弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂.pdf

本发明的目的在于提供一种治疗效果更高的弥散性血管内凝血综合征(DIC)治疗剂和/或改善剂，或DIC的治疗方法和/或改善方法。根据本发明，提供一种弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其是以血栓调节蛋白为有效成分的药物，该药物用于施用于血浆中抗凝血酶活性值小于50％的抗凝血酶降低患者。

1.  一种弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其是以血栓调节蛋白为有效成分的药物，该药物用于施用于血浆中的抗凝血酶活性值小于50％的弥散性血管内凝血综合征患者。

2.  如权利要求1所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，所述血栓调节蛋白为可溶性血栓调节蛋白。

3.  如权利要求1或2所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，所述血栓调节蛋白是由转化细胞获得的肽，所述转化细胞是通过将编码序列号9或序列号11中记载的氨基酸序列的DNA转染到宿主细胞中而制备的。

4.  如权利要求1～3任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，所述血栓调节蛋白是具有序列号9或序列号11各自中的第19～516位的序列的肽，或是具有所述肽的氨基酸序列中取代、缺失或添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列且具有血栓调节蛋白活性的肽。

5.  如权利要求1～4任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，弥散性血管内凝血综合征患者是血浆中的抗凝血酶活性值为40％以下的患者。

6.  如权利要求1～5任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其特征在于，其不与抗凝血酶组合给药。

7.  一种药物，其是用于降低患有弥散性血管内凝血综合征的人类患者的死亡可能性的药物，其中，该药物以血栓调节蛋白为有效成分，用于施用于血浆中抗凝血酶活性值小于50％的弥散性血管内凝血综合征患者。

8.  一种选择方法，其是选择应给予血栓调节蛋白的弥散性血管内凝血综合征患者的方法，该方法包括如下步骤：测定弥散性血管内凝血综合征患者的血浆中的抗凝血酶活性值，选择该抗凝血酶活性值小于50％的弥散性血管内凝血综合征患者，判断该患者是应给予血栓调节蛋白的弥散性血管内凝血综合征患者。

9.  一种弥散性血管内凝血综合征的治疗方法和/或改善方法，其包括对血浆中的抗凝血酶活性值小于50％的弥散性血管内凝血综合征患者给予血栓调节蛋白的步骤。

10.  一种弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其是以血栓调节蛋白为有效成分的药物，该药物用于在测定血浆中的抗凝血酶活性值后施用于弥散性血管内凝血综合征患者。

弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂
技术领域
本发明涉及治疗效果更高、以血栓调节蛋白为有效成分的针对弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂。进一步地，本发明涉及选择应给予血栓调节蛋白的弥散性血管内凝血综合征患者的方法。
背景技术
弥散性血管内凝血综合征(以下有时简称为DIC)为凝血疾病的一种，是如下的疾病：由于各种疾病中的组织障碍而流出大量的血管凝固促进物质，凝血系统的功能极度亢进，在全身的血管中产生小的血栓，堵塞小的血管；同时由此使控制出血所必需的血小板或凝血因子被消耗而变得不足，结果引起凝血异常。DIC中，凝血因子在肾脏、肺的微血管中蓄积而产生局部缺血，多引起循环障碍和休克。由此可能出现呼吸急促、呼吸困难、心动过速、心动过缓、四肢寒冷、少尿、痉挛等，某些情况下有可能由于休克而猝死。同时，由于凝血因子和血小板的消耗，产生出血倾向，引起皮肤的紫癜、点状出血、咯血、吐血、血尿、血便或鼻出血等。作为DIC治疗剂，使用肝素、抗凝血酶(有时也称为抗凝血酶III，以下有时简称为AT或ATIII)等。
另一方面，已知血栓调节蛋白是如下的物质，其与凝血酶特异性地结合，具有抑制凝血酶的凝血活性的同时显著促进凝血酶的蛋白C活化能力的作用，已知其具有强大的凝血抑制作用。已知血栓调节蛋白延长通过凝血酶进行凝血的时间，抑制通过凝血酶进行的血小板凝集。蛋白C为在凝血纤溶系统中起到重要作用的维生素K依赖性的蛋白质，其通过凝血酶的作用活化，成为活化型蛋白C。已知该活化型蛋白C使凝血系统因子的活性型第V因子和活性型第VIII因子在生物体内失活，并且活化型蛋白C与具有血栓溶解作用的纤溶酶原激活剂的产生相关(非专利文献1)。因此，血栓调节蛋白促进通过该凝血酶进行的蛋白C的活化，作为抗凝血剂或血栓溶解剂是有用的，还存在有关说明血栓调节蛋白对伴随有凝血亢进的疾病的治疗、预防是有效的动物实验的报告(非专利文献2)。
以往，血栓调节蛋白作为在以人为首的各种动物种的血管内皮细胞上表达的糖蛋白而被发现获得，然后成功进行了克隆。即，使用基因工程的方法，由人肺cDNA库中对含有信号肽的人血栓调节蛋白前体的基因进行克隆，然后对血栓调节蛋白的全部基因序列进行解析，解明了含有信号肽(通常举出18个氨基酸残基)的575个残基的氨基酸序列(专利文献1)。已知信号肽被切断的成熟的血栓调节蛋白从其成熟的肽的N末端一侧起，由N末端区域(第1～226位；认为信号肽为18个氨基酸残基时的位置表示，以下相同)、具有6个EGF样结构的区域(第227～462位)、O型糖链附加区域(第463～498位)、跨膜区域(第499～521位)以及细胞质内区域(第522～557位)这5个区域构成，而且作为具有与全长的血栓调节蛋白相同的活性的部分(即最小活性单元)，为具有6个EGF样结构的区域中的主要由从N末端一侧起第4、5、6个的EGF样结构形成的部分(非专利文献3)。
全长的血栓调节蛋白若不在表面活性剂的存在下则难以溶解，作为制剂必须添加表面活性剂，与此相对，存在一种即使不存在表面活性剂也可以顺利溶解的可溶性血栓调节蛋白。可溶性血栓调节蛋白制备成至少不含有跨膜区域的一部分或全部即可，例如，确认到仅由N末端区域、具有6个EGF样结构的区域和O型糖链附加区域这3个区域(即，由序列号9的第19～516位的氨基酸序列形成的区域)形成的可溶性血栓调节蛋白可以通过应用重组技术来得到，而且该重组可溶性血栓调节蛋白具有天然的血栓调节蛋白的活性(专利文献1)。作为其它的可溶性血栓调节蛋白的例子，有一些报告(专利文献2～9)。此外，作为天然型，举出了来源于人尿的可溶性血栓调节蛋白等(专利文献10、11)。
附带说一下，在基因中，正如很多例子中确认到的那样，通过自然的变异或获得时的变异，在人类中也发现了多样性的变异，目前已经确认到由上述575个残基的氨基酸序列形成的人血栓调节蛋白前体的第473位的氨基酸为Val的序列和为Ala的序列。在编码该氨基酸的碱基序列中，第1418位分别变异为T和C(非专利文献4)。但是，在活性和物性方面完全没有差异，可以判断两者实质上相同。
有报告指出，血栓调节蛋白在DIC的治疗中是有效的(非专利文献5)。作为血栓调节蛋白的用途，除了上述之外，例如，期待用于急性冠状动脉综合征(ACS)、血栓症、末梢血管闭塞症、闭塞性动脉硬化症、脉管炎、心脏手术继发的机能性障碍、脏器移植的并发症、心绞痛、短暂性脑缺血发作、妊娠中毒症、糖尿病、肝VOD(Liver veno-occlusive disease；暴发性肝炎或骨髓移植后的肝静脉闭塞症)、深静脉血栓症(DVT；Deepvenous thrombosis)等、以及败血症或成人呼吸窘迫综合征(ARDS)的疾病的治疗和预防中。
专利文献1：日本特开昭64-6219号公报
专利文献2：日本特开平2-255699号公报
专利文献3：日本特开平3-133380号公报
专利文献4：日本特开平3-259084号公报
专利文献5：日本特开平4-210700号公报
专利文献6：日本特开平5-213998号公报
专利文献7：WO92/00325号公报
专利文献8：WO92/03149号公报
专利文献9：WO93/15755号公报
专利文献10：日本特开平3-86900号公报
专利文献11：日本特开平3-218399号公报
非专利文献1：铃木宏治、医学のあゆみ(医学进展)、第125卷、901页(1983年)
非专利文献2：K.Gomi等、Blood75.1396-1399(1990)
非专利文献3：M.Zushi等、J.Biol.Chem.，246，10351-10353(1989)
非专利文献4：D.Z.Wen等、Biochemistry，26，4350-4357(1987)
非专利文献5：S.M.Bates等、Br.J.of Pharmacol.，144，1017-1028(2005)
发明内容
本发明的课题在于提供治疗效果更高的DIC治疗剂和/或改善剂，或DIC的治疗方法和/或改善方法。本发明的另一课题在于提供选择应给予血栓调节蛋白的弥散性血管内凝血综合征患者的方法。
作为DIC的治疗和/或改善，通常实施利用抗凝血药的抗凝血疗法、或实施浓缩血小板、新鲜冷冻血浆的补充。由于DIC的实际状态为凝血系统的过度活化，因此对其进行抑制的抗凝血疗法被广泛地与针对基础疾病的治疗并行进行。在DIC的治疗和/或改善中，通常大多使用肝素和/或AT制剂。由于认为肝素的抗凝血作用是通过显著促进AT的凝血因子抑制速度来表达的(Maierus PW，Tollefsen DM.《抗凝固薬、血栓溶解薬および抗血小板薬(抗凝血药、溶血栓药和抗血小板药)》In：高折修二、福田英臣、赤池昭纪编，古德曼吉尔曼药理书，第10版，东京，广川书店，2003.p1937-63)，因此对于血浆中AT活性值较高、例如为80％左右的患者使用肝素(冈岛研二著《播種性血管内凝固症候群と多臓器不全(弥散性血管内凝血综合征与多脏器功能衰竭)》，医药Journal社)。此外，对于血浆中的AT活性值为例如70％左右以下的患者，可以举出AT制剂作为代表性的药物(Anthrobin P和Neuart附带说明书：用法及用量)，主要采用通过提高血浆中的AT活性值促进抗凝血作用来实现DIC的治疗和/或改善的方法。此外，此时根据需要也可以并用肝素。
如此地，为了治疗和/或改善DIC，优选进行补充以将DIC患者的血浆中的AT活性值保持在至少70％以上，此外认为提高血浆中的AT活性值在治疗和/或改善DIC方面是常识，在这种情况下，本发明人意外地确认到血栓调节蛋白对于血浆中AT活性值小于50％这样的血浆中AT活性值低的患者反而具有较高的有效性，从而完成本发明。其结果，即使往少里估计，在血浆中AT活性值小于50％这样的活性值低的DIC患者中发现高的效果，这是本领域技术人员不能想到的意外情况。
假设若给予AT制剂，则给予的AT制剂为以珍贵的人血液为原料形成的制剂，此外，不能完全排除由于以人血液为原料而引起的传染病传播的危险(Anthrobin P和Neuart附带说明书：使用注意事项)，因而存在担心，进一步还存在AT作为血液制剂昂贵的问题，但是本发明可以提供解决这些问题的优选的药物或DIC治疗剂和/或改善剂。
即，作为本发明，可以举出以下方案。
[1]一种弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其是以血栓调节蛋白为有效成分的药物，该药物用于施用于血浆中的抗凝血酶活性值小于50％的弥散性血管内凝血综合征患者；
[2]上述[1]所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为可溶性血栓调节蛋白；
[3]上述[1]或[2]所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白是由转化细胞获得的肽，所述转化细胞是通过将编码序列号1、3、5、7、9或序列号11中记载的氨基酸序列的DNA转染到宿主细胞中而制备的；
[3-2]上述[1]或[2]所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白是由转化细胞获得的肽，所述转化细胞是通过将编码序列号1或序列号3中记载的氨基酸序列的DNA转染到宿主细胞中而制备的；
[3-3]上述[1]或[2]所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白是由转化细胞获得的肽，所述转化细胞是通过将编码序列号5或序列号7中记载的氨基酸序列的DNA转染到宿主细胞中而制备的；
[3-4]上述[1]或[2]所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白是由转化细胞获得的肽，所述转化细胞是通过将编码序列号9或序列号11中记载的氨基酸序列的DNA转染到宿主细胞中而制备的；
[4]上述[1]、[2]或[3-2]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号1或序列号3各自中的第19～132位的序列的肽、具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽、或它们的混合物中的任意一种；
[4-2]上述[1]、[2]或[3-2]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号1或序列号3各自中的第19～132位的序列的肽、或具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽；
[4-3]上述[1]、[2]或[3-2]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号1或序列号3各自中的第19～132位的序列的肽；
[4-4]上述[1]、[2]或[3-2]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号1或序列号3各自中的第19～132位或第17～132位的序列的肽、具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽、或它们的混合物中的任意一种；
[4-5]上述[1]、[2]或[3-2]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号1或序列号3各自中的第19～132位或第17～132位的序列的肽、或它们的混合物；
[4-6]上述[1]、[2]或[3-2]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号1中的第19～132位或第17～132位的序列的肽、或它们的混合物；
[4-7]上述[1]、[2]或[3-2]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号3中的第19～132位或第17～132位的序列的肽、或它们的混合物；
[4-8]上述[1]、[2]或[3-2]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为由序列号1中的第19～132位或第17～132位的序列形成的肽、或它们的混合物；
[4-9]上述[1]、[2]或[3-2]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为由序列号3中的第19～132位或第17～132位的序列形成的肽、或它们的混合物；
[5]上述[1]、[2]或[3-3]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号5或序列号7各自中的第19～480位的序列的肽、具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽、或它们的混合物中的任意一种；
[5-2]上述[1]、[2]或[3-3]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号5或序列号7各自中的第19～480位的序列的肽、或具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽；
