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单核苷酸多态性rs10763170在检测垂体腺瘤中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中单核苷酸多态性rs10763170在检测垂体腺瘤中的应用。
背景技术
垂体腺瘤(Pituitary adenomas)是人体最常见的神经内分泌性肿瘤，也是最常见的脑肿瘤之一。功能性垂体腺瘤会异常分泌激素，导致患者出现不孕不育、肢端肥大、Cushing综合症、甲亢等显著的内分泌紊乱症状，进而严重损害心肝肾等重要脏器功能。垂体腺瘤发病隐匿，生长缓慢，当患者出现临床症状前往就诊时，肿瘤往往已体积巨大，或呈侵袭性生长，压迫邻近重要解剖结构，导致患者出现垂体功能低下、双眼视力下降和颅神经麻痹等神经功能缺失症状，甚至发展为不可逆神经功能损害，严重影响患者的生活质量，甚至危及生命。
目前垂体腺瘤的临床治疗以手术切除为主，药物和立体定向放疗为辅。但该病并非是一种简单的神经外科疾病，而是一种牵涉内分泌科、妇产科、男性科、眼科、放疗科、影像医学科等多学科的复杂疾病，在临床诊疗中仍存在诸多的瓶颈难题。垂体腺瘤的发病机制不清，早期诊断困难，如能早期诊断出垂体腺瘤，并对其采取分层的二级预防及诊治，对于及时终止因肿瘤异常分泌激素对患者心肝肾等重要脏器产生的严重功能损害、防止因肿瘤持续隐匿生长压迫所致的不可逆神经功能损害以及降低治疗风险均有着非常重要的临床意义。目前临床上用于确诊垂体腺瘤的核磁共振检查(MRI)，不仅费用较昂贵，难以用于临床病例的大规模筛检，且由于受到分辨率的限制，难以发现直径<0.5cm的微腺瘤。故目前急需简便、价廉的垂体腺瘤早期诊断工具和方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何筛查垂体腺瘤患者。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述A1)-A6)中的任一用途：
A1)检测人基因组中rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备筛查垂体腺瘤患者产品中的应用；
A2)检测人基因组中rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备检测垂体腺瘤易感性产品中的应用；
A3)检测人基因组中rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备检测与垂体腺瘤相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；
A4)检测人基因组中rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备 鉴定或辅助鉴定与垂体腺瘤相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；
A5)人基因组中rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型在制备筛查垂体腺瘤患者产品中的应用；
A6)人基因组中rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型在制备检测垂体腺瘤易感性产品中的应用。
rs10763170是人染色体10q21.1上的一个二等位多态性的SNP位点，该变异是转换(A/G，在其互补链上则为T/C)。所述rs10763170基因型是AA、AG或GG。所述AA是rs10763170位点为A的纯合型，所述GG是rs10763170位点为G的纯合型，所述AG是rs10763170位点为A和G的杂合型。所述检测人基因组中rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型具体可为检测rs10763170的核苷酸种类。
上述用途中，所述产品包括扩增包括rs10763170在内的基因组DNA片段的PCR引物和/或单碱基延伸引物；
和/或，
所述检测人基因组中rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型的物质可为所述PCR引物和/或所述单碱基延伸引物。
上述用途中，所述AA和所述AG基因型的个体在垂体腺瘤患者群体中的比例分别高于对应的基因型在正常健康人群体中的比例。
上述用途中，所述垂体腺瘤具体为中国人群垂体腺瘤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了含有检测人基因组中rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型的物质的产品。
本发明所提供的含有检测人基因组中rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型的物质的产品，为a)-d)中的任一种产品：
a)检测与垂体腺瘤相关的单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型的产品；
