一种药用野生稻大片段染色体DNA提取的方法.pdf

一种药用野生稻染色体DNA提取的方法，属农业生物技术领域。该方法是对现有技术的改进，改进点为：a.选材为药用野生稻嫩叶；b.研磨后重悬的磁力搅拌器设置为300转/分，重悬液用4层神奇滤布过滤，离心1次后重悬沉淀，再用1层神奇滤布过滤，沉淀洗涤次数为1次；重悬液离心力为3800g；c.用熔点为40℃、质量百分比为2％的低熔点琼脂糖与核悬液等体积混合，细胞核包埋于2mL容量的医用注射器中，最终包埋块琼脂糖为质量百分比1％的浓度；d.蛋白酶酶解时蛋白酶K的使用浓度为质量百分比0.1％，酶切条件为：0.6uBamHI，37℃，7min。本发明的有益效果在于：通过分离细胞核，从染色体中提取DNA，建立并优化了从药用野生稻中成功分离1.9Mb大小DNA用于BIBAC文库构建的方法。

1.  一种药用野生稻大片段染色体DNA提取的方法，包括选材与研磨、细胞核的分离与包埋、组蛋白的去除与DNA释放、及DNA的酶解与回收步骤；其特征在于：
a.选材为药用野生稻嫩叶；
b.研磨后重悬的磁力搅拌器设置为300转/分，重悬液用4层神奇滤布过滤，离心1次后重悬沉淀，再用1层神奇滤布过滤，沉淀洗涤次数为1次；重悬液离心力为3800g；
c.用熔点为40℃、质量百分比为2％的低熔点琼脂糖与核悬液等体积混合，细胞核包埋于2mL容量的医用注射器中，最终包埋块琼脂糖为质量百分比1％的浓度；
d.蛋白酶酶解时蛋白酶K的使用浓度为质量百分比0.1％，酶切条件为：0.6u BamHI，37℃，7min。

一种药用野生稻大片段染色体DNA提取的方法
技术领域：
本发明涉及一种药用野生稻染色体DNA提取的方法，属于农业生物技术领域
背景技术：
云南是作物野生近缘种的多样性中心之一，中国的三种野生稻在云南均有分布，是除了海南省以外齐备三种野生稻的省份。但由于云南的立体气候，其野生稻居群的多样性比海南的丰富得多，是非常值得发掘其中的优异基因用于改良栽培稻的。其中的药用野生稻具有生物量积累大，抗白叶枯病，抗稻飞虱，抗旱等一系列优良特性。但由于药用野生稻是CC基因组，与栽培稻的AA基因组差异较大，远缘杂交不亲合，因而需要构建基因组文库建立药用野生稻渗入系库，从中发掘或利用这些优异基因。
大片段基因组文库，如BIBAC文库的构建，在植物基因发掘利用方面有重要用途，它一方面能够以较小的库容保存完整的植物体基因信息，另一方面，由于克隆所携带的目的DNA片段大，在后续的转化实验中，能够实现基因的成簇转化，外源基因在受体中的表达不易产生位置效应和基因沉默现象，避免以往单基因转化带来的弊端。
构建大片段基因组文库，首要解决的就是大片段的DNA提取。以往DNA或基因组提取方法，大多采用CTAB法或SDS法，虽然也能够提取出高纯度的DNA，但是DNA片段大小始终不易突破，通常是几十kb、几百kb，最多到1Mb左右。
本发明提供一种药用野生稻染色体DNA提取的方法，经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种药用野生稻染色体DNA提取的方法。
本发明的药用野生稻大片段染色体DNA提取的方法，是在现在技术基础上 的改进；其改进点在于：
a.选材为药用野生稻嫩叶；
b.研磨后重悬的磁力搅拌器设置为300转/分，重悬液用4层神奇滤布过滤，离心1次后重悬沉淀，再用1层神奇滤布过滤，沉淀洗涤次数为1次；重悬液离心力为3800g；
c.用熔点为40℃、质量百分比为2％的低熔点琼脂糖与核悬液等体积混合，细胞核包埋于2mL容量的医用注射器中，最终包埋块琼脂糖为质量百分比1％的浓度；
d.蛋白酶酶解时蛋白酶K的使用浓度为质量百分比0.1％，酶切条件为：0.6u BamHI，37℃，7min。
本发明通过分离细胞核，从染色体中提取DNA，建立并优化了从药用野生稻中成功分离1.9Mb大小DNA用于BIBAC文库构建的方法。
本发明的药用野生稻染色体DNA提取的方法的具体步骤如下：