[5-3]上述[1]、[2]或[3-3]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号5或序列号7各自中的第19～480位的序列的肽；
[5-4]上述[1]、[2]或[3-3]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号5或序列号7各自中的第19～480位或第17～480位的序列的肽、具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽、或它们的混合物中的任意一种；
[5-5]上述[1]、[2]或[3-3]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号5或序列号7各自中的第19～480位或第17～480位的序列的肽、或它们的混合物；
[5-6]上述[1]、[2]或[3-3]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号5中的第19～480位或第17～480位的序列的肽、或它们的混合物；
[5-7]上述[1]、[2]或[3-3]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号7中的第19～480位或第17～480位的序列的肽、或它们的混合物；
[5-8]上述[1]、[2]或[3-3]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为由序列号5中的第19～480位或第17～480位的序列形成的肽、或它们的混合物；
[5-9]上述[1]、[2]或[3-3]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为由序列号7中的第19～480位或第17～480位的序列形成的肽、或它们的混合物；
[6]上述[1]、[2]或[3-4]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号9或序列号11各自中的第19～516位的序列的肽；具有上述肽的氨基酸序列中取代、缺失或添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列且具有血栓调节蛋白活性的肽；或它们的混合物中的任意一种；
[6-2]上述[1]、[2]或[3-4]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号9或序列号11各自中的第19～516位的序列的肽；或具有上述肽的氨基酸序列中取代、缺失或添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列且具有血栓调节蛋白活性的肽；
[6-3]上述[1]、[2]或[3-4]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号9或序列号11各自中的第19～516位的序列的肽；
[6-4]上述[1]、[2]或[3-4]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号9或序列号11各自中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列的肽；具有上述肽的氨基酸序列中取代、缺失或添加了一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列且具有血栓调节蛋白活性的肽；或它们的混合物；
[6-5]上述[1]、[2]或[3-4]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号9或序列号11各自中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列的肽；或它们的混合物；
[6-6]上述[1]、[2]或[3-4]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号9中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列的肽；或它们的混合物；
[6-7]上述[1]、[2]或[3-4]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号11中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列的肽；或它们的混合物；
[6-8]上述[1]、[2]或[3-4]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为由序列号9中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽；或它们的混合物；
[6-9]上述[1]、[2]或[3-4]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为由序列号9中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽；
[6-10]上述[1]、[2]或[3-4]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为由序列号11中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽；或它们的混合物；
[6-11]上述[1]、[2]或[3-4]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，该血栓调节蛋白为由序列号11中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽；
[7]上述[1]～[6-11]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，弥散性血管内凝血综合征患者是血浆中的抗凝血酶活性值为40％以下的患者；
需要说明的是，如上述[1]～[6-11]那样引用的项号通过范围表示，在该范围内配置具有[6-2]等分支号的项时，指的是也引用具有[6-2]等分支号的项。以下也与此相同。
[8]上述[1]～[7]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂为非口服给药剂；
[9]上述[1]～[8]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂为静脉内给药剂；
[10]上述[1]～[9]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其特征在于，每天以0.02～0.08mg/kg的给药量在4小时以内持续静脉滴注；
[11]上述[1]～[10]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其特征在于，其不与抗凝血酶组合给药；
[12]上述[1]～[11]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，弥散性血管内凝血综合征为源于造血系统恶性肿瘤或源于感染症的弥散性血管内凝血综合征；
[12-1]上述[1]～[11]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，弥散性血管内凝血综合征为源于造血系统恶性肿瘤的弥散性血管内凝血综合征；
[12-2]上述[1]～[11]中的任意一项所述的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其中，弥散性血管内凝血综合征为源于感染症的弥散性血管内凝血综合征；
[12-3]一种药物，其是用于降低患有弥散性血管内凝血综合征的人类患者的死亡可能性的药物，其中，该药物以血栓调节蛋白为有效成分，用于施用于血浆中抗凝血酶活性值小于50％的弥散性血管内凝血综合征患者；
[12-4]上述[12-3]所述的药物，其中，血栓调节蛋白为上述[1]～[6-11]中的任意一项所述的肽；
[12-5]上述[12-3]所述的药物，其具有上述[1]～[12-2]中的任意一项所述的特征；
[13]一种选择方法，其是选择应给予血栓调节蛋白的弥散性血管内凝血综合征患者的方法，该方法包括如下步骤：测定弥散性血管内凝血综合征患者的血浆中的抗凝血酶活性值，选择该抗凝血酶活性值小于50％的弥散性血管内凝血综合征患者，判断该患者是应给予血栓调节蛋白的弥散性血管内凝血综合征患者；
[13-2]上述[13]所述的选择应给予血栓调节蛋白的弥散性血管内凝血综合征患者的方法，其中，血栓调节蛋白为上述[1]～[6-11]中的任意一项所述的肽；
[13-3]一种弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其是以血栓调节蛋白为有效成分的药物，该药物用于在测定血浆中的抗凝血酶活性值后施用于弥散性血管内凝血综合征患者；
[13-4]一种弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其是以血栓调节蛋白为有效成分的药物，该药物用于在测定血浆中的抗凝血酶活性值、该抗凝血酶活性值小于50％的情况下施用于弥散性血管内凝血综合征患者；
[14]一种弥散性血管内凝血综合征的治疗方法和/或改善方法，其包括对血浆中的抗凝血酶活性值小于50％的弥散性血管内凝血综合征患者给予血栓调节蛋白的步骤；
[15]上述[14]所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为可溶性血栓调节蛋白；
[16]上述[14]或[15]所述的方法，其中，该血栓调节蛋白是由转化细胞获得的肽，所述转化细胞是通过将编码序列号1、3、5、7、9或序列号11中记载的氨基酸序列的DNA转染到宿主细胞中而制备的；
[16-2]上述[14]或[15]所述的方法，其中，该血栓调节蛋白是由转化细胞获得的肽，所述转化细胞是通过将编码序列号1或序列号3中记载的氨基酸序列的DNA转染到宿主细胞中而制备的；
[16-3]上述[14]或[15]所述的方法，其中，该血栓调节蛋白是由转化细胞获得的肽，所述转化细胞是通过将编码序列号5或序列号7中记载的氨基酸序列的DNA转染到宿主细胞中而制备的；
[16-4]上述[14]或[15]所述的方法，其中，该血栓调节蛋白是由转化细胞获得的肽，所述转化细胞是通过将编码序列号9或序列号11中记载的氨基酸序列的DNA转染到宿主细胞中而制备的；
[17]上述[14]、[15]或[16-2]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号1或序列号3各自中的第19～132位的序列的肽、具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽、或它们的混合物中的任意一种；
[17-2]上述[14]、[15]或[16-2]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号1或序列号3各自中的第19～132位的序列的肽、或具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽；
[17-3]上述[14]、[15]或[16-2]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号1或序列号3各自中的第19～132位的序列的肽；
[17-4]上述[14]、[15]或[16-2]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号1或序列号3各自中的第19～132位或第17～132位的序列的肽、具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽、或它们的混合物中的任意一种；
[17-5]上述[14]、[15]或[16-2]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号1或序列号3各自中的第19～132位或第17～132位的序列的肽、或它们的混合物；
[17-6]上述[14]、[15]或[16-2]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号1中的第19～132位或第17～132位的序列的肽、或它们的混合物；
[17-7]上述[14]、[15]或[16-2]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号3中的第19～132位或第17～132位的序列的肽、或它们的混合物；
[17-8]上述[14]、[15]或[16-2]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为由序列号1中的第19～132位或第17～132位的序列形成的肽、或它们的混合物；
