养基上保持14-21天。在这时，观察到绿色的愈伤组织并且有可能观察到某些苗发育以及某些未转化的苗。通过其白和紫的颜色容易识别出未转化的苗。卡那霉素敏感性苗通过将其切掉来去除，并且将所有看上去健康的愈伤组织转移至新鲜的苗诱导培养基平板中。使外植体在这些平板上再保持14-21天。[0208] 2-3周后，将颜色为深绿色的苗转移至包含苗伸长培养基的平板。这种培养基包含选择剂(20mg/l卡那霉素)，但不包含任何激素。将5个苗转移至每个平板。将平板密封并继续组织培养。将看起来有活力的转化的苗转移至包含间苯三酚(150mg/l)的苗伸长培养
基。将长得健康和绿色的苗放回苗伸长培养基平板。在某些情况下需要将有活力的苗反复
转移至相同培养基的新鲜平板，以获得外表正常的苗。
[0209]将具有正常形态的苗转移到具有生根培养基的4盎司罐中，所述生根培养基含有
0.5mg/l吲哚丁酸。当将苗转移至罐时，将任何多余的愈伤组织切掉。通过大约每6周将其转移至包含0.2mg/l吲哚丁酸的新鲜罐中，可以将苗无限期地维持在罐中。
[0210] 一旦形成了良好的根系，就将T0代苗从罐中取出，将琼脂从根除去，并且将小植株转移至盆装土壤中。每个独立的T0小植株代表了转基因插入至双低菜基因组中的独立发生，并被称为事件。将透明杯置于小植株上数日，以允许植物适应新环境。一旦植物变硬，就将杯移去。然后，使T0转基因事件在温室中生长至成熟，并且收集T1种子。
[0211]T0事件的表征
[0212]通过Southern分析来测定每个事件中转基因插入位点基因座的数目。通过实时PCR来测量在T0事件中的REVstop表达。在授粉后19天(19DAP)，对于胚发育中的单个时间点，获得了REV表达数据。从这些数据中得出结论，在这个发育时间点，LFAH12启动子驱动REVstopmRNA产生。
[0213]对于REVstop构建体成功地产生了T0植物。
[0214]实施例7
[0215]在重复田间试验中评估在胚发育期间REV翻译突变体转基因表达对于双低菜产量的影响。
[0216]本实施例中，在田间试验中测试包含在胚特异性LFAH12启动子控制下的拟南芥
REVstop转基因的转基因双低菜植物。
[0217]转基因REV翻译突变体事件进展至田间试验
[0218]基于REVstop转基因表达和REVstop转基因插入基因座数目的组合来选择T0事件以用于进展至田间试验。将具有经验证的REVstop转基因表达和单个转基因插入基因座的事件指定为待推进至田间测试的最高优先级。在某些情况下，如果多个基因的存在由于基因剂量而产生高的总体转基因表达水平，那么选择具有多个插入基因座的事件。
[0219]使来自所选事件的T1种子在田间地块中作为分离性T1群体生长。将每个事件种植为2行、24个植物的地块。对于具有单个转基因插入基因座的事件，在所述24个T1植物中的转基因分离将产生大约6个缺乏所述转基因的无效植物、12个杂合植物和6个纯合植物的分布。在开花前将每个T1植物单独地装入袋中以防止异型杂交。分开收获来自所述
24个T1植物中每一个的T2种子。
[0220]将T2种子原种用于鉴定所述24个亲本T1植物中的哪些是无效的、杂合的或纯合的。使来自每个T1植物的大约30粒T2种子在培养皿中的滤纸上进行萌发，所述培养皿具有包含抗生素G418(一种卡那霉素的类似物)的溶液。因为使用nptII抗性基因作为选择标记来共转化植物，所以只有携带所述转基因的那些种子会萌发并继续生长。如果平板上的所有种子均对于G418敏感，那么该T1亲本被鉴定为无效品系。如果平板上的所有种子对于G418具有抗性，那么该T1亲本被鉴定为纯合品系。如果平板上大约四分之一的种子是敏感的而其余具有抗性，那么该T1亲本被鉴定为杂合品系。将从来自相同转化事件的纯合T1亲本获得的T2种子混合在一起，以产生用于田间试验测试的纯合种子原种。将从来自相同转化事件的无效T1亲本获得的T2种子混合在一起，以产生用于田间试验测试的无效同胞
种子原种。
[0221] 田间试验设计
[0222]通过在大规模重复试验中，在田间使每种转基因品系直接与其无效同胞进行比较，在转基因双低菜品系中测试了LFAH12胚特异性启动子驱动的REVstop转基因对种子产量增加和种子大小的影响。因为无效同胞产生自T1代中转基因的分离，所以无效和纯合同胞在遗传上几乎是相同的。唯一的显著差异是REVstop转基因的存在或不存在。这种相近的遗传身份使得无效同胞成为用于评估REVstop转基因的效果的最佳对照。因为试验的主要目的是比较来自事件的转基因品系与其无效分离子，所以选择对开地块设计。这种设计提供对转基因和非转基因分项之间的相互作用以及事件间的转基因副地块之间的差异(副地块和主地块的相互作用)的高水平评估，以及对总体事件或主地块之间差异的较低水平评估。