1、将所取的药用野生稻嫩叶不经剪断全部浸于液氮中研磨成粉末状，用一大一小两个研钵，将大研钵中上层组织块用摄子挑到小研钵中继续研磨，才能保证材料研磨程度的均一性，并避免过度研磨，整个过程应浸在液氮中进行，防止研磨过程出现反复解冻损伤DNA；
2、将研磨好的组织在液氮刚挥发尽时转入磁力搅拌器上置于冰上预冷到0℃的溶液I中，在300转/分条件下重悬12min，溶液I含10mM Tris碱，10mM EDTA，1mM亚精胺三盐酸盐，1mM亚精氨四盐酸盐，0.5M蔗糖，体积百分比为0.5％Triton X-100，体积百分比为0.15％的巯基乙醇，用4层Calbioche公司的神奇滤布过滤重悬液，滤液在3800g条件下离心20min，沉淀用冰上预冷到0℃的溶液I重悬洗涤，再用1层神奇滤布过滤，滤液在3800g条件下离心20min；
3、收集沉淀于冰上预冷到0℃的溶液II中重悬成核悬液，熔点为40℃的低熔点琼脂糖用溶液II配制成质量百分比为2％的琼脂糖溶液，核悬液与琼脂糖溶液在45℃水浴下等量体积混合，于冰上2mL容量的医用注射器中凝固制成核包埋块，核包埋块切成100μl的圆片，最终包埋块琼脂糖的浓度为质量百分比1％的浓度，溶液II含10mM Tris碱，10mM EDTA，1mM亚精胺三盐酸盐，1mM 亚精氨四盐酸盐，0.5M蔗糖；
4、对包埋块圆片进行蛋白酶酶解及清洗，酶解时包埋块圆片于30mL酶解液中置于恒温摇床上，50℃、70转/分轻摇24h，酶解液含pH9.0、0.5M的EDTA，质量百分比为1％的月桂酰基肌氨酸钠，质量百分比为0.1％蛋白酶K，清洗时，将酶解完成后的包埋块置于冰浴中于摇床上，用60mL的pH8.0、50mM的EDTA清洗1次1h，用60mL的TE清洗1次1h，用60mL含0.1mM PMSF的TE清洗3次3h，用60mL的TE清洗3次每次3h，各清洗液需冰上预冷到0℃；
5、对包埋块圆片进行酶切，选择目的条带进行电洗脱和透析，酶切时将包埋块圆片用酶切缓冲液于冰上预平衡1h，酶切缓冲液为灭菌双蒸水797μL，10×BamHI酶reaction buffer 100μL，1M亚精胺2μL，1M二硫苏糖醇1μL，中途置换1次酶切缓冲液。平衡结束后加入酶切反应液，于冰上保存90min后转入37℃水浴酶解7min，酶切反应液为灭菌双蒸水72.5μL，10×BamHI酶reaction buffer 17μL，1M亚精胺0.34μL，1M二硫苏糖醇0.17μL，10mg/mL BSA 10μL，BamHI 0.6u，酶切结束后加入20μL冰上预冷到0℃、pH8.0的0.5M EDTA于冰上终止反应；
6、对清洗后未经酶切和经过酶切的包埋块圆片进行脉冲电泳检测，脉冲电泳条件为Auto Algorithm Mode:225kb-1.9Mb，6v/cm，120°，linear，16h，其余参数默认，电泳结束后于0.5μg/mL溴化乙锭中染色30min，于凝胶成像系统中检测拍照；
7、从凝胶上选择未经紫外线照射的DNA目标片段区域，切胶放入透析袋，加入冰上预冷到0℃、体积百分比为0.5％的TBE缓冲液，置于脉冲场中电泳，脉冲电泳条件为Two State:6v/cm，120°，35s，35s，linear，5h，其余参数默认，透析袋与电场方向垂直，电泳结束后，将透析袋倒转180°继续电泳1min，回收透析袋中的溶液，放入新的透析袋中，于冰上预冷到0℃的灭菌去离子水中透析，去除DNA溶液中的离子，经透析后的DNA即用于后续的电击转化。
本发明的有益效果在于：通过分离细胞核，从染色体中提取DNA，建立并优化了从药用野生稻中成功分离1.9Mb大小DNA用于BIBAC文库构建的方法。
附图说明：
附图显示药用野生稻染色体DNA经BamHI部分消化后的脉冲电泳结果，分子量标准为酵母染色体PFG Marker。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明作详细说明。本发明的药用野生稻染色体DNA提取的方法的具体步骤如下：