[17-9]上述[14]、[15]或[16-2]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为由序列号3中的第19～132位或第17～132位的序列形成的肽、或它们的混合物；
[18]上述[14]、[15]或[16-3]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号5或序列号7各自中的第19～480位的序列的肽、具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽、或它们的混合物中的任意一种；
[18-2]上述[14]、[15]或[16-3]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号5或序列号7各自中的第19～480位的序列的肽、或具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽；
[18-3]上述[14]、[15]或[16-3]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号5或序列号7各自中的第19～480位的序列的肽；
[18-4]上述[14]、[15]或[16-3]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号5或序列号7各自中的第19～480位或第17～480位的序列的肽、具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽、或它们的混合物中的任意一种；
[18-5]上述[14]、[15]或[16-3]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号5或序列号7各自中的第19～480位或第17～480位的序列的肽、或它们的混合物；
[18-6]上述[14]、[15]或[16-3]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号5中的第19～480位或第17～480位的序列的肽、或它们的混合物；
[18-7]上述[14]、[15]或[16-3]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号7中的第19～480位或第17～480位的序列的肽、或它们的混合物；
[18-8]上述[14]、[15]或[16-3]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为由序列号5中的第19～480位或第17～480位的序列形成的肽、或它们的混合物；
[18-9]上述[14]、[15]或[16-3]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为由序列号5中的第19～480位或第17～480位的序列形成的肽、或它们的混合物；
[19]上述[14]、[15]或[16-4]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号9或序列号11各自中的第19～516位的序列的肽、具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽、或它们的混合物中的任意一种；
[19-2]上述[14]、[15]或[16-4]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号9或序列号11各自中的第19～516位的序列的肽、或具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽；
[19-3]上述[14]、[15]或[16-4]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号9或序列号11各自中的第19～516位的序列的肽；
[19-4]上述[14]、[15]或[16-4]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号9或序列号11各自中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列的肽；具有上述序列的相同变异序列且具有血栓调节蛋白活性的肽；或它们的混合物中的任意一种；
[19-5]上述[14]、[15]或[16-4]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号9或序列号11各自中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列的肽；或它们的混合物；
[19-6]上述[14]、[15]或[16-4]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号9中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列的肽；或它们的混合物；
[19-7]上述[14]、[15]或[16-4]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为具有序列号11中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列的肽；或它们的混合物；
[19-8]上述[14]、[15]或[16-4]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为由序列号9中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽；或它们的混合物；
[19-9]上述[14]、[15]或[16-4]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为由序列号9中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽；
[19-10]上述[14]、[15]或[16-4]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为由序列号11中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽；或它们的混合物；
[19-11]上述[14]、[15]或[16-4]中的任意一项所述的方法，其中，该血栓调节蛋白为由序列号11中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽；
[20]上述[14]～[19-11]中的任意一项所述的方法，其中，对血浆中的抗凝血酶活性值为40％以下的弥散性血管内凝血综合征患者给予血栓调节蛋白；
[21]上述[14]～[20]中的任意一项所述的方法，其中，非口服给予血栓调节蛋白；
[22]上述[14]～[21]中的任意一项所述的方法，其中，静脉内给予血栓调节蛋白；
[23]上述[14]～[22]中的任意一项所述的方法，其中，每天以0.02～0.08mg/kg的给药量在4小时以内持续静脉滴注血栓调节蛋白；
[24]上述[14]～[23]中的任意一项所述的方法，其特征在于，血栓调节蛋白不与抗凝血酶组合给药；
[25]上述[14]～[24]中的任意一项所述的方法，其中，弥散性血管内凝血综合征为源于造血系统恶性肿瘤或源于感染症的弥散性血管内凝血综合征；
[25-1]上述[14]～[24]中的任意一项所述的方法，其中，弥散性血管内凝血综合征为源于造血系统恶性肿瘤的弥散性血管内凝血综合征；
[25-2]上述[14]～[24]中的任意一项所述的方法，其中，弥散性血管内凝血综合征为源于感染症的弥散性血管内凝血综合征；
[26]一种方法，其是用于降低患有弥散性血管内凝血综合征的人类患者的死亡可能性的方法，该方法中，将血栓调节蛋白施用于血浆中抗凝血酶活性值小于50％的弥散性血管内凝血综合征患者；
[26-2]上述[26]所述的方法，其中，血栓调节蛋白为上述[1]～[6-11]中的任意一项所述的肽；
[26-3]一种给药方法，其是上述[26]所述的方法，具有上述[1]～[25-2]中的任意一项所述的特征；
[27]一种弥散性血管内凝血综合征的治疗方法和/或改善方法，其包括在测定血浆中的抗凝血酶活性值后将血栓调节蛋白施用于弥散性血管内凝血综合征患者的步骤；
[27-2]一种弥散性血管内凝血综合征的治疗方法和/或改善方法，其包括如下步骤：测定血浆中的抗凝血酶活性值，该抗凝血酶活性值小于50％时，将血栓调节蛋白施用于弥散性血管内凝血综合征患者。
通过使用本发明的含血栓调节蛋白的制剂，可以(优选在不与AT组合使用的情况下)有效地治疗和/或改善血浆中的AT活性值小于50％的DIC患者的症状。
具体实施方式
以下，对本发明进行具体的说明。
根据本发明，提供一种弥散性血管内凝血综合征(DIC)的治疗剂和/或改善剂，其是以血栓调节蛋白为有效成分的药物，该药物用于施用于血浆中的抗凝血酶活性值小于50％的弥散性血管内凝血综合征患者。
即，本发明的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂为血浆中的抗凝血酶活性值小于50％的弥散性血管内凝血综合征患者的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂。
此外，本发明同样提供用于降低患有弥散性血管内凝血综合征的人类患者的死亡可能性的药物。
作为DIC的治疗和/或改善，可以举出例如“防止由于DIC引起的患者的死亡”作为优选的效果之一，此外也可以举出“防止由于DIC引起的患者的全身状态的恶化”作为优选的效果。
DIC是如下的疾病或综合征：由于各种疾病中的组织障碍而流出大量的血管凝固促进物质，凝血系统的功能极度亢进，在全身的血管中产生小的血栓(形成微小血栓)，堵塞小的血管；同时由此使控制出血所必需的血小板或凝血因子被消耗而变得不足，结果引起止血异常。具体地说，由于形成血管内纤维蛋白，发现由于消耗性凝血纤溶障碍引起出血症状或由于形成微血栓引起脏器衰竭症状。DIC有时被称为弥散性血管内凝血综合征或泛发性血管内凝血综合征。
在以造血系统恶性肿瘤、实体癌等恶性肿瘤为基础的疾病中，由于在肿瘤细胞上表达的组织因子与血液接触，凝血系统过度活化而引起DIC。
此外，有时会在与感染性和非感染性无关地由严重的临床侵袭引起的全身性炎症反应综合征(以下有时简称为SIRS)的延伸中引起DIC。
SIRS是由于与严重的组织伤害或重症感染症相伴的炎症性细胞因子产生亢进所引起的病状，若该反应过度进行，则由于中性粒细胞的活化或血管内皮细胞的活化引起DIC。即，SIRS为DIC的准备阶段(以下有时简称为preDIC)，本发明的DIC治疗剂和/或改善剂在preDIC中也可以有效地使用，本发明中的DIC的治疗剂和/或改善剂中也包括preDIC的治疗和/或改善。
DIC的临床症状根据基础病症的种类不同而不同，作为DIC的诊断方法，除了观察出血症状、脏器症状之外，优选通过如下所述的几个检查值对DIC进行评分，达到某一定以上的评分时诊断为DIC。作为检查值，可以举出例如，血中的血小板数、经纤溶酶分解的纤维蛋白以及纤维蛋白原分解产物(以下有时简称为FDP)浓度、D-二聚物浓度、纤维蛋白原浓度或凝血酶原时间等。此外，也可以不对DIC评分，由血小板降低、D-二聚物或FDP浓度升高等来诊断preDIC(中川雅夫，《播種性血管内凝固(DIC)診断基準の利用に関する調查報告(有关利用弥散性血管内凝血(DIC)诊断标准的调查报告)》厚生省特定疾患血液凝固异常症调查研究班，平成11年度研究报告书，1999：65-72；出口克已《DIC早期治療開始基準に関する試案について(关于有关DIC早期治疗开始标准的试剂)》厚生省特定疾患血液凝固异常症调查研究班，平成11年度研究报告书，1999：73-77；中川克、辻肇，《DIC診断の現状-アンケ—ト調查結果報告(DIC诊断的现状-问卷调查结果报告)》临床血液，1999，40：362-364)。进一步地，也可以通过测定血中的可溶性纤维蛋白浓度或凝血酶-抗凝血酶复合体浓度来诊断preDIC。作为对DIC评分的诊断标准，具体地说，可以举出例如，Overt DIC的诊断标准(Taylor FB et al.，Thromb Haemost2001，86：1327-1330)、急性期DIC诊断标准(Gando S et al.，Clin ApplThromb Hemost 2005，11(1)：71-76)或厚生省的DIC诊断标准(青木延雄、长谷川淳，DIC診断基準の「診断のための補助的検查成、見」の項の改訂について(关于DIC诊断标准的“用于诊断的辅助检查成绩、观察结果”一项的修订)，厚生省特定疾患血液凝固异常症调查研究班，平成4年度研究报告书，1988：p37-41)。
作为DIC的诊断方法，若为上述诊断方法则不特别限定，优选为对DIC评分的诊断方法。此外，从治疗效果、医疗费或患者的QOL(生活质量)方面考虑，有必要对DIC从早期进行治疗时，也存在优选preDIC诊断的其它方式。