b)鉴定或辅助鉴定与垂体腺瘤相关的单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型的产品；
c)筛查垂体腺瘤患者产品；
d)检测垂体腺瘤易感性产品。
上述产品中，所述产品包括扩增包括所述PCR引物和/或所述单碱基延伸引物；
和/或，
所述检测人基因组中rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型的物质可为所述PCR引物和/或所述单碱基延伸引物。
上述产品中，所述AA和所述AG基因型的个体在垂体腺瘤患者群体中的比例分别高于对应的基因型在正常健康人群体中的比例。
在本发明的实施例中，所述垂体腺瘤具体为中国人群垂体腺瘤。
本发明中，所述扩增包括rs10763170在内的基因组DNA片段的PCR引物对可由序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA组成；所述单碱基延伸引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示。
实验证明，rs10763170的风险等位基因为A，该等位基因在病例组(由垂体腺瘤患者组成)中的比例比该等位基因在对照组(由正常健康人组成)中的比例高2.94％。rs10763170的P值是6.88×10^-10，且rs10763170的相对危险度是1.28，说明rs10763170是与垂体腺瘤相关的单核苷酸多态性。rs10763170的三个基因型中，AA基因型和AG基因型的个体在病例组垂体腺瘤患者群体中的比例分别高于对应基因型的个体在对照组正常健康人群体中的比例；GG基因型的个体在病例组垂体腺瘤患者群体中的比例低于该基因型的个体在对照组正常健康人群体中的比例。
在实际应用中，可将检测rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与垂体腺瘤相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备筛查垂体腺瘤患者的产品。
其中，检测人基因组中rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型的物质可为通过下述至少一种方法确定rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、TaqMan探针技术和Sequenom MassArray技术。其中，利用Sequenom MassArray技术确定rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型所需的试剂和/或仪器包括PCR引物对、基于单碱基延伸反应的延伸引物、磷酸酶(如虾碱性磷酸酶(shrimp alkal ine phosphatase，SAP))、树脂、芯片、MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)和/或Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器；利用TaqMan探针技术确定rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型所需的试剂和/或仪器包括TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪、进行基因分型的模块(如7500System SDS software)和/或TaqMan探针技术所需要的其他试剂；SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片和/或基于荧光分子DNA结合反应的芯片。
所述产品可为试剂或试剂盒，还可为由试剂或试剂盒和仪器组成的系统，如由引物和DNA测序仪组成的系统，由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的系统，由TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的模块以及TaqMan探针技术所需要的其他试剂组成的系统，由探针、PCR引物对以及连接酶检测反应(LDR)所 需要的其他试剂和仪器组成的系统，由PCR引物对、单碱基延伸引物、芯片、PCR仪、进行基因分型的模块和/或Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器组成的系统。
本发明的一个实施例中，采用Sequenom MassArray技术确定rs10763170的多态性(即等位基因)和基因型。所述PCR引物对在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括rs10763170在内的基因组DNA片段即可，具体可为序列表中SEQ ID No.3和SEQID No.4所示的单链DNA。所述单碱基延伸引物具体可为序列表中SEQ ID No.8所示的单链DNA。Sequenom MassArray技术所需要的其他仪器包括MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪(Sequenom)和/或MALDI-TOF质谱仪。Sequenom MassArray技术所需要的芯片为SpectroCHIP(Sequenom)芯片(Sequenom)。所述进行基因分型的模块为TYPER 4.0软件(Sequenom)。
