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1、10申请公布号CN104043379A43申请公布日20140917CN104043379A21申请号201410281508322申请日20140621B01J13/1420060171申请人北京化工大学地址100029北京市朝阳区北三环东路15号72发明人谭天伟张帆吕永琴林龙泉葛春玲74专利代理机构北京思海天达知识产权代理有限公司11203代理人刘萍54发明名称一种琼脂/葡聚糖复合凝胶微球的制备方法57摘要本发明公开了一种琼脂/葡聚糖复合凝胶微球的制备方法。该方法是通过琼脂凝胶微球上的羟基与葡聚糖的羟基反应而得到复合凝胶微球。该复合微球机械强度高，稳定性好，生物相容性好，且成本低廉，可用作。
2、分离介质及生物活性物质载体，特别是在分离纯化中具有广泛的应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图8页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图8页10申请公布号CN104043379ACN104043379A1/1页21一种琼脂/葡聚糖复合凝胶微球的制备方法，包括步骤A，在反应容器中加入琼脂凝胶微球和L葡聚糖溶液，所述的琼脂凝胶微球中琼脂的含量为220WT，葡聚糖溶液的浓度为00515G/ML；步骤B，在2555下，转速为60200RPM，加入无水硫酸钠，溶解后，再加NABH4；加入硫酸钠和NABH4后体系中含有01025G/MLNA2SO4和00。
3、08002G/MLNABH4；步骤C，在碱性条件下，加入双功能团交联剂；步骤D，反应温度为40120摄氏度，反应持续时间为1525H。2根据权利要求1所述的琼脂葡聚糖复合凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤A所述的琼脂凝胶微球中琼脂的含量为212WT，粒径在30500微米。3根据权利要求1所述的琼脂葡聚糖复合凝胶微球的制备方法，其特征在于葡聚糖的分子量为220万。4根据权利要求1所述的琼脂葡聚糖复合凝胶微球的制备方法，其特征在于步骤C中，滴加浓度为2070WT的NAOH溶液，其加入量为琼脂凝胶微球体积量的015倍。5根据权利要求1所述的琼脂葡聚糖复合凝胶微球的制备方法，其特征在于交联剂的加入量为。
4、琼脂凝胶微球体积的025倍。6根据权利要求1所述的琼脂葡聚糖复合凝胶微球的制备方法，其特征在于交联剂为环氧氯丙烷、1,4丁二醇二双缩水甘油醚或季戊四醇缩水甘油醚。7如权利要求16中的任意一项所述方法制备的琼脂葡聚糖复合凝胶微球在分离和纯化中的应用。权利要求书CN104043379A1/5页3一种琼脂/葡聚糖复合凝胶微球的制备方法技术领域0001本发明涉及生物工程下游，分离纯化介质的制备领域。更具体的说，本发明涉及一种琼脂葡聚糖复合凝胶微球的制备方法。背景技术0002在生物下游处理过程中，层析分离技术具有其他分离手段无法替代的地位，层析技术发展的关键是分离介质的开发。在大规模生物大分子分离纯化中。
5、，对分离介质的要求是低成本、高流速和较好分离效果。0003琼脂糖凝胶是一种十分常用的的天然多糖类介质，与生物大分子有很好的相容性。琼脂糖凝胶的原料琼脂糖提取于琼脂，高昂的提取成本使琼脂糖凝胶的价格昂贵，使其在大规模工业化应用中受到限制。0004琼脂主要由琼脂糖和硫琼胶组成。琼脂凝胶微球与琼脂糖凝胶微球相似，具有高亲水性，大孔性，高度多孔性，生物相容性好的特点，带有大量可以与其他化学基团反应的羟基，且生产成本很低，适合用作分离介质大规模使用。琼脂凝胶的结构是由氢键相互作用形成的，这种非共价键形成的微球机械强度差，无法实现快速分离的要求。提高琼脂凝胶微球强度的途径有两个，其一是通过化学交联，即通过。