作为对DIC评分的诊断方法，除了上述诊断方法之外，也可以为类似的对DIC评分的诊断方法。
本发明的DIC治疗剂和/或改善剂的应用不受DIC种类的限定，但是更优选在源于造血系统恶性肿瘤的DIC或源于感染症的DIC中应用，进一步优选在源于感染症的DIC中应用。作为源于感染症的DIC的具体例子，可以举出源于败血症的DIC作为优选的例子。此外作为优选的其它方式，也可以举出在源于造血系统恶性肿瘤的DIC中的应用。
本发明的治疗剂和/或改善剂有时也可以针对败血症使用。败血症也被定位为由感染性的严重的临床侵袭所引起的SIRS，与以感染症为成因疾病的DIC存在密切的关系。败血症中经常并发DIC，有时也可以对这种并发有DIC的败血症患者使用本发明的药物。即，本发明中，有时可以对患有或怀疑患有DIC或败血症中的任意一种或两种的患者使用。
已知败血症是如下的重度全身性感染症：以感染症、恶性肿瘤、肝硬化、肾功能衰竭、糖尿病、异常分娩等疾病；或留置导管、输液器具、透析、气管切开等针对创伤或疾病进行的治疗为起因，微生物从感染灶不断地或断续地侵入到血液中。若症状恶化，则诱发败血性休克，即由于急剧的血压降低、末梢循环功能衰竭诱发全身性的休克，从而由于肺、肾脏、肝脏、心脏、消化道、以及中枢神经系统等重要脏器的障碍导致死亡。此外，作为伴随败血症的并发症，会诱发DIC，或由于与中性粒细胞的活化和对肺实质的游走累积相伴的肺毛细血管障碍而诱发以肺间质的水肿、出血或急性呼吸功能衰竭为特征的成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，预后变得非常差。
作为败血症的诊断方法存在几种方法。这在Levy M.et al.，Crit.Care.Med.，31：1250-1256中进行了总结。例如包括通过医生进行该诊断的方法或使用检查值等的方法。作为后者的例子，包括如下方法：在1)体温>38℃或<36℃；2)心率>90/分钟；3)呼吸频率>20/分钟或有必要进行人工呼吸；4)白细胞数>12000/mm³或<4000/mm³、或胚细胞>10％；这4项内，满足2项时诊断为SIRS，将被证明为或疑似为以微生物为病因的SIRS诊断为败血症[LaRosa S.，The Cleveland Clinic的主页]。与此近似的方法在Members of the American College of Chest Physicians/Society of CriticalCare Medicine Consensus Conference：Crit Care Med，20，864-874(1992)中有记载。
作为败血症患者的状态，可以举出例如菌血症、败血症(septicemia)、全身性炎症反应综合征(SIRS)、败血症(被证明为或疑似为以微生物为病因的SIRS)、重症败血症、败血症性休克、难治性败血症性休克或多脏器功能障碍(以下有时称为MODS)(哈里逊内科学原著第15版124项P828-833Medical Sciences International)。可以举出上述各状态作为本发明的治疗剂和/或改善剂有效的症状。
作为菌血症，可以举出确认到血液中存在细菌的状态，该细菌的存在是通过血液培养阳性来证明的。
作为败血症(septicemia)，可以举出确认到血液中存在微生物或其它毒素的状态。
作为全身性炎症反应综合征(SIRS)，可以举出如上所述处于DIC准备阶段的状态。
作为重症败血症，可以举出伴随有代谢性酸中毒、急性脑病、少尿、低氧血症或弥散性血管内凝血等脏器功能衰竭或低血压的症状中的一种或两种以上的败血症。
作为败血症性休克，可以举出低血压(血压为90mmHg以下或比通常的血压低40mmHg的血压以下)下对通过补液进行的复苏法无反应、伴随有脏器功能衰竭的败血症性休克。
作为难治性败血症性休克，可以举出败血症性休克持续1小时以上、对补液升压剂无反应的难治性败血症性休克。
作为多脏器功能障碍(MODS)，可以举出存在1个以上脏器的功能衰竭、为了保持内环境稳定需要医学介入的多脏器功能障碍。
本发明的DIC治疗剂和/或改善剂可以有效地用于AT降低患者。AT降低患者指的是血浆中的AT活性值为70％以下、与正常人相比处于AT活性值降低的状态的患者。作为AT降低患者，可以举出先天性AT缺乏患者或后天性AT缺乏患者。先天性AT缺乏患者指的是天生AT活性值低于正常人、为35～75％左右的患者，后天性AT缺乏患者指的是AT活性值后天降低至70％以下的患者。作为AT活性值后天降低的原因，具体地说，可以举出慢性肝功能衰竭等肝病、术后、休克、重症感染症、肾病综合征等肾病、炎症性肠病等消化道疾病、肝素等的药物性降低、由于高龄引起的降低、早产的新生儿、糖尿病、白塞病或营养不良。本发明中对AT降低患者是先天性的还是后天性的不特别限定，只要是AT降低患者即可。对患者的人种不特别限定，但是优选为日本人。
其中，通过本发明的含有血栓调节蛋白作为有效成分的DIC治疗剂和/或改善剂，可以有效地治疗和/或改善血浆中的AT活性值小于50％的患者的DIC的症状。
AT活性被定义为中和凝血酶或活性型X因子的凝血活性的活性，作为通常的例子，AT活性值可以举出以相对于通过由健康成人得到的血浆(以下称为正常血浆)得到的AT活性的相对值来表示。对使用的正常血浆没有特别限定，只要是本领域技术人员通常使用的正常血浆即可，可以使用通过世界卫生组织(WHO)的生物学标准化专家委员会(ExpertCommittee on Biological Standardization(以下有时简称为ECBS))确立、英国国家生物学标准和管制所(National Institute for Biological Standards andControl(以下有时简称为NIBSC))管理、分配的正常血浆的国际标准品(NIBSC制)。也可以举出使用用NIBSC的国际标准品校正了AT活性的市售的标准血浆(可以举出例如，国际血栓与止血协会的科学和标准化委员会(Scientific and Standardization Committee(以下有时简称为SSC)、International Society on Thrombosis and Haemostasis(以下有时简称为ISTH)的标准血浆)作为优选的例子。进一步地，也可以使用在通常的AT活性值测定试剂盒中添附的正常血浆或AT活性值测定试剂盒指定的正常血浆。作为在通常的AT活性值测定试剂盒中添附的正常血浆或AT活性值测定试剂盒指定的正常血浆，可以举出正常血浆剂“第一”(第一化学药品)作为优选的例子。使用正常血浆测定的血浆样品的AT活性值有时优选换算为以NIBSC的国际标准品的正常血浆为基准的AT活性值。更优选换算为以正常血浆剂“第一”(第一化学药品)为基准的AT活性值来求得AT活性值。
作为正常血浆优选使用NIBSC的国际标准品。此外，也存在优选使用用NIBSC的国际标准品校正了AT活性的市售的标准血浆的其它方式。作为正常血浆的更优选的方式，可以举出正常血浆剂“第一”(第一化学药品)。例如，血浆中的AT活性值为50％的情况指的是AT活性相对于上述正常血浆的比例为50％。
为了有效地治疗和/或改善DIC的症状，对DIC患者的血浆中的AT活性值没有特别限定，只要小于50％即可，上限优选为48％以下、更优选为46％以下、进一步优选为44％以下、特别优选为42％以下、最优选为40％以下，对下限没有特别限定，只要为上述测定方法的检出限以上即可，可以举出0.1％以上、优选为10％以上、更优选为15％以上、进一步优选为20％以上、特别优选为25％以上，从实施例中的试验例1的患者组的AT活性值考虑，最优选为30％以上。
此外，根据本发明，提供一种弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂，其是以血栓调节蛋白为有效成分的药物，该药物用于在测定血浆中的抗凝血酶活性值后施用于弥散性血管内凝血综合征患者。对本发明的治疗剂和/或改善剂没有特别限定，只要是在测定血浆中的抗凝血酶活性值后施用于弥散性血管内凝血综合征患者的药物即可，但是优选是用于在测定的抗凝血酶活性值小于50％时施用于弥散性血管内凝血综合征患者的弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂。如此地在测定血浆中的抗凝血酶活性值后将血栓调节蛋白施用于弥散性血管内凝血综合征患者，在充分发挥药效的方面是优选的。
此外，本发明的DIC治疗剂和/或改善剂也可以对伴随有由于慢性肝功能衰竭等肝病、术后、休克、重度感染症等引起的AT降低的患者应用。
已知本发明中的血栓调节蛋白具有(1)与凝血酶选择性地结合、(2)促进基于凝血酶的蛋白C的活化的作用。优选通常还确认到(3)延长基于凝血酶的凝血时间的作用、和/或(4)抑制基于凝血酶的血小板凝集的作用。有时将这些血栓调节蛋白具有的作用称为血栓调节蛋白活性。
作为血栓调节蛋白活性，优选具有上述(1)和(2)的作用，进一步优选具有上述(1)～(4)的全部作用。
对于促进基于凝血酶的蛋白C的活化的作用，例如可以通过以日本特开昭64-6219号公报为代表的各种公知文献中明确记载的试验方法来容易地确认促进蛋白C的活化的作用的活性量或其有无。此外，对于延长基于凝血酶的凝血时间的作用和/或抑制基于凝血酶的血小板凝集的作用也同样可以容易地确认。
对本发明中的血栓调节蛋白没有特别限定，只要具有血栓调节蛋白活性即可，优选为可溶性血栓调节蛋白。作为可溶性血栓调节蛋白的溶解性的优选例子，可以举出对于水、例如注射用蒸馏水(在不存在曲拉通X-100或聚桂醇等表面活性剂的情况下，通常在中性附近)为1mg/mL以上、或为10mg/mL以上，优选为15mg/mL以上、或为17mg/mL以上，进一步优选为20mg/mL以上、25mg/mL以上、或30mg/mL以上，特别优选为60mg/mL以上，在某些情况下可以分别举出80mg/mL以上、或100mg/mL以上。判断可溶性血栓调节蛋白是否得以溶解时，溶解后，在例如白色光源的正下方、约1000勒克司亮度的位置肉眼观察，将此时澄清、不含有能够清楚确认到的不溶性物质理解为明显的指标。此外，也可以过滤确认有无残渣。
作为本发明中的血栓调节蛋白，优选包含在人类的血栓调节蛋白中作为血栓调节蛋白活性的中心部位已知的序列号1的第19～132位的氨基酸序列，只要包含序列号1的第19～132位的氨基酸序列，则不特别限定。该序列号1的第19～132位的氨基酸序列只要具有促进基于凝血酶的蛋白C的活化的作用、即血栓调节蛋白活性，则也可以发生自然或人工的变异，即可以在序列号1的第19～132位的氨基酸序列中取代、缺失、添加有一个或两个以上的氨基酸。对容许的变异程度没有特别限定，只要具有血栓调节蛋白活性即可，例如作为氨基酸序列，可以举出50％以上的相同性、优选为70％以上的相同性、更优选为80％以上的相同性、进一步优选为90％以上的相同性、特别优选为95％以上的相同性、最优选为98％以上的相同性。将这种氨基酸序列称为相同变异序列。对于这种变异，如下所述，可以使用通常的基因操作技术容易地获得。
序列号3的序列为序列号1的序列的第125位的氨基酸Val变异为Ala后的序列，作为本发明中的血栓调节蛋白，也优选包含序列号3的第19～132位的氨基酸序列。
如此地，对本发明中的血栓调节蛋白没有特别限定，只要包含序列号1或序列号3的第19～132位的序列、或至少具有上述序列的相同变异序列且至少具有血栓调节蛋白活性的肽序列即可，作为优选例，可以举出由序列号1或序列号3各自中的第19～132位或第17～132位的序列形成的肽，或由上述序列的相同变异序列形成的至少具有血栓调节蛋白活性的肽，更优选由序列号1或序列号3的第19～132位的序列形成的肽。此外，也存在更优选由序列号1或序列号3各自中的第19～132位或第17～132位的相同变异序列形成的至少具有血栓调节蛋白活性的肽的其它方式。
此外，作为本发明中的血栓调节蛋白的其它方式，优选包含序列号5的第19～480位的氨基酸序列，只要包含序列号5的第19～480位的氨基酸序列则不特别限定。该序列号5的第19～480位的氨基酸序列也可以为其相同变异序列，只要具有促进基于凝血酶的蛋白C的活化的作用、即血栓调节蛋白活性即可。
序列号7的序列为序列号5的序列的第473位的氨基酸Val变异为Ala后的序列，作为本发明中的血栓调节蛋白，也优选包含序列号7的第19～480位的氨基酸序列。
如此地，对本发明中的血栓调节蛋白没有特别限定，只要包含序列号5或序列号7的第19～480位的序列、或至少具有上述序列的相同变异序列且至少具有血栓调节蛋白活性的肽序列即可，作为优选例，可以举出由序列号5或序列号7各自中的第19～480位或第17～480位的序列形成的肽，或由上述序列的相同变异序列形成的至少具有血栓调节蛋白活性的肽，更优选由序列号5或序列号7的第19～480位的序列形成的肽。此外，也存在更优选由序列号5或序列号7各自中的第19～480位或第17～480位的相同变异序列形成的至少具有血栓调节蛋白活性的肽的其它方式。
此外，作为本发明中的血栓调节蛋白的其它方式，优选包含序列号9的第19～515位的氨基酸序列，只要包含序列号9的第19～515位的氨基酸序列则不特别限定。该序列号9的第19～515位的氨基酸序列也可以为其相同变异序列，只要具有促进基于凝血酶的蛋白C的活化的作用、即血栓调节蛋白活性即可。