在本发明的实施例中，对rs10763170进行基因分型用到的PCR反应体系如表1所示，反应条件为：95摄氏度2min(预变性)；95摄氏度30s，56摄氏度30s，45个循环；72摄氏度60s；72摄氏度5min；4摄氏度保存。
表1、PCR反应体系

试剂及其浓度体积(μl)模板DNA(10ng/μl)1引物F(SEQ ID No.3所示的单链DNA，0.5μM)0.5引物R(SEQ ID No.4所示的单链DNA，0.5μM)0.510×Buffer(含Mg²⁺)0.5MgCl₂(25mM)0.4dNTPs(25mM)0.1Hotstar(5U/μl)0.1超纯水1.9总体积5
在本发明的实施例中，对rs10763170进行基因分型用到的2μl的SAP消化反应体系为：SAP Buffer 0.17μl，SAP Enzyme 0.3μl，超纯水1.53μl。SAP消化反应的程序为：37摄氏度40min；85摄氏度5min；4摄氏度保持。
在本发明的实施例中，对rs10763170进行基因分型用到的单碱基延伸反应的体系 如表2所示。
表2、单碱基延伸反应体系
试剂及其浓度体积(μl)单碱基延伸引物0.94Gold Buffer0.2Termination mix0.1Enzyme0.021超纯水0.739总体积2
所述单碱基延伸反应在ABI9700仪中进行，反应条件为：
94摄氏度30s

72摄氏度3min
4摄氏度保持。
本发明中的利用Sequenom MassArray技术确定rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型的试剂可来自于Sequenom的货号为10148-2的CompleteGold Genotyping Reagent Set 10x384，如所述Hotstar(5U/μl)、所述10×Buffer(含Mg²⁺)、所述dNTPs(25mM)、所述MgCl₂(25mM)、所述虾碱性磷酸酶(shrimp alkal ine phosphatase，SAP)、所述SAP Buffer、所述树脂、所述Gold Buffer、所述Termination mix、所述Enzyme。
本发明中的ABI9700仪可为ABI公司产品，型号为9700。
本发明在一个来自中国人群的样本中发现rs10763170是与垂体腺瘤相关的单核苷酸多态性。可将检测rs10763170的多态性(即等位基因)或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与垂体腺瘤相关的单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型的物质)联合在一起制备筛查中国人群中垂体腺瘤患者的产品。
附图说明
图1为初筛阶段样本两个首要成分PCA plot。其中，C1为主成分1，C2为主成分 2。
图2为初筛阶段的Q-Q图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的利用Sequenom MassArray技术确定单核苷酸基因型的试剂均为Sequenom产品。
实施例1、rs2359536、rs10763170和rs17083838是与垂体腺瘤相关的单核苷酸多态性
一、研究对象
病例组：3313例于复旦大学附属华山医院神经外科就诊并手术的垂体腺瘤患者。该3313例垂体腺瘤患者均经临床表现、内分泌实验室检查、影像学检查为垂体腺瘤和两位以上病理学专家对肿瘤标本进行组织学鉴定确诊为垂体腺瘤患者。该3313例垂体腺瘤患者均不患有其他恶性疾病(如脑膜瘤、胶质瘤、淋巴瘤、白血病、肺癌、胃癌、肠癌、乳腺癌和宫颈癌等)，该3313例垂体腺瘤患者均不为家族性垂体腺瘤患者。将病例组的3313例垂体腺瘤患者分为三组(表3)，即病例组1、病例组2和病例组3，病例组2中的垂体腺瘤患者主要来自于中国东部地区(主要为上海市，其次为浙江省和江苏省)，病例组3中的垂体腺瘤患者主要来自于中国中部地区(主要包括安徽省、江西省、湖北省和河南省)。
对照组：6408个均未患有垂体腺瘤并且无垂体腺瘤家族史的正常健康人，且无其他病病史。将对照组的6408个正常健康人分为三组(表3)，即对照组1、对照组2和对照组3，对照组2中的正常健康人主要来自于中国东部地区(主要为上海市，其次为浙江省和江苏省)，对照组3中的正常健康人主要来自于中国中部地区(主要包括安徽省、江西省、湖北省和河南省)。
所有参与研究的研究对象均在实验开始之前给予知情同意，且该研究获得参与人员的许可。本研究获得华山医院伦理委员会批准。
初筛阶段的研究对象为病例组1和对照组1。验证阶段分为2部分，即验证阶段1和验证阶段2，验证阶段1的研究对象为病例组2和对照组2，验证阶段2的研究对象为病例组3和对照组3。