[0223]田间试验在跨越牧场环境的多个地点进行，以在双低菜所通常生长的环境条件范围下评估产量表型。在所有地点处，将每个转基因事件与在邻近地块中的其无效同胞进行物理配对。纯合和无效同胞的每个地块对在每个试验地点处重复4次。将在每个试验中的
4个重复地块对的地点在每个试验地点处随机分布。地块为1.6m×6m，并且以约142粒种子/平方米的密度种植。使用对于双低菜的商业生产而言典型的标准农学实践来使植物生长至成熟。
[0224]实施例8
[0225]从胚特异性启动子表达REV翻译突变体转基因以增加转基因双低菜中的种子产量。
[0226] 在每个产量田间试验地点的所有地块用联合收割机单独地进行收割。作为来自每个地块的就水份含量进行了调整的种子总重量，收集种子总产量数据。对于每次试验中的每个转基因事件，将来自每个纯合品系的4个重复地块的总产量的平均值与来自相关的无效同胞品系的4个重复地块的总产量的平均值比较。将这种比较用于评估REVstop转基因对于种子总产量的影响。将来自多个试验地点中每一个地点的结果相组合，以产生REVstop转基因对种子总产量的影响的整体试验分析。在每个试验地点处的统计学方差分析允许对纯合转基因品系与其无效同胞之间的种子总产量中的差异指定显著性阈值(P＝0.05)。[0227] 将在多个地点显示出种子总产量在统计学上显著增加的转基因REVstop双低菜品系总结于表7。测试了8个总体事件。一种转基因事件，TG45-23，显示在所有地点在总产量上的统计学显著的增加。另一种转基因事件，TG45-24，表明在三个地点中的两个上在总产量上的统计学显著的增加和在所有地点的整体产量正增加。这些结果表明，使用胚特异性启动子过表达REVstop转基因导致增加的种子产量。
[0228]表7.相对于其无效同胞而言纯合LFAH12启动子-AtREVstop植物中种子总产量的变化。所有值均为统计学上显著的(P＝0.05)，其中标记的除外。
[0229]

[0230] *统计学不显著
[0231] 实施例9
[0232] 转基因大豆植物，其表达设计为赋予REVOLUTA翻译突变体编码区的胚特异性表达的转基因构建体。
[0233] 由于对表达所述REVstop转基因的转基因双低菜系观察到种子产量的增加，为大豆构建了构建体以测定是否能够对另一种双子叶作物再现该种子产量的增加。
[0234]选择一个赋予胚特异性表达的启动子用于一个被设计为在早期胚发育阶段在大豆胚(Glycinemax)中转基因表达AtREVstop翻译突变体cds的构建体中。在特定实施例中，使用LEC2启动子(来自拟南芥的叶状子叶2基因)(Kroj等，Development130：
6065-6073，2003)，SEQIDNO：16，作为胚特异性启动子。
[0235] LEC2启动子-AtREVstop转基因-rev3’UTR(TGGM24)的构建
[0236] 用引物KpnLec2pr586F(5’GGTACCTGTCCATCAACCCATGCCTC3’；SEQIDNO：43)和Lec2-94R(5’CTGTTGTGAAGTGCGAGCGATTGT3’；SEQIDNO：44)从拟南芥哥伦比亚生态型(ArabidopsisecotypeColumbia)基因组DNA中扩增出拟南芥LEC2启动子并用RglII消化。随后将产生的LEC2启动子PCR片段克隆到已经用EcoRV和BamHI消化的pBluescript以产生pTG742。随后从pTG742取出LEC2启动子并插入pCR-blunt中以产生pTG1006。作为Asp718片段从质粒pTG496取出At-REVstop-rev3’UTR盒(参见实施例1)并克隆到已用Asp718消化的pTG1006。产生的质粒pTG1029是在pCR-Blunt中的LEC2启动子-At-REVstop-rev3’UTR，其命名为TGGM24。
[0237] 大豆转化和田间试验
[0238] 按照WO2007079353所描述的方法进行大豆转化和事件选择，该文献以整体引用的方式并入本文。
[0239] 在重复田间试验的第一年在3-4个地点测试了两种LEC2-AtREVstop事件(TGGM24-X4和TGGM24-X31)。将每种就转基因而言为纯合的单独T3品系与混合的无效对照一起放入对开地块，并且所述对开地块在每一地点均重复4次。以2个不同的纯合T3系：TGGM24-X4-7H和TGGM24-X4-15H代表事件之一。混合充当对照用于TGGM24-X4-7H和TGGM24-X4-15H的无效系是TGGM24-X4-8、9和14。混合充当对照用于TGGM24-X31-10H的无效系是TGGM24-X31-3、5、13和14。在Listowel2，Ontario，Canada；St.Marc，Quebec，Canada；和Ward，NorthDakota，USA测试TGGM24-X4-7H。在Listowel1和Walton，Ontario，Canada；St.Marc，Quebec，Canada；和Ward，NorthDakota，USA测试TGGM24-X4-15H。在Listowel1和Walton，Ontario，Canada；St.Marc，Quebec，Canada；和Ward，NorthDakota，