序列号11的序列为序列号9的序列的第473位的氨基酸Val变异为Ala后的序列，作为本发明中的血栓调节蛋白，也优选包含序列号11的第19～515位的氨基酸序列。
如此地，对本发明中的血栓调节蛋白没有特别限定，只要包含序列号9或序列号11的第19～515位的序列、或至少具有上述序列的相同变异序列且至少具有血栓调节蛋白活性的肽序列即可，作为优选例，可以举出由序列号9或序列号11各自中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽，或由上述序列的相同变异序列形成的至少具有血栓调节蛋白活性的肽，特别优选由序列号9中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽。还可以举出它们的混合物作为优选的例子。此外，也存在特别优选由序列号11中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽的其它方式。还可以举出它们的混合物作为优选的例子。进一步地，还可以举出由上述序列的相同变异序列形成的至少具有血栓调节蛋白活性的肽作为优选的例子。
如上所述，具有相同变异序列的肽指的是成为对象的肽的氨基酸序列中可以取代、缺失、添加有一个以上(一个或两个以上、进一步优选多个(例如1～20个、优选为1～10个、更优选为1～5个、特别优选为1～3个))氨基酸的肽。对容许的变异程度没有特别限定，只要具有血栓调节蛋白活性即可，例如作为氨基酸序列，可以举出50％以上的相同性、优选为70％以上的相同性、更优选为80％以上的相同性、进一步优选为90％以上的相同性、特别优选为95％以上的相同性、最优选为98％以上的相同性。
进一步地，作为本发明的血栓调节蛋白，还可以举出日本特开昭64-6219中的由序列号14的序列(462个氨基酸残基)形成的肽、由序列号8的序列(272个氨基酸残基)形成的肽、或由序列号6的序列(236个氨基酸残基)形成的肽作为优选的例子。
对本发明中的血栓调节蛋白没有特别限定，只要是至少具有序列号1或序列号3的第19～132位的氨基酸序列的肽即可，其中优选至少具有序列号5或序列号7的第19～480位的氨基酸序列的肽，更优选至少具有序列号9或序列号11的第19～515位的氨基酸序列的肽。作为至少具有序列号9或序列号11的第19～515位的氨基酸序列的肽，可以举出由序列号9或序列号11各自中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽作为更优选的例子。此外，还可以举出由序列号9或序列号11各自中的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽的针对序列号9或序列号1l各自的混合物作为更优选的例子。
上述混合物的情况中，作为由序列号9或序列号11各自中的从第17位开始的肽与从第19位开始的肽的混合比例，可以举出(30:70)～(50:50)、优选为(35:65)～(45:55)。
此外，作为序列号9或序列号11各自中的到第515位结束的肽与到第516位结束的肽的混合比例，可以举出(70:30)～(90:10)、优选为(75:25)～(85:15)。
这些肽的混合比例可以通常方法求得。
需要说明的是，序列号1的第19～132位的序列相当于序列号9的第367～480位的序列，序列号5的第19～480位的序列相当于序列号9的第19～480位的序列。
此外，序列号3的第19～132位的序列相当于序列号11的第367～480位的序列，序列号7的第19～480位的序列相当于序列号11的第19～480位的序列。
进一步地，序列号1、3、5、7、9和11各自中的第1～18位的序列全部为相同的序列。
如后述那样，这些本发明的血栓调节蛋白可以从通过载体将编码这些序列号1、3、5、7、9或11等肽的DNA(具体地说，分别为序列号2、序列号4、序列号6、序列号8、序列号10或序列号12等碱基序列)转染到宿主细胞中所制备的转化细胞来获得。
进一步地，这些肽若具有上述氨基酸序列即可，可以附加有糖链或不附加糖链，对该点不特别限定。此外，在基因操作中，根据使用的宿主细胞的不同种类，糖链的种类、附加位置或附加的程度不同，可以任意使用。对于糖链的结合位置和种类，已知日本特开平11-341990中记载的内容，对于本发明中的血栓调节蛋白也可以在相同的位置上附加相同的糖链。如后述那样，并不限于通过基因操作来获得，但在通过基因操作来获得时，作为可以在表达时使用的信号序列，可以利用编码上述序列号9的第1～18位的氨基酸序列的碱基序列、编码序列号9的第1～16位的氨基酸序列的碱基序列、其它公知的信号序列(例如人组织型纤溶酶原激活剂的信号序列(国际公开88/9811号公报、日本特开平11-341990))。
将编码血栓调节蛋白的DNA序列导入到宿主细胞中时，优选将编码血栓调节蛋白的DNA序列引入载体(特别优选可以在动物细胞中表达的表达载体)中来导入的方法。表达载体指的是由启动子序列、对mRNA赋予核糖体结合部位的序列、用于编码欲表达的蛋白的DNA序列、剪接信号、转录结束的终止子序列、复制起始序列等构成的DNA分子，作为优选的动物细胞表达载体的例子，可以举出R.C.Mulligan等人[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78.2072(1981)]报告的pSV2-X、或P.M.Howleys等人[Methods in Emzymology，101，387，Academic Press(1983)]报告的pBP69T(69-6)等。
作为可以在制备这些肽时使用的宿主细胞，可以举出中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS-1细胞、COS-7细胞、VERO(ATCC CCL-81)细胞、BHK细胞、源于狗肾的MDCK细胞、仓鼠AV-12-664细胞等，此外作为人源细胞，可以举出HeLa细胞、W138细胞、人293细胞。通常非常优选CHO细胞，在CHO细胞中，进一步优选DHFR-CHO细胞。
此外，在基因操作的过程或肽的制备过程中，也较多地使用大肠杆菌等微生物，优选使用适合各自的宿主-载体系统，在上述的宿主细胞中也可以选择适当的载体系统。在基因重组技术中使用的血栓调节蛋白的基因已经过克隆，而且利用基因重组技术的血栓调节蛋白的制造例已得到公开，另外还已知用于得到纯化品的纯化方法[日本特开昭64-6219号公报、日本特开平2-255699号公报、日本特开平5-213998号公报、日本特开平5-310787号公报、日本特开平7-155176号公报、J.Biol.Chem.，264：10351-10353(1989)]。因此，本发明中使用的血栓调节蛋白可以通过使用上述报告中记载的方法或依照其中记载的方法来制备。例如，在日本特开昭64-6219号公报中，公开了含有包含用于编码全长的血栓调节蛋白的DNA的质粒pSV2TMJ2的Escherichia coli K-12strain DH5(ATCC保藏编号67283号)。此外，还可以使用将该菌株在生命研(现独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心)再保藏的菌株(Escherichia coliDH5/pSV2TMJ2)(FERM BP-5570)。可以以该用于编码全长的血栓调节蛋白的DNA作为原料，通过公知的基因操作技术，来制备本发明的血栓调节蛋白。
本发明中使用的血栓调节蛋白用现有公知的方法或依照现有公知的方法来制备即可，例如可以参考上述山本等人的方法[日本特开昭64-6219号公报]或日本特开平5-213998号公报。即，通过基因操作技术将人源的血栓调节蛋白基因制成例如编码序列号9的氨基酸序列的DNA后，也可以进一步根据需要进行改变。作为该改变，例如为了制成编码序列号11的氨基酸序列的DNA(具体地说是序列号12的碱基序列)，对编码序列号9的氨基酸序列的第473位的氨基酸的密码子(特别是第1418的碱基)利用Method in Enzymology，100：468(1983年)，Academic Press中记载的方法进行位点特异性变异。例如，可以使用具有序列号13所示的碱基序列的变异用合成DNA形成将序列号10的第1418位的碱基T转化为碱基C的DNA。
可以将如此制备的DNA导入例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，制成转化细胞，进行适当选择，利用公知的方法由培养该细胞得到的培养液制备纯化的血栓调节蛋白。如上所述，优选将编码序列号9的氨基酸序列的DNA(序列号10)转染到上述宿主细胞中。本发明中使用的血栓调节蛋白的生产方法不限于上述方法，例如也可以从尿、血液或其它体液等中萃取纯化，或从生产血栓调节蛋白的组织或这些组织培养液等中萃取纯化，或根据需要进一步通过蛋白分解酶进行切断处理。
通过上述细胞培养方法制备本发明中的血栓调节蛋白时，有时通过蛋白质的翻译后修饰，会发现N末端氨基酸具有多样性。例如，有时序列号9中的第17位、18位、19位或22位的氨基酸会形成N末端。此外，例如像第22位的谷氨酸转换为焦谷氨酸那样，有时N末端氨基酸会被修饰。优选第17位或19位的氨基酸形成N末端，更优选第19位的氨基酸形成N末端。此外，还存在优选第17位的氨基酸形成N末端的其它方式。上述修饰或多样性等对于序列号11也可以举出同样的例子。
进一步地，使用具有序列号10的碱基序列的DNA制备血栓调节蛋白时，有时会发现C末端氨基酸的多样性，有时会制备出少1个氨基酸残基的肽。即，如第515位的氨基酸形成C末端，并且该第515位被酰胺化的情况那样，有时C末端氨基酸会被修饰。因此，有可能制备N末端氨基酸和C末端氨基酸富有多样性的肽或它们的混合物。优选第515位的氨基酸形成C末端。此外，还存在优选第516位的氨基酸形成C末端的其它方式。以上的修饰或多样性等对于具有序列号12的碱基序列的DNA也是相同的。
通过上述方法得到的血栓调节蛋白有可能是N末端和C末端表现多样性的肽的混合物。具体地说，可以举出由序列号9的第19～516位、第19～515位、第17～516位或第17～515位的序列形成的肽的混合物。
接着，对于从通过上述获得的培养上清液或培养物中分离纯化血栓调节蛋白的方法，可以根据公知的方法[堀尾武一编集、蛋白质-酶的基础实验法]进行。例如，优选使用固定有具有与血栓调节蛋白相反电荷的官能团的色谱载体、和利用血栓调节蛋白间的相互作用的离子交换色谱或吸附色谱。此外，还可以举出利用与血栓调节蛋白的特异性亲和性的亲和色谱作为优选的例子。作为吸附体的优选例子，可以举出利用血栓调节蛋白的配体即凝血酶或血栓调节蛋白的抗体的例子。作为该抗体，可以利用具有适当的性质或识别适当的表位的血栓调节蛋白的抗体，可以举出例如日本特公平5-42920号公报、日本特开昭64-45398号公报、日本特开平6-205692号公报等中记载的例子。此外，可以举出利用血栓调节蛋白的分子量大小的凝胶过滤色谱或超滤。而且，还可以举出固定有疏水性基团的色谱载体、和利用与血栓调节蛋白所具有的疏水性部位间的疏水键合的疏水性色谱。此外，作为吸附色谱还可以使用羟磷灰石作为载体，可以举出例如日本特开平9-110900号公报中记载的例子。这些方法可以适当组合。纯化的程度可以根据使用目的等选择，优选纯化至例如电泳(优选SDS-PAGE)的结果得到单一带，或分离出的纯化品的凝胶过滤HPLC或反相HPLC的结果形成单一的峰。当然，使用两种以上血栓调节蛋白时，优选实质上仅形成血栓调节蛋白的带，不要求形成单一的带。
若具体地举出本发明中的纯化法，可以举出以血栓调节蛋白活性为指标进行纯化的方法，例如可以举出如下方法：通过离子交换柱的Q-琼脂糖Fast Flow对培养上清液或培养物进行粗纯化，回收具有血栓调节蛋白活性的馏分，接着利用亲和色谱柱的DIP-凝血酶-琼脂糖(diisopropylphosphorylthrombin agarose)色谱柱进行主纯化，回收血栓调节蛋白活性强的馏分，浓缩回收馏分，经过凝胶过滤以纯品的形式获得血栓调节蛋白活性馏分[Gomi K.et al.，Blood，75：1396-1399(1990)]。对于作为指标的血栓调节蛋白活性，可以举出例如基于凝血酶的蛋白C活化的促进活性。此外，如下举出优选的纯化法。
选择与血栓调节蛋白具有良好的吸附条件的适当的离子交换树脂，进行离子交换色谱纯化。特别优选的例子是，使用经含有0.18M NaCl的0.02M Tris盐酸缓冲液(pH7.4)平衡过的Q-琼脂糖Fast Flow的方法。适当洗涤后，例如可以用含0.3M NaCl的0.02M Tris盐酸缓冲液(pH7.4)洗脱，得到粗纯化品的血栓调节蛋白。