表3、研究对象信息
 病例组对照组初筛阶段7712788验证阶段120802093验证阶段24621527总数33136408平均年龄(岁)44.9±13.957.7±9.3女性比例(&)52.053.8
二、关联分析
分别抽取上述病例组的每个患者和上述对照组的每个正常健康人的外周静脉血5ml，放置于EDTANa₂抗凝管中，得到血液样本。采用Flexi Gene DNA提取试剂盒(Qiagen)提取血液样本的基因组DNA，并且采用标准琼脂糖凝胶电泳技术检测得到的基因组DNA质量，采用NanoDrop(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)检测基因组DNA浓度。初筛阶段的病例组1和对照组1的基因组DNA浓度均为50ng/μl，验证阶段的病例组2、对照组2、病例组3和对照组3的基因组DNA浓度均为10-20ng/μl。
1、基因分型
在ABI9700PCR仪上用PCR反应扩增包括SNP位点在内的DNA片段，对得到的PCR产物用虾碱性磷酸酶(shrimp alkal ine phosphatase，SAP)进行消化反应后进行单碱基延伸反应，而后对单碱基延伸反应的产物进行树脂纯化，最后对产物利用sequenom MassArray技术进行基因分型。
在初筛阶段、验证阶段1和验证阶段2，扩增包括rs2359536在内的基因组DNA片段的引物为F：ACGTTGGATGTCCATATCACCGTAGAACTC(序列表中SEQ ID No.1)和R：ACGTTGGATGAGTTGCTTGTAAATCTGTGC(SEQ ID No.2)，扩增包括rs10763170在内的基因组DNA片段的引物为F：ACGTTGGATGAGAACACCTCCATTCAGCAC(SEQ ID No.3)和R：ACGTTGGATGGGGAAATAGAGTTATGGGAG(SEQ ID No.4)，扩增包括rs17083838在内的基因组DNA片段的引物为F：ACGTTGGATGCACTTGCCATATCATAGCAC(SEQ ID No.5)和R：ACGTTGGATGCAAGTTCCTTCTTTTAGAGAG(SEQ ID No.6)。单碱基延伸引物根据人基因组中SNP位点上下游(不包括该SNP位点)设计，单碱基延伸引物的最后1位核苷酸对应于人基因组中该SNP位点的前1位核苷酸。rs2359536的单碱基延伸引物的序列是GTAGAACTCAACAGTGAAATA(SEQ ID No.7)；rs10763170的单碱基延伸引物的序列是 gaccATGCAGAAATCTACATTCCAAACC(SEQ ID No.8)；rs17083838的单碱基延伸引物的序列是gttgAGAGAGTTTTCTGTGTCTAC(SEQ ID No.9)。
按照表4配制PCR反应的体系，在ABI9700PCR仪上进行反应，反应条件为：95摄氏度2min(预变性)；95摄氏度30s，56摄氏度30s，45个循环；72摄氏度60s；72摄氏度5min；4摄氏度保存。
表4、PCR反应体系
试剂及其浓度体积(μl)模板DNA(10ng/μl)1引物F(0.5μM)0.5引物R(0.5μM)0.510×Buffer(含Mg²⁺)0.5MgCl₂(25mM)0.4dNTPs(25mM)0.1Hotstar(5U/μl)0.1超纯水1.9总体积5
配制SAP消化反应体系，将2μl的SAP消化反应体系加入上述得到的PCR产物中进行反应。2μl的SAP消化反应体系为：SAP Buffer 0.17μl，SAP Enzyme 0.3μl，超纯水1.53μl。SAP消化反应的程序为：37摄氏度40min；85摄氏度5min；4摄氏度保持。
按照表5配制单碱基延伸反应的体系，将配制好的体系加入上述得到的SAP反应产物中。
表5、单碱基延伸反应体系
试剂及其浓度体积(μl)单碱基延伸引物0.94Gold Buffer0.2Termination mix0.1
Enzyme0.021超纯水0.739总体积2
单碱基延伸反应在ABI9700仪中进行，反应条件为：
94摄氏度30s

72摄氏度3min
4摄氏度保持
2、关联分析
2.1、初筛阶段
在关联分析前，对血液样本和SNP水平进行质量控制：在对病例组和对照组的血液样本的质量控制中，排除样本分型成功率＜97％及偏离遗传定律的血液样本，共34例(均为对照组样本)；排除杂合率高于平均值6个标准差的血液样本，共0例；利用Plink软件排除剩余样本中可能重复或具有亲缘关系的样本，共9例(均为对照组样本)；在对SNP的质量控制中，排除SNP分型成功率＜97％的位点，共8021个；排除等位基因频率低于3％的位点，共121268个；排除Hardy-Weinberg平衡检验中偏离遗传平衡定律的SNP位点(P<1.0×10^-5)，共1667个。最后进行人群的主成分分析(PCA)，检验病例组和对照组的匹配度，去除64个匹配异常的血液样本(病例组5个，对照组59个)。本研究经质量控制后，最终在初筛阶段共包含病例组771例垂体腺瘤患者和对照组2788个正常健康人(如表1所示)，最终纳入统计的位于常染色体上的SNP共有720770个。最后对这共720770个SNPs进行全基因组关联分析。
