一种固定化酵母细胞的微胶囊制备方法.pdf

一种固定化酵母细胞的海藻酸钠－聚赖氨酸微胶囊制备方法，在原有海藻酸盐固定化细胞的基础上，通过大功率微胶囊制备仪，使均匀混合有酵母细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下，形成粒径在100－500μm可控，分布均匀的液滴，与钙溶液固化形成微胶珠。并在微胶珠表面通过离子络合反应瞬间形成一层聚赖氨酸微胶囊膜。再用柠檬酸钠溶液置换出海藻酸钙凝胶中的钙，使微胶囊内液化成液体环境。本发明是在全生理条件下制备，其制备过程条件温和：pH5.0－7.4；4－30℃；无剪切及振荡。制备过程中酵母细胞活性100％保持。在培养过程中细胞的泄漏率低于10％。

1、  一种固定化酵母细胞的微胶囊制备方法，其主要步骤为：
a)通过大功率微胶囊制备仪，将均匀混合有酵母细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下，形成液滴；
b)步骤a的液滴与钙溶液固化形成海藻酸钙微胶珠，并与聚赖氨酸溶液反应成膜，在微胶珠表面形成一层聚赖氨酸微胶囊膜；
c)用柠檬酸钠溶液将步骤b制得的微胶囊内部海藻酸钙凝胶液化，使微胶囊内成液体环境；
所述海藻酸钠浓度在8-30g/L；
所述氯化钙浓度在0.05-0.3mol/L；
所述聚赖氨酸分子量在1-10万，聚赖氨酸溶液浓度在0.1-10g/L，pH在7.0-7.4；
所述柠檬酸钠溶液浓度在0.01-0.10mol/L。

2、  按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的酵母细胞包括啤酒酵母、热带假丝酵母或毕氏酵母及基因工程酵母菌。

3、  按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的液滴其粒径在100-500μm。

4、  按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述的海藻酸钙凝胶珠与聚赖氨酸溶液反应成膜时间在5-60分钟。

