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本发明提供了一种食管癌相关甲基化生物标志物及应用，采用EDTA真空抗凝采血管采集待测者的外周静脉血，分离上层血浆，采用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit提取血浆循环DNA，采用EZ DNA Methylation Kit进行亚硫酸氢盐修饰。修饰后的血浆循环DNA采用质谱法检测CASZ1、CDH13和ING2食管癌相关抑癌基因中CG位点甲基化频率为生物标志物，该生物标志物用于食管癌的筛查、预判、防治。本发明具有快速、简便、灵敏、特异以及无创的优点，且DNA甲基化可以通过外源药物逆转，因而该研究结果也具有潜在的肿瘤治疗应用前景。

1.  一种食管癌相关甲基化生物标志物，其特征在于，通过在CASZ1、CDH13和ING2食管癌相关抑癌基因中检测到的特定CG位点甲基化频率为生物标志物。

2.  权利要求1所述的食管癌相关甲基化生物标志物在筛查、预判、防治待检者罹患食管癌方面的应用。

一种食管癌相关甲基化生物标志物及应用
技术领域
本发明属于癌症预防领域，尤其涉及一种食管癌相关甲基化生物标志物及应用。
背景技术
食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤，以南部和东部非洲、东亚地区发病率最高。中国是食管癌高发区之一，发病率比美国高20到30倍。除了众所周知的行为与膳食因素与食管癌发生有关之外，个体遗传因素也不容忽视。近年来，随着分子生物学和对肿瘤起源机制认识的不断深入，表观遗传异常在肿瘤发生中的作用日益受到关注。
表观遗传改变的主要形式之一是DNA甲基化，这是哺乳类动物遗传外修饰的一种重要调控方式，也是脊椎动物DNA惟一的自然化学修饰方式。DNA甲基化主要发生在富含CG岛的基因启动子区。启动子区的CG岛发生甲基化后可以导致基因转录受抑制，蛋白表达量减少，相应功能下降甚至丧失。由于DNA甲基化模式还具有肿瘤特异性，即不同类型的肿瘤可能存在不同的DNA甲基化谱，通过识别DNA异常甲基化谱并构建特异文库可作为潜在的分子生物标志物用于食管癌的诊断。
传统的食管癌诊断方法包括X线、CT、核磁共振、胃镜检查等，但均存在敏感性低和早期病灶难以发现等缺点。寻找快速、简便、灵敏、特异的早期诊断方法成为当前食管癌防治工作中的一项重要任务。与传统的蛋白类生物标志物相比，DNA甲基化改变常常是细胞癌变过程中更为早期的事件，如果能够建立合理的多指标的DNA甲基化图谱，在疾病的早期阶段即采用分子生物学技术识别出这种特异性变化，无疑对实现食管癌“三早”将具有极重要意义。
早在上个世纪七、八十年代，科学家们就已经发现肿瘤患者的外周血中存 在一种来源于肿瘤灶的游离DNA(cell free DNA)。近几年游离DNA在肿瘤的诊断和预后中的作用日益受到重视，成为一个具有广阔应用前景的生物标志物。实体恶性瘤能通过细胞坏死或凋亡释放大量的DNA进入体循环，分子大小在500bp～30kb之间。近年来的研究表明，人外周血游离DNA的量和质的改变与疾病发生发展关系密切，有希望成为疾病诊断、疗效评估及预后监测的一种重要分子标志物。游离DNA的遗传特征与对应的肿瘤组织高度一致，如存在相似的基因突变、微卫星不稳定性和杂合性缺失，并且具有一致的表观遗传改变特征。在循环DNA研究中的一个重要发现是肿瘤患者的血浆/清中可同时检测到循环DNA的异常甲基化，而且外周血循环DNA的甲基化模式与癌组织一致，这一发现为无创性DNA甲基化谱分析提供了可能。
由于抑癌基因异常甲基化是肿瘤发生过程的早期事件，识别并构建甲基化谱文库对于食管癌早期诊断和预后具有重要的应用价值，尤其是识别外周血中肿瘤特异性DNA甲基化谱更是为寻找无创性食管癌诊断标志物提供了线索。由于DNA甲基化可以通过外源药物逆转，因而该研究结果也具有潜在的肿瘤治疗应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食管癌相关甲基化生物标志物及应用，旨在解决现有食管癌诊断方法包括X线、CT、核磁共振、胃镜检查等存在敏感性低和早期病灶难以发现等问题。
本发明是这样实现的，一种食管癌相关甲基化生物标志物，通过在CASZ1、CDH13和ING2食管癌相关抑癌基因中检测到的特定CG位点甲基化频率为生物标志物。
该生物标志物获取的具体过程包括：采用EDTA真空抗凝采血管采集待测者的外周静脉血，分离上层血浆，采用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit提取血浆循环DNA，采用EZ DNA Methylation Kit进行亚硫酸氢盐修饰。修饰后 的血浆循环DNA采用质谱法检测相关基因CG位点的甲基化。
本发明进一步提供了上述食管癌相关甲基化生物标志物在筛查、预判、防治待检者罹患食管癌方面的应用。
通过检测样品中CASZ1、CDH13和ING2的甲基化频率可以辅助判断待检者罹患食管癌的可能性大小，在患者发生食管癌的早期即可识别，有助于早发现、早诊断、早治疗。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以外周血循环DNA甲基化作为生物标志物用于食管癌的早期筛查、预判、防治，具有快速、简便、灵敏、特异以及无创的优点，具有重要的应用价值。
(2)本发明生物标志物中DNA甲基化可以通过外源药物逆转，因而该研究结果也具有潜在的肿瘤治疗应用前景。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1食管癌相关甲基化生物标志物的获取
1、血液采集
采用EDTA真空抗凝采血管采集患者空腹外周静脉血3～5ml，3,000转/分钟离心10分钟，小心吸取上层血浆置于离心管中，再次离心10分钟，速度5,000转/分钟，吸取上层血浆置于另一冻存管，用于DNA甲基化检测，待测样本可置-80℃冷冻保存。
2、DNA提取
采用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit提取血浆DNA。试剂盒由Mini  Columns，Tube Extenders，Elution Tubes，VacConnectors，Collection Tubes，Buffer ACL，Buffer ACB，Buffer ACW1，Buffer ACW2，Buffer AVE,Carrier RNA以及蛋白酶K组成。
3、DNA修饰
采用美国EZ DNAMethylation Kit进行亚硫酸氢盐修饰。试剂盒中包括M-Dilution Buffer，CT Conversion Reagent,M-Binding Buffer,Zymo-SpinTMIC Column，M-Wash Buffer，M-Wash Buffe，M-Elution Buffer，Collection Tubes。修饰后的DNA样本放入-20℃冰箱备用。
4、甲基化检测
设计PCR引物，如下表1所示：
表1 血液样本甲基化检测的引物序列