6、在多糖链上的羟基间引入共价键提高凝胶强度，其二是通过提高凝胶微球中的琼脂含量，但琼脂含量增加使溶液粘度增大，制球比较困难，所以琼脂含量的增加有限，所以通常使用途径一。且琼脂微球的孔径较大，难以控制，并带有少量负电荷，会造成特异性吸附。0005葡聚糖，又称右旋糖酐，是由无数个葡聚糖分子聚合而形成的直链多糖。它具有较高的分子量，按照其单糖数目，通常可分为葡聚糖10万，葡聚糖4万，葡聚糖2万等系列的聚合物。交联的葡聚糖分子中形成了交联网状结构，可用作分子筛，用于不同分子量的化合物的分离，也可用于脱盐、置换缓冲液等。葡聚糖的分子链上含有大量亲水性的羟基，易于进行化学修饰，且通过交联剂和葡聚糖的量易于控。
7、制孔径。但目前葡聚糖凝胶的市场价格较为昂贵，如葡聚糖G25售价15002500元。0006综合琼脂凝胶微球和葡聚糖凝胶微球的优缺点，我们开发了一种琼脂葡聚糖复合凝胶微球。通过化学交联，在羟基间引入了共价键提高凝胶强度，葡聚糖掩盖了琼脂凝胶表面电荷，且更加方便控制孔径。这种价格低廉，孔径易控，机械强度好，不带电荷的微球适合用作分离介质及生物活性物质载体，具有广泛的应用前景。发明内容0007本发明的目的在于提供一种琼脂/葡聚糖复合凝胶微球及其制备方法。0008一种琼脂/葡聚糖复合凝胶微球的制备方法，包括步骤A，在反应容器中加入相同体积的琼脂凝胶微球和葡聚糖溶液，所述的琼脂凝胶微球中琼脂的含量为22。
8、0WT，葡聚糖溶液的浓度为00515G/ML；步骤B，在2555下，转速为60200RPM，加入无水硫酸钠，溶解后，再加NABH4；加入硫酸钠和NABH4后体系中含有01025G/MLNA2SO4说明书CN104043379A2/5页4和0008002G/MLNABH4；步骤C，在碱性条件下，加入双功能团交联剂；步骤D，反应温度为40120摄氏度，反应持续时间为1525H。0009进一步，步骤A所述的琼脂凝胶微球中琼脂的含量为612WT，粒径在30500微米。0010进一步，葡聚糖的分子量为220万。0011进一步，步骤C中，滴加浓度为2070WT的NAOH溶液，其加入量为琼脂凝胶微球体积量的。
9、015倍。0012进一步，交联剂的加入量为琼脂凝胶微球体积的025倍。0013进一步，交联剂为环氧氯丙烷、1,4丁二醇双缩水甘油醚或季戊四醇缩水甘油醚。0014所述方法制备的琼脂葡聚糖复合凝胶微球在分离和纯化中的应用。0015本发明的技术方案是以不同浓度琼脂含量的琼脂凝胶微球为基质，通过交联的方法，合成一种机械强度好，稳定性高，生物相容性好，且成本低廉的琼脂/葡聚糖复合凝胶微球。附图说明0016图1为实施例1中制备的一次筛分后的6的琼脂微球的光学显微镜照片。0017图2为实施例1中制备的一次筛分后的6的琼脂微球的粒径分布曲线。0018图3为实施例1中制备的一次筛分后的6的琼脂微球的扫描电镜图。。
10、0019图4为实施例1中制备的琼脂葡聚糖复合凝胶微球的光学显微镜照片。0020图5为实施例1中制备的琼脂葡聚糖复合凝胶微球的粒径分布曲线。0021图6为实施例1中制备的琼脂葡聚糖复合凝胶微球的扫描电镜图。0022图7为实施例1中制备的琼脂葡聚糖复合凝胶微球的压力流速曲线图。0023图8为实施例1中制备的微球琼脂葡聚糖复合凝胶微球用于含盐牛血清蛋白溶液的分离效果图。0024图9为实施例1中制备的微球琼脂葡聚糖复合凝胶微球用于含盐卵清蛋白溶液的分离效果图。0025图10为实施例1中制备的微球琼脂葡聚糖复合凝胶微球用于含盐和小肽的米赫根毛酶溶液的分离效果图。0026图11为实施例1中制备的微球琼脂葡。
11、聚糖复合凝胶微球用于含盐肌红蛋白溶液的分离效果图。0027图12为实施例4中制备的琼脂葡聚糖复合凝胶微球的扫描电镜图。0028图13为实施例5中制备的琼脂葡聚糖复合凝胶微球的扫描电镜图。0029图14为实施例5中制备的琼脂葡聚糖复合凝胶微球用于含牛血清蛋白和谷胱甘肽的混合溶液的分离效果图。0030图15为实施例6中制备的琼脂葡聚糖复合凝胶微球的扫描电镜图。0031图16为实施例7中制备的微球琼脂葡聚糖复合凝胶微球用于含盐牛血清蛋白溶液的分离效果图。0032图17为实施例8中制备的微球琼脂葡聚糖复合凝胶微球用于含盐牛血清蛋白溶液的分离效果图。说明书CN104043379A3/5页5具体实施方式0。