5、  按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中所述的聚赖氨酸微胶囊膜厚为5-50μm。

一种固定化酵母细胞的微胶囊制备方法
技术领域
本发明涉及一种微胶囊制备方法，具体地说涉及一种固定化酵母细胞的微胶囊的制备方法。
背景技术
细胞固定化技术是早在20世纪70年代发展起来的一门新兴的生物技术[文献1：Kierstan M，Bucke C.The immobilization of microbial cells，subcellular organelles，and enzymes in calcium alginate gels.BiotechnolBioeng 1977 Mar；19(3)：387-97]，是现代生物工程领域的重要内容之一。其实质就是利用物理或化学方法将游离细胞固定在一定的空间内，作为生物催化剂而连续使用。细胞固定化技术优于游离细胞主要体现在：(1)可提高反应器中的细胞浓度，使反应速度加快，容积生产效率提高；(2)细胞可连续使用；(3)抗污染能力强；(4)可连续发酵，产物分离方便；(5)便于放大和实现自动化。因此，细胞固定化技术目前愈来愈广泛地应用于食品与发酵工业中。
酵母细胞是酿造工业及基因工程技术中使用最广泛的一类微生物，因此，研究酵母细胞的固定化具有很好的应用价值和前景。酵母细胞固定化方法主要有共价偶联法、吸附法和包埋法。其中，包埋法以其简便、易于放大、细胞活性保持好等优势而被广泛采用。常用的包埋载体可以是天然材料，如海藻酸盐、明胶、褐藻胶，K-角叉菜，或合成高分子材料，如聚丙烯酰胺，聚乙烯醇等。其中，褐藻胶，K-卡拉胶、明胶存在强度差、使用寿命短等缺点；聚丙烯酰胺单体有神经毒性，不利于微生物活细胞生长；聚乙烯醇制备过程中需要高无机盐浓度对微生物生长不利。目前，应用较多的是海藻酸盐固定化酵母细胞[文献2：L.Kurillova，P.Gemeiner，A.Vikartovska，H.Mikova，M.Rosenberg and M.Ilavsky.Calciumpectate gel beads for cell entrapment.6.morphology of stabilized andhardened calcium pectate gel beads with cells for immobilized biotechnology.J.microencapsulation，2000，17(3)：279-296]，但存在着海藻酸钙颗粒较大(mm级)[文献3：Viktor A.Nedovic，Bofana Obradovic，Ida Leskoosek-Cukalovic，Oliivera Trifunovic，Radofica Pesic，Branko Bugarski.Electrostatic generationof alginate microbeads loaded with brewing yeast.Process biochemistry 2001，37(1)：17-22]，影响溶质在固定化细胞凝胶中的扩散；易发生细胞泄漏[文献4：Yoshimitsu Uemura，Naoki Hamakawa，Hidekazu Yoshizawa，HirokiAndo，Kazuya Ijichi，and Yasuo Hatate.Effect of calcium alginate coating onthe performance of immobilized yeast cells in calcium alginate beads.Chem.Eng.Comm.2000，177：1-14]，和培养过程中细胞损失较大等问题。
发明内容
本发明针对上述问题提出在制备出小粒径海藻酸钙微胶珠的基础上，进一步处理制备成一种新型的酵母细胞固定化技术-海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊。与传统的海藻酸钙固定化技术相比，本发明用大功率微胶囊制备仪[文献5：马小军，任吉伦，何洋。大功率高压脉冲微胶囊制备仪。中国发明专利00253538.6]制备出粒径在500μm以下的微胶珠，产量为700ml/h，再在胶珠表面通过离子络合反应瞬间形成一层聚赖氨酸微胶囊膜，最后用柠檬酸钠溶液将微胶囊内部海藻酸钙凝胶液化，使微胶囊内成液体环境[文献6：马小军，解玉冰，周丽，虞星炬，袁权，李昌臣，郝莉，贺欣，孙绵方。APA生物微胶囊的制备条件与膜强度的关系。中华器官移植杂志，1995，16(4)：156-157]。本发明的制备工艺特点是：1)条件温和，制备过程中酵母细胞损失很少，细胞活性保持100％；2)由于聚赖氨酸微胶囊膜的存在，与海藻酸钙胶珠相比，酵母细胞在培养过程中细胞泄漏明显减少；3)由于微胶囊粒径小，降低了溶质的扩散距离；4)微胶囊内为液体环境，消除凝胶部分的死区，改善通透性，有利于溶质在固定化细胞中的扩散；5)用大功率微胶囊制备仪可以实现大规模制备酵母细胞的固定化载体
本发明的原理是在原有海藻酸盐固定化细胞的基础上，通过大功率微胶囊制备仪，使均匀混合有酵母细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下，形成粒径在100-500μm可控，分布均匀的液滴，与钙溶液固化形成微胶珠。并在微胶珠表面通过离子络合反应瞬间形成一层聚赖氨酸微胶囊膜。再用柠檬酸钠溶液置换出海藻酸钙凝胶中的钙，使微胶囊内液化成液体环境。
本发明的制备方法中，其主要制备步骤为：
1)通过大功率微胶囊制备仪，将均匀混合有酵母细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下，形成液滴；
本发明所采用的酵母细胞包括啤酒酵母、热带假丝酵母、毕氏酵母等各种用于食品加工业的酵母细胞及各种能够表达外源基因的基因工程酵母细胞。
本发明所采用的海藻酸钠浓度在8-30g/L；
本发明所述的液滴其粒径在100-500μm可控，分布均匀，且具有良好的单分散性。
2)步骤1的液滴与钙溶液固化形成海藻酸钙微胶珠，并与聚赖氨酸溶液反应成膜，在微胶珠表面形成一层聚赖氨酸微胶囊膜；
本发明所采用的氯化钙浓度在0.05-0.3mol/L；
本发明反应成膜时间在5-60分钟，膜厚在5-50μm范围内可控；
本发明所采用的聚赖氨酸分子量在1-10万，聚赖氨酸溶液浓度在0.1-10g/L，pH在7.0-7.4。
3)用柠檬酸钠溶液将步骤2制得的微胶囊内部海藻酸钙凝胶液化，使微胶囊内成液体环境；
本发明所采用的柠檬酸钠溶液浓度在0.01-0.10mol/L。
本发明提供的方法是在全生理条件下制备，其制备过程条件温和：pH7.0-7.4；4-30℃；无剪切及振荡。制备过程中酵母细胞活性100％保持。
本发明系统中制备的固定化酵母细胞的聚赖氨酸微胶囊在培养过程中细胞的泄漏率低于10％。
本发明制备的微胶囊粒径小于通常的固定化载体，且微胶囊内部为液体环境，极大改善了固定化载体的传质问题，使培养过程中囊中心区的酵母细胞仍然存活，保证酵母细胞的有效利用率。而且，由于微胶囊在原有海藻酸钙胶珠的基础上覆盖一层聚赖氨酸微胶囊膜，减少了培养过程中酵母细胞泄漏现象的发生，提高酵母细胞固定化发酵的产率。另外，本发明提供的制备方法其产率高达700ml/h，初步实现规模化。
附图说明
图1为本发明的制备过程示意图。
图2为不同分子量蛋白质在本发明制备的海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊中的扩散曲线
具体实施方式
例1：有关本发明的制备过程请参照图1。将悬浮培养处于对数生长期的酵母菌GS115离心收集菌体，与15g/L的海藻酸钠溶液均匀混合。在大功率微胶囊制备仪的高压电场作用下滴入100mmol/L的氯化钙溶液中进行凝胶化反应30分钟，制备出粒径在300μm海藻酸钙凝胶珠，然后与0.5g/L的聚赖氨酸溶液成膜反应10分钟，生理盐水清洗3遍后55mmol/L柠檬酸钠溶液液化10分钟，生理盐水清洗3遍后制备出聚赖氨酸微囊化酵母菌，囊膜厚度25μm。整个制备过程均在生理条件下完成，制备过程中酵母细胞存活率100％保持。
例2：将制备好的含有酵母细胞的海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊与海藻酸钙微胶珠置于YPD培养液中，摇瓶培养，28℃，180rpm，培养24小时后，计算酵母细胞泄漏率。结果表明，聚赖氨酸微胶囊组细胞的泄漏率比海藻酸钙微胶珠组降低3倍以上。
例3：图2给出了不同分子量蛋白在海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊的扩散曲线图，由图可以判断，低于1万Da的分子在海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊中可以自由扩散，不影响囊内酵母菌营养的供应和代谢产物的排出。
比较例：
文献3采用静电液滴法制备出粒径在250-2000μm的固定化酵母细胞地海藻酸钙胶珠。虽然解决了小粒径问题，但产率低(仅25.2ml/h)。本发明制备的固定化酵母细胞的海藻酸钙胶珠粒径在100-500μm范围可控，且产率高达700ml/h。
文献4通过制备双层海藻酸钙凝胶来减少细胞泄漏，虽然在解决细胞泄漏问题上有一定的效果，但制备的胶珠粒径在3mm，大粒径载体在培养过程中，载体中心部分的酵母细胞由于受传质阻力影响无法获得充分的营养供应。本发明制备的固定化酵母细胞的聚赖氨酸微胶囊既减少了细胞泄漏，又通过小粒径(可控制在100-500μm范围)和内部液体环境解决了传质问题。