采用飞行质谱法检测CASZ1、CDH13和ING2三个基因中7个CG位点(CASZ1_CpG_2.3；CASZ1_CpG_4；CASZ1_CpG_5；CDH13_CpG_8；ING2_CpG_1.2.3.4；ING2_CpG_5；ING2_CpG_6.7)的甲基化频率。
如果血浆DNA片段化严重，则CDH13基因可采用表2中的引物进行扩增：
表2 用于片段化严重的血液样本甲基化检测的引物序列

5、结果
以前期研究结果确定的正确判断率最高的截断值为依据，综合判断待测样本来自食管癌患者的可能性大小。表3为单位点甲基化频率截断值参考表，表4为各基因CG位点累计甲基化频率截断值参考表。
表3 单位点甲基化频率截断值参考表


表4 各基因CG位点累计甲基化频率截断值参考表


实施例2生物标志物在食管癌筛查方面的应用
1、研究方法
首先利用DNA甲基化芯片技术初筛食管癌组织中差异甲基化位点；然后扩大样本对初筛出的甲基化位点进行质谱法验证，比较食管癌组织与血浆中特异基因DNA甲基化模式的一致性。
病例来源于在扬中市人民医院进行食管癌手术的患者，要求：(1)有组织病理学诊断依据；(2)病理类型为食管鳞状细胞癌；(3)获得患者的知情同意；(4)术前未接受过放疗和化疗。术前采用EDTA真空抗凝采血管采集静脉血5ml，离心后置-80℃冷冻保存。术中收集癌灶中心组织和手术切除的食管远端肉眼正常的食管组织(距离癌灶中心5cm以上)，置于-80℃低温保存。正常食管粘膜对照组织来自参加胃镜体检的人群，要求无恶性肿瘤病史，胃镜检查证实无严重胃、食管疾病。
第一阶段芯片初筛采用Illumina Human 450K芯片，第二阶段采用Maldi-Tof质谱法(基质辅助激光解电离飞行时间质谱)检测组织及外周血DNA甲基化。采用Sequenom在线设计软件(https://www.mysequenom.com/Tools)设计甲基化引物。针对每个CG位点设计多重PCR反应的特异引物和单碱基延伸所用的延伸引物，考虑单个反应的成功率以及多个反应产生的PCR产物大小 间的相互影响，选取最佳的引物组合。对于游离DNA片段化严重的血清样本，则采用多对引物扩增法。
2、研究结果
2.1、芯片初筛
基于芯片检测的前300个位点的P值以及GO、KEGG分析并且考虑其交集，获得10个潜在抑癌基因用于二阶段验证，如下表5所示：
表5 芯片筛选出的异常甲基化基因

2.2质谱分析
采用针对10个基因的扩增产物一共包含89个CG位点，比较食管癌组织、食管癌患者血浆、正常食管组织的DNA甲基化频率，如下表6所示：
表6 特定基因CG位点甲基化频率在食管癌组织、外周血和正常对照中的差异


筛选出3个食管癌相关抑癌基因(CASZ1、CDH13和ING2)，以这3个基因的特定CG位点的甲基化频率作为筛查和诊断食管癌的生物标志物，灵敏度和特异度均可达100％，如下表7所示：
表7 特定基因累计甲基化频率在食管癌组织、外周血和正常对照中的差异

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。