USA测试TGGM24-X31-10H。
[0240] 将转基因纯合REVstop大豆品系与其各自的混合无效对照相比在种子总产量上的表现概括在表8中。一种纯合T3品系，TGGM24-X4-7H，显示在所有地点的总产量统计学显著的增加。其他2种纯合T3REVstop品系没有在所有试验地点显示种子总产量的增加。这些结果表明，使用胚特异性启动子过表达REVstop转基因能够在大豆中导致增加的种子产量。
[0241] 表8.纯合LEC2启动子-AtREVstop大豆品系中的种子总产量相对于其混合的无效同胞品系的变化。所有值均为统计学上显著的(P＞0.10)，其中标记的除外。
[0242]

[0243] NT＝在此地点未检测到
[0244] *统计学不显著
[0245] 实施例10
[0246] 表达LEC2启动子-At-REVstop转基因大豆的两年田间试验
[0247] 在重复田间试验的第二年在2-4个地点测试三种LEC2-AtREVstop事件(TGGM24-X3、TGGM24-X4和TGGM24-X25)。将每个对于转基因而言为纯合的单独T3品系与混合无效对照一起放入对开地块，并且所述对开地块在每一地点重复4次。混合充当对照用于TGGM24-X3-6H和TGGM24-X3-11H的无效系是TGGM24-X3-12、13和14。混合充当对照用于TGGM24-X4-7H的无效系是TGGM24-X4-8、9和14。混合充当对照用于TGGM24-X25-12H、TGGM24-X25-13H和TGGM24-X25-14H的无效系是TGGM24-X25-1、3和8。在Centralia，Listowel，和Tavistock，Ontario，Canada；和St.Marc2，Quebec，Canada测试TGGM24-X3-6H。在Listowel，Ontario，Canada和St.Marc，Quebec，Canada测试TGGM24-X3-11H。在Centralia，Listowel，和Tavistock，Ontario，Canada；和St.Marc和St.Marc2，Quebec，Canada测试TGGM24-X4-7H。在Centralia，Ontario，Canada和St.Marc，Quebec，Canada测试TGGM24-X25-12H。在Listowel和Tavistock，Ontario，Canada；和St.Marc和St.Marc2，Quebec，Canada测试TGGM24-X25-13H。在Centralia和Tavistock，Ontario，Canada和St.Marc2，Quebec，Canada测试TGGM24-X25-14H。
[0248] 将转基因纯合REVstop大豆品系在种子总产量和千种子重量上的表现与它们各自的混合无效对照进行比较。
[0249] 实施例11
[0250]在本实施例中，测定跨越多个牧场环境的不同田间试验中从胚特异性启动子表达
REVstop转基因的转基因双低菜的种子大小。
[0251]在每个产量田间试验地点处的所有地块用联合收割机单独进行收割。如通过千种子重量测量，LFAH12/REVmiRNA事件TG45-20和TG45-23在各试验中相对于无效分离子同胞显示出种子大小的统计学显著增加。结果概括在表9中。
[0252]表9.纯合LFAH12启动子-AtREVstop突变体植物相对于其无效同胞而言种子大小的变化。所有值均为统计学上显著的(P＝0.05)
[0253][0254]除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述那些相似的任何方法和材料都可以在本发明的实践或测试中使用，但只描述了优选的方法和材料。引用的所有的出版物、专利和专利出版物为了所有目的将其以整体引用的方式并入本文中。
[0255]提供本文讨论的出版物仅是它们的披露早于本申请的申请日。本文中的任何内容均不应认为是承认因在先发明而使本发明没有资格先行于这类出版物。
[0256]尽管本发明已经结合其具体的实施例进行了描述，应当理解的是其可以作出进一步的修改而且本申请意欲包含任何改变、应用或修改，它们通常遵循本发明的原理，并且包含与本发明公开内容不同的这样的改变，如来自与本发明领域相关的已知或习惯实践，并且可以应用于在后附的权利要求范围内提出的上文的必要技术特征。
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