统计学分析：
通过PLINK来实现系统的质控分析。应用基于PCA方法的EIGENSTRAT软件(图1)，对样本人群进行了结构评估，并且生成了20个主要成分以便对潜在的人群子结构进行矫正。应用对主成分得分进行矫正后的筛查阶段数据，借助PLINK的logistic回归分析，检测了单个SNP与垂体腺瘤之间的关系。之后，通过Haploview生成了全基因组的P值图；通过R软件画出了Q-Q图(图2，lambda值为1.0157)，Q-Q图表明本次研究中各单核苷酸多态性位点所测得值(y轴)与预计值(x轴)的相关分布情况，基 因组波动系数λ为1.0157；而区域图则是应用LocusZoom生成的。发明人通过条件分析检测了单个SNP的独立效果。
2.2、验证阶段
在2个独立的验证阶段中，发明人应用iPLEX平台(Sequenom,San Diego,CA,USA)，从初筛阶段的17个不相关基因组区域中，挑选了22个有代表性的SNP，并对其分型，并最终确认了6个有显著意义的SNP(P<0.05)。
验证阶段的等位基因关联分析也是通过PLINK实现的。通过meta分析中的固定效应模型，将初筛阶段、验证阶段1和验证阶段2的结果整合起来(表7)。同时应用Cochran’s Q检验，评估数据间的异质性。基因填补(genotype imputation)：运用SHAPEIT软件进行基因型区域划分，并在以标签SNP为中心的上下游1Mb范围内，使用IMPUTE2软件整合1000Genomes Project Phase I中的相关单倍体信息，获取更多相关SNP位点(INFO>0.8，MAF>0.03)以进一步分析。
eQTL分析：将本研究的标签SNP位点与Ramasamy建立的脑组织基因表达谱数据(http://www.braineac.org/)进行整合，经多重矫正后以p<0.025为统计学意义标准，进一步定位标签SNP位点相关的与基因表达变异相关的遗传变异位点。
通过初筛阶段、验证阶段1和验证阶段2最终确定了三个与垂体腺瘤相关的SNP位点，这三个SNP位点分别为rs2359536、rs10763170和rs17083838，这三个SNP位点的相关信息均可从UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？hgsid＝418821027_pF1FvZWDySFVNQR E4aOAJLhPenAx)中得到，相关信息见表6。本发明中给出的rs2359536的等位基因为A和G，在UCSC数据库中给出的rs2359536的等位基因为其互补链上的等位基因，即T和C；本发明中给出的rs10763170的等位基因为A和G，在UCSC数据库中给出的rs10763170的等位基因为其互补链上的等位基因，即T和C。
rs2359536的OR值为1.44，P值为2.25×10^-10；rs10763170的OR值为1.28，P值为6.88×10^-10；rs17083838的OR值为1.37，P值为1.89×10^-8。rs2359536、rs10763170和rs17083838的在病例组和对照组的基因型个体数见表8，基因型频率见表9，等位基因频率见表10。
表6、单核苷酸多态性位点基本信息
SNP染色体区带位置(BP)等位基因rs235953610p12.3120899608A/Grs1076317010q21.156777024A/G
rs1708383813q12.1326911112A/G
表7、在垂体腺瘤中3个SNPs在初筛和各阶段验证结果及合并分析结果

表8、三个SNP在病例组和对照组中的基因型个体数

表9、三个SNP在病例组和对照组中的基因型频率

rs2359536的三个基因型中，GG基因型的个体在病例组中的比例高于其在对照组中的比例，AG基因型的个体在病例组中的比例高于其在对照组中的比例，AA基因型的个体在病例组中的比例低于其在对照组中的比例。rs10763170的三个基因型中，AA和AG基因型的个体在病例组中的比例分别高于对应的基因型在对照组中的比例，GG基因型的个体在病例组中的比例低于其在对照组中的比例。rs17083838的三个基因型中，AA和AG基因型的个体在病例组中的比例分别高于对应的基因型在对照组中的比例，GG基因型的个体在病例组中的比例低于其在对照组中的比例。表明，rs2359536、rs10763170和rs17083838均是与垂体腺瘤相关的SNP位点。
表10、三个SNP在病例组和对照组中的等位基因频率

rs2359536的等位基因G在病例组中的比例比该等位基因在对照组中的比例高2.76％，表明rs2359536的风险等位基因为G。rs10763170的等位基因A在病例组中的比例比该等位基因在对照组中的比例高2.94％，表明rs10763170的风险等位基因为A。rs17083838的等位基因A在病例组中的比例比该等位基因在对照组中的比例高1.99％，表明rs17083838的风险等位基因为A。
实验证明，可以利用rs2359536、rs10763170和rs17083838筛查垂体腺瘤患者。