12、033实施例子中所述琼脂/葡聚糖复合凝胶微球的制备方法包括以下步骤步骤A，通过乳化固化法制备琼脂凝胶微球，其制备过程中，水相里琼脂的含量为220WT；之前专利谭天伟，胡瑜，杨自信，魏军，陈艳敏一种琼脂凝胶微球的制备方法专利号2011102203223，步骤一将琼脂溶于水制成水相W，其中水相中琼脂的含量为420WT；步骤二将油溶性表面活性剂溶于与水互不相容的有机溶剂中制成油相O，其中在油相中含有体积比为1020的油溶性表面活性剂；步骤三，将水相加入油相进行分散乳化得到W/O型乳滴，其中油相与水相的体积比为11101；步骤四，W/O型乳滴经冷却固化得到琼脂凝胶微球。0034在反应容器中加入50ML。
13、琼脂微球和50ML葡聚糖溶液，葡聚糖溶液浓度为00515G/ML；步骤B，在2555下，转速为60200RPM，加入无水硫酸钠，溶解后，再加NABH4；步骤C，在碱性条件下，加入交联剂；步骤D，反应温度为40120摄氏度，反应持续时间为1525H。0035在本发明的一个优选实施例中，步骤A所用的琼脂微球的琼脂在水相含量为220WT，优选为612WT，葡聚糖的分子量优选为220万，葡聚糖溶液的浓度优选为00515G/ML。步骤B中的反应温度为2555，转速为60200RPM，为了防止反应过程中琼脂变色和水解，反应是在01025G/MLNASO4和0008002G/MLNABH4存在条件下经行的。。
14、步骤C中，碱性环境为浓度为2070WT的NAOH溶液，其加入量为琼脂凝胶微球体积量的015倍，优选为琼脂凝胶微球体积的043倍。交联剂的加入量为琼脂微球体积的025倍，优选为琼脂凝胶微球体积的043倍,其交联剂为环氧氯丙烷、1,4丁二醇二双缩水甘油醚或季戊四醇缩水甘油醚等含双官能团的长短交联剂。步骤D中，温度为40120摄氏度，反应持续时间为1525H。停止反应，清洗至中性，保存。下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不限于本发明的应用范围。0036如果没有特殊说明，本发明中的所有粒径单位均为微米，浓度单位均为WT，温度单位均为。0037本发明提供的复合微球。
15、及其制备方法还能够带来下列效应0038本发明提供的制备方法可以制备作为生化分离介质的凝胶微球，用于不同尺寸大小的蛋白、核酸等物质的分离和脱盐，还可以作为活细胞、基因等载体，为细胞增殖和发挥体内的治疗效果提供有利的微观环境。0039实施例10040制备6WT的琼脂凝胶微球，清洗干净，一次筛分出60微米150微米的微球，至于20WT乙醇中备用。采用OLYMPUSCX41奥林巴斯有限公司，日本光学显微镜观察产品形态，结果如图1所示。采用MASTERSIZER2000激光粒度分析仪马尔文仪器公司，英国分析产品粒度，结果如图2所示。取少量冷冻干燥18H，用扫描电镜观察冻干后产品，结果如图3所示。从图1中。
16、可以看出，微球球形度良好，从图2中可以得到微球粒径分布均一，平均粒径为77487M。从图3中可以看出，微球的机械强度差，经过冷冻干燥后，微球变形。0041在250ML三口瓶中加入50ML筛好的6WT的琼脂凝胶微球、5G分子量为4万的葡说明书CN104043379A4/5页6聚糖和50ML去离子水，在35、140RPM条件下加入78G无水硫酸钠后，搅拌溶解05小时，加入06GNABH4，2ML50WTNAOH溶液，再以01ML/MIN的速率分别加入环氧氯丙烷和50WTNAOH，持续6H，将水浴温度升至50，持续搅拌20小时，冷却至室温，用醋酸调PH至中性，用去离子水和50WT乙醇交替洗净后，将所。