接着，例如可以将与血栓调节蛋白具有特异性亲和性的物质固定在树脂上进行亲和色谱纯化。作为优选的例子，可以举出DIP-凝血酶-琼脂糖色谱柱的例子，和抗血栓调节蛋白单克隆抗体色谱柱的例子。DIP-凝血酶-琼脂糖色谱柱预先用例如含有100mM NaCl和0.5mM氯化钙的20mM Tris盐酸缓冲液(pH7.4)平衡，填充上述粗纯化品，进行适当的洗涤，用例如含有1.0M NaCl和0.5mM氯化钙的20mM Tris盐酸缓冲液(pH7.4)洗脱，从而可以获得纯化品的血栓调节蛋白。此外，在抗血栓调节蛋白单克隆抗体色谱柱中，可以举出如下方法：使溶解有抗血栓调节蛋白单克隆抗体的含0.5M NaCl的0.1M NaHCO₃缓冲液(pH8.3)与预先通过CNBr活化的琼脂糖4FF(GE Healthcare Bio-Sciences公司)接触，预先用例如含0.3M NaCl的20M磷酸盐缓冲液(pH7.3)平衡填充有琼脂糖4FF与抗血栓调节蛋白单克隆抗体偶联的树脂的色谱柱，适当洗涤后，用例如含0.3M NaCl的100mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.0)洗脱。洗脱液用适当的缓冲液中和，也可以获得纯化品。
接着将得到的纯化品调整至pH3.5后，填充到用含0.3M NaCl的100mM甘氨酸盐酸缓冲液(pH3.5)平衡过的阳离子交换体(优选强阳离子交换体SP-琼脂糖FF(GE Healthcare Bio-Sciences公司))中，用同一缓冲液洗涤得到非吸附馏分。得到的馏分用适当的缓冲液中和，可以获得高纯度纯化品。它们优选通过超滤进行浓缩。
进一步地，优选通过凝胶过滤进行缓冲液交换。例如，可以向用含50mM NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH7.3)平衡过的Sephacryl S-300色谱柱或S-200色谱柱中填充通过超滤浓缩的高纯度纯化品，用含50mM NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH7.3)展开分离，确认基于凝血酶的蛋白C的活化的促进活性，回收活性馏分，从而获得经缓冲液交换的高纯度纯化品。如此得到的高纯度纯化品为了提高安全性优选使用适当的病毒除去膜、例如Planova 15N(旭化成医疗株式会社)进行过滤，然后可以通过超滤浓缩至目的浓度。优选最后通过无菌过滤膜进行过滤。
如此得到的血栓调节蛋白可以通过通常的方法制成冷冻干燥制剂。即，可以举出如下方法：将含有血栓调节蛋白以及根据需要添加的添加剂的溶液冷冻，在减压下升华水，由此进行干燥。
在本发明中，血浆中的AT活性值可以为源自动脉的血浆中的AT活性值或源自静脉的血浆中的AT活性值，优选为源自静脉的血浆中的AT活性值。此外，也有优选源自动脉的血浆中的AT活性值的情况。通常指的是源自静脉的血浆中的AT活性值。对AT活性值的测定方法不特别限定，例如可以通过由活性型第十因子残留量求得AT活性值的显色性合成基质法测定AT活性值。
具体地说，将血液样品采集到加有柠檬酸钠的采血管中，迅速地进行离心分离，回收血浆。接着向该血浆中添加肝素形成AT-肝素复合体，进一步地，向该AT-肝素复合体中添加恒定过量的活性型第十因子。活性型第十因子根据样品中的AT-肝素复合体量形成AT-肝素-活性型第十因子复合体，从而失活。该复合体形成反应后，加入基质液，进行反应，对游离的对硝基苯胺进行比色定量，由此可以测定残留的活性型第十因子活性。由于该残留的活性型第十因子活性反映样品中的AT活性，可以通过另外制成的标准曲线求得AT活性值。对硝基苯胺的比色定量可以使用自动分析装置BM1650(日本电子株式会社制)。此外，标准曲线可以通过使用标准物质来制成。
本发明的含有血栓调节蛋白作为有效成分的DIC治疗剂和/或改善剂的1天的给药量根据患者的年龄、体重、疾病的程度、给药途径等不同而不同，通常以血栓调节蛋白的量计，上限优选为5mg/kg以下、更优选为2mg/kg以下、进一步优选为1mg/kg以下、特别优选为0.8mg/kg以下，下限优选为0.005mg/kg以上、更优选为0.01mg/kg以上、进一步优选为0.02mg/kg以上、特别优选为0.05mg/kg以上。
每1天给药1次或根据需要给药几次。对于给药间隔，可以每天给药，也可以2天～14天给药1次、更优选3天～10天给药1次、进一步优选4天～7天给药1次。
特别是在静脉内给药中，优选每1天给药1次，但是不限于此。此外，在皮下给药中，优选每1天给药1次或1周给药1次，可以根据给药量来调整给药间隔。
作为本发明的含有血栓调节蛋白作为有效成分的DIC治疗剂和/或改善剂的给药方法，可以通过通常使用的给药方法、即非口服给药方法(例如，静脉内给药、肌肉内给药或皮下给药等)给药。从能够通过长期维持血药浓度来延长给药间隔的方面考虑，特别优选肌肉内给药或皮下给药。此外，还存在优选静脉内给药的其它方式。此外，还可以为口服给药、直肠内给药、鼻内给药、舌下给药等。
静脉内给药时，可以举出一次性给予所需的量的方法或滴注静脉内给药。
从给药时间短的方面考虑，优选一次性给予所需的量的方法。一次性给药时，用注射器给药通常需要时间，给药所需的时间根据给药的液体量不同而不同，但是通常为2分钟以下、更优选为1分钟以下、进一步优选为30秒以下。此外，对下限不特别限定，优选为1秒以上、更优选为5秒以上、进一步优选为10秒以上。对给药量不特别限定，只要是上述优选的给药量即可。
从容易将血栓调节蛋白的血药浓度保持恒定的方面考虑，优选滴注静脉内给药，只要是上述优选的给药量则不特别限定，作为每1天给药量的上限，优选为1mg/kg以下、更优选为0.5mg/kg以下、进一步优选为0.1mg/kg以下、特别优选为0.08mg/kg以下、最优选为0.06mg/kg以下，作为下限，优选为0.005mg/kg以上、更优选为0.01mg/kg以上、进一步优选为0.02mg/kg以上、特别优选为0.04mg/kg以上。
对于滴注静脉内给药时的给药时间来说，作为上限优选为4小时以下、更优选为3小时以下、进一步优选为2小时以下、特别优选为1小时以下、最优选为30分钟以下，作为下限优选为10分钟以上、更优选为15分钟以上、进一步优选为20分钟以上。
制成为冷冻干燥制剂时，使用时可以利用水、例如蒸馏水(或注射用水)、生理盐水等溶解后施用于患者。
此外，制备液体制剂时，可以通过将有效量的血栓调节蛋白与可以用于药物的载体混合来制备。即，为了治疗上述疾病，可以将有效量的血栓调节蛋白与公知的适当量的载体混合，制备出适于有效地施用于患者的制剂。例如，可以加入蔗糖、甘油、甲基纤维素、羧甲基纤维素等增稠剂；各种无机盐的pH调节剂等作为添加剂来制备。
[序列表的说明]
序列号1：用于TME456的生产的基因所编码的氨基酸序列
序列号2：编码序列号1的氨基酸序列的碱基序列
序列号3：用于TME456M的生产的基因所编码的氨基酸序列
序列号4：编码序列号3的氨基酸序列的碱基序列
序列号5：用于TMD12的生产的基因所编码的氨基酸序列
序列号6：编码序列号5的氨基酸序列的碱基序列
序列号7：用于TMD12M的生产的基因所编码的氨基酸序列
序列号8：编码序列号7的氨基酸序列的碱基序列
序列号9：用于TMD123的生产的基因所编码的氨基酸序列
序列号10：编码序列号9的氨基酸序列的碱基序列
序列号11：用于TMD123M的生产的基因所编码的氨基酸序列
序列号12：编码序列号11的氨基酸序列的碱基序列
序列号13：进行位点特异性变异时使用的变异用合成DNA
实施例
以下，举出实施例和试验例对本发明进行具体的说明，但是本发明不受这些例子的任何限定。
试验例中使用的本发明的血栓调节蛋白是根据上述山本等人的方法(日本特开昭64-6219号中记载的方法)制备的。以下对该制造例进行说明。
[制造例1]
<血栓调节蛋白的获得>
通过上述方法获得血栓调节蛋白，即，将编码序列号9的氨基酸序列的DNA(具体地说，是序列号10的碱基序列)转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，用上述常规方法的纯化法从该转化细胞的培养液中获得以含50mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲液(pH7.3)回收了活性馏分的高纯度纯化品。进一步进行超滤，获得浓度为11.2mg/mL的血栓调节蛋白(以下有时简称为TMD123)溶液。
<添加剂溶液制备>
在10L的不锈钢制容器中量取加入480g盐酸精氨酸(味之素社制)，加入5L注射用水进行溶解。添加1M氢氧化钠溶液，将pH调整为7.3。
<药液制备-填充>
将上述添加剂溶液全量加入到20L的不锈钢制容器中，加入2398mL上述得到的TMD 123溶液(以可溶性血栓调节蛋白的蛋白质量计相当于26.88g，其中过量加入12％)，进行混合搅拌。进一步加入注射用水至总量为12L，均一地混合搅拌。该药液用孔径为0.22μm的过滤器(Millipore制MCGL10S)过滤灭菌。将滤液填充进小瓶(Vial)，每瓶1mL，以橡胶塞半压塞。
<冷冻干燥>
以冷冻干燥→填充氮气→橡胶塞全压塞→旋紧盖的顺序在下述条件下进行冷冻干燥工序，得到在1个容器中含有2mg可溶性血栓调节蛋白、40mg盐酸精氨酸的含TMD123制剂。
<冷冻干燥条件>
预冷却(用15分钟从室温到15℃)→正式冷却(用2小时从15℃到-45℃)→保持(-45℃2小时)→真空开始(-45℃18小时)→升温(用20小时从-45℃到25℃)→保持(25℃15小时)→升温(用1小时从25℃到45℃)→保持(45℃5小时)→室温(用2小时从45℃到25℃)→复压氮气填充(至-100mgHg)→全压塞→旋紧盖
[制造例2]
将编码序列号11的氨基酸序列的DNA(具体地说，是序列号12的碱基序列)转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，用上述常规方法的纯化法从该转化细胞的培养液中获得经纯化的血栓调节蛋白(以下有时简称为TMD123M)溶液，通过与上述相同的方法获得TMD123M的冷冻干燥制剂。
[制造例3]
将编码序列号1的氨基酸序列的DNA(具体地说，是序列号2的碱基序列)转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，用上述常规方法的纯化法从该转化细胞的培养液中获得经纯化的血栓调节蛋白(以下有时简称为TME456)，通过与上述相同的方法获得TME456的冷冻干燥制剂。
[制造例4]
将编码序列号3的氨基酸序列的DNA(具体地说，是序列号4的碱基序列)转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，用上述常规方法的纯化法从该转化细胞的培养液中获得经纯化的血栓调节蛋白(以下有时简称为TME456M)，通过与上述相同的方法获得TME456M的冷冻干燥制剂。
[制造例5]
将编码序列号5的氨基酸序列的DNA(具体地说，是序列号6的碱基序列)转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，用上述常规方法的纯化法从该转化细胞的培养液中获得经纯化的血栓调节蛋白(以下有时简称为TMD12)，通过与上述相同的方法获得TMD12的冷冻干燥制剂。
[制造例6]
将编码序列号7的氨基酸序列的DNA(具体地说，是序列号8的碱基序列)转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，用上述常规方法的纯化法从该转化细胞的培养液中获得经纯化的血栓调节蛋白(以下有时简称为TMD12M)，通过与上述相同的方法获得TMD12M的冷冻干燥制剂。
[试验例1]
对于如下所示的基于厚生省的DIC诊断标准诊断为DIC的由于造血系统恶性肿瘤或感染症而诱发症状的DIC患者，给予通过下述方法制备的本发明的DIC治疗剂和/或改善剂，调查开始给药后第28天的患者的存活率。
需要说明的是，本发明的DIC治疗剂和/或改善剂的给药期间中不并用AT制剂。
<制备例1>
向根据制造例1得到的TMD123的冷冻干燥制剂中加入生理盐水，制备0.5mg/ml的待检液。
<AT活性值的测定>
将本发明的DIC治疗剂和/或改善剂的开始给药日给药前的对象患者的血液样品4.5ml采集到加有0.5ml 3.8％柠檬酸钠的采血管中，颠倒混合、离心后，回收血浆，冷冻保存。接着向该血浆中添加肝素，形成AT-肝素复合体，进一步地，向该AT-肝素复合体中添加过量的因子Xa。该复合体形成反应后，加入基质液(Test-team S ATIII(CHROMOGENIX公司制))，进行反应，对游离的对硝基苯胺在410nm下测定吸光度，进行比色定量，由此测定残留的因子Xa活性(Test-team S ATIII附带说明书)。由于该残留的因子Xa活性反映样品中的AT活性，使用另外制成的标准曲线求得AT活性值。对硝基苯胺的比色定量使用自动分析装置BM1650(日本电子株式会社制)。此外，作为用于求得AT活性值的正常血浆，使用正常血浆剂“第一”(第一化学药品)。
<给药量和给药方法>
对于DIC对象患者，以0.12ml/kg(相当于0.06mg/kg)的比例采集制备例中制备的待检液，加入到生理盐水中，制成100ml。该生理盐水溶液每天1次用30分钟静脉滴注。此操作重复6天。
<结果>
通过上述给药方法给予待检液，调查开始给药后第28天的死亡，AT活性值为50％以上且小于70％的患者组的存活率为64.3％，并且AT活性值为70％以上的患者组的存活率为80％。另一方面，对于AT活性值小于50％的患者组的存活率来说，死亡例仅1例，存活率为92.3％，对于上述2组表现出优势的存活率。其结果如表1所示。
此外，其中AT活性值为40％以下的患者(5例)中，存活率为100％。
[表1]