1、从云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所野生稻温室中选取一盆药用野生稻，从中取50g健康、刚抽展出嫩叶，用灭菌蒸馏水漂洗两遍，于液氮中研磨成粉末，转移到500mL冰上预冷到0℃的溶液I(含10mM Tris碱，10mM EDTA，1mM亚精胺三盐酸盐，1mM亚精氨四盐酸盐，0.5M蔗糖，体积百分比为0.5％的Triton X-100，体积百分比为0.15％的巯基乙醇)中，于磁力搅拌器上300转/分轻漩涡重悬10min，重悬液用4层Calbioche公司的神奇滤布过滤，挤压收集滤液。
2、滤液分装于50mL离心管，3800g，4℃离心20min，弃上清，沉淀用40mL冰上预冷到0℃的溶液I重悬，经1层神奇滤布，通过重力过滤，滤液经离心(3800g，4℃，20min)后，再用溶液I重悬洗涤1次，离心(3800g，4℃，15min)后收集沉淀。
3、沉淀重悬于1mL溶液II(含10mM Tris碱，10mM EDTA，1mM亚精胺三盐酸盐，1mM亚精氨四盐酸盐，0.5M蔗糖)制备成核悬液，再用溶液II配制质量百分比为2％的低熔点琼脂糖溶液(低熔点琼脂糖的熔点为40℃)，核悬液和琼脂糖溶液于45℃水浴以1：1的比例混合，于冰上2mL容量的医用注射器中进行混合，凝固制备成琼脂糖质量百分比浓度为1％的核包埋块。
4、依据注射器的刻度，推出核包埋块切成100μL的核包埋块圆片，于30mL蛋白酶酶解液(0.5M EDTA(pH9.0)，1％月桂酰基肌氨酸钠，质量百分比为0.1％蛋白酶K)中，置于恒温摇床上50℃、70转/分轻摇24h，酶解完成后的包埋块圆片在冰浴上于摇床中进行清洗，各清洗液需冰上预冷到0℃：用60mL的50mM EDTA(pH8.0)清洗1次1h，用60mL的TE清洗1次1h，用60mL含0.1mM PMSF的TE清洗3次每次3h，用60mL的TE清洗3次3h。
5、清洗后的核包埋块圆片切成相连接的12片，用酶切缓冲液(灭菌双蒸水 797μL，10×BamHI酶reaction buffer 100μL，1M亚精胺2μL，1M二硫苏糖醇1μL)于冰上预平衡1h，中途置换1次酶切缓冲液。平衡结束后加入酶切反应液(灭菌双蒸水72.5μL，10×BamHI酶reaction buffer 17μL，1M亚精胺0.34μL，1M二硫苏糖醇0.17μL，10mg/mL BSA 10μL，BamHI 0.6u)，于冰上保存90min后转入37℃水浴酶解7min，加入20μL冰上预冷到0℃的0.5M EDTA(pH8.0)于冰上终止反应。
6、经酶切的核包埋块圆片、对照核包埋块圆片和酵母PFG Marker凝胶块贴于制胶梳齿上，倒入用体积百分比为0.5％的TBE缓冲液配制的质量百分比为1％的琼脂糖(PFGE级)凝胶，凝胶冷却后进行脉冲电泳(Auto Algorithm Mode:225kb-1.9Mb，6v/cm，120°，linear，16h，其余参数默认)，脉冲电泳结束后凝胶于0.5μg/mL溴化乙锭中染色30min，于凝胶成像系统中检测拍照。
7、从凝胶上选择DNA目标片段区域(未经紫外线照射)，切胶放入透析袋，透析袋用冰上预冷到0℃的灭菌去离子水清洗数遍，再用冰上预冷到0℃、体积百分比为0.5％的TBE缓冲液冲洗数遍，加入的体积百分比为0.5％的TBE缓冲液，排尽空气，两端用透析袋夹子密封，置于脉冲场中电泳(Two State:6v/cm，120°，35s，35s，linear，5h，其余参数默认)，透析袋与电场方向垂直，电泳结束后，将透析袋倒转180°继续电泳1min，回收透析袋中的溶液，放入新的透析袋中，于2L置于冰上的灭菌去离子水中透析，去除DNA溶液中的离子，收集透析后的DNA用于后续的连接和电击转化。脉冲电泳结果如附图所示。