17、得的微球保存在20WT乙醇中。光学显微镜观察产品形态，结果如图4所示。MASTERSIZER2000激光粒度分析仪马尔文仪器公司，英国分析产品粒度，结果如图5所示。取少量冷冻干燥18H，用扫描电镜观察冻干后产品，结果如图6所示。从图4中可以看出，复合微球依然保持了良好的球形度，从图5中可以得到微球分布均一，平均粒径为83726M，对比图2，可以得到复合微球的平均粒径变大，正是应为复合上了葡聚糖。从图3中可以看出，经过冷冻干燥后，微球变形，但和图3相比，球形度有所提高，证实复合微球的机械强度有所提高。做微球表面的元素分析，结果显示琼脂微球表面S元素为015WT，复合微球表面S元素为0WT，表明琼。
18、脂表面含S元素的负电荷被掩盖。0042实施例20043将实施例1中的复合微球装入10200MM的凝胶色谱柱，考察其压力与流速的关系，如图7所示。当流速从01ML/MIN增加到3ML/MIN时，柱压仅增加了约01MPA，当流速增加到35ML/MIN时，柱压力增加到了约04MPA，说明复合微球在分离过程中产生的柱压较小，有利于工业化应用。0044实施例30045脱盐0046将实施例1中的复合微球装柱于10200MM的凝胶色谱柱，样品为溶于TRISHCL的含盐牛血清蛋白溶液、卵清蛋白溶液、米赫根毛酶溶液、胰蛋白酶溶液，洗脱液为PH78的TRISHCL溶液，上样洗脱速度为1ML/MIN。微球分别对于含。
19、盐牛血清蛋白66KDA溶液、卵清蛋白45KDA溶液、米赫根毛酶31KDA溶液、肌红蛋白16700DA溶液的脱盐效果如图8、图9、图10、图11。其中图10的米赫根毛酶溶液中含有一些小肽分子和盐溶液。从图8图11中可以得到复合微球能够实现脱盐以及分离的应用。0047实施例40048与实施例1的不同在于以01ML/MIN的速率分别加入环氧氯丙烷和50NAOH，持续时间由6H改为12H。冻干燥18H，用扫描电镜观察冻干后产品，结果如图12所示。与图6相比，球形度有所提高。0049实施例50050与实施例1的不同在于以04ML/MIN的速率分别加入环氧氯丙烷和50WTNAOH，持续时间为3H。微球冻干。
20、燥18H，用扫描电镜观察冻干后产品，结果如图13所示。按实施例2中装柱用于对含牛血清蛋白和谷胱甘肽的混合溶液进行分离，如图14。0051实施例60052与实施例1的不同在于制备了12的微球，一次筛分50目100目范围内的微球，以01ML/MIN的速率分别加入环氧氯丙烷和50WTNAOH，持续时间为3H。冻干燥18H，用扫描电镜观察冻干后产品，结果如图15所示。0053实施例70054采用与实施例1相同的方式制备复合微球，与实施例1不同的是采用葡聚糖10说明书CN104043379A5/5页7万。用其分离含盐牛血清蛋白溶液，结果如图16所示。0055实施例80056采用与实施例1相同的方式制备复。
21、合微球，与实施例1不同的是交联剂前三个小时使用环氧氯丙烷，后三小时使用1,4丁二醇二双缩水甘油醚。用其分离含盐牛血清蛋白溶液，结果如图17所示。0057以上所述仅为本发明的较佳实例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改，等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104043379A1/8页8图1图2图3说明书附图CN104043379A2/8页9图4图5图6说明书附图CN104043379A3/8页10图7图8说明书附图CN104043379A104/8页11图9图10说明书附图CN104043379A115/8页12图11图12说明书附图CN104043379A126/8页13图13图14说明书附图CN104043379A137/8页14图15图16说明书附图CN104043379A148/8页15图17说明书附图CN104043379A15。