[试验例2]
通过对雄性Sprague-Dawley大鼠(体重180～240g)向尾静脉内给予兔抗大鼠AT抗体(20mg/kg)，使大鼠血浆中AT活性值降低至小于60％。给予抗体1小时后，在戊巴比妥麻醉下，用1小时持续向大鼠尾静脉内给予组织因子(源自兔子的促凝血酶原激酶；90mg/kg)。将0.1～10mg/kg的本发明中的各种制造例的血栓调节蛋白在即将给予组织因子之前急速给予到相反侧的尾静脉内。在组织因子给予完毕后由腹部主动脉采血，通过测定血小板数、纤维蛋白原或AT活性值，调查DIC的治疗效果和/或改善效果，可以确认本发明的效果。
工业实用性
通过使用本发明的含有血栓调节蛋白的制剂，能够在优选不与AT组合使用的条件下有效地治疗和/或改善血浆中的AT活性值小于50％的DIC患者的症状。
序列表
<110>旭化成制药株式会社
<120>弥散性血管内凝血综合征的治疗剂和/或改善剂
<130>F107098-WO
<160>13
<210>1
<211>132
<212>PRT
<213>人
<400>1

<210>2
<211>396
<212>DNA
<213>人
<400>2

<210>3
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<400>3

<210>4
<211>396
<212>DNA
<213>人
<400>4

<210>5
<211>480
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<213>人
<400>5


<210>6
<211>1440
<212>DNA
<213>人
<400>6

<210>7
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<212>DNA
<213>人
<400>8


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<400>9


<210>10
<211>1548
<212>DNA
<213>人
<400>10

<210>11
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<212>PRT
<213>人
<400>11


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<211>1548
<212>DNA
<213>人
<400>12


<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成DNA
<400>13