调节炎性介质的方法及用于该方法的肽.pdf

本发明包括调节细胞分泌过程的方法。更具体地，本发明涉及通过抑制与炎性细胞内囊泡或者颗粒释放炎性介质有关的机制，调节或者减少炎性细胞释放炎性介质。在这方面，本发明公开了一种胞内信号转导机制，说明了几种新的用于疾病的药理学介入的胞内靶标，所述疾病涉及炎性细胞内囊泡的炎性介质分泌。MANS肽和其活性片段可用于这种方法。

1.  抑制至少一种炎性细胞的至少一种炎性介质的胞吐释放的方法，包括：将至少一种炎性细胞与有效量的选自MANS肽和其活性片段的至少一种肽接触，所述细胞包括至少一种包含在细胞内囊泡中的炎性介质，与在不存在所述至少一种肽的条件下相同类型炎性细胞的所述炎性介质释放相比，所述方法将减少自所述炎性细胞的所述炎性介质释放。

2.  权利要求1所述的方法，其中所述肽是包括SEQ ID NO：1的MANS肽。

3.  权利要求1所述的方法，其中所述活性片段包括至少一种包含至少6个氨基酸的肉豆蔻酰化SEQ ID NO：1N端片段，所述至少一种包含至少6个氨基酸的肉豆蔻酰化SEQ ID NO：1N端片段的第一个氨基酸起始于SEQID NO：1的N端甘氨酸。

4.  权利要求3所述的方法，其中所述活性片段选自以下片段组成的组：N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV(SEQ ID NO：20)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA(SEQ ID NO：3)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA(SEQ ID NO：4)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE(SEQ ID NO：5)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPG(SEQ ID NO：6)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERP(SEQ ID NO：7)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAER(SEQ ID NO：8)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAE(SEQ ID NO：9)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAA(SEQ ID NO：10)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAA(SEQ ID NO：11)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEA(SEQ ID NO：12)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGE(SEQ ID NO：13)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKG(SEQ ID NO：14)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAK(SEQID NO：15)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAA(SEQ ID NO：16)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTA(SEQ ID NO：17)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKT(SEQ ID NO：18)；和N-肉豆蔻酰-GAQFSK(SEQ ID NO：19)。

5.  权利要求1所述的方法，其中所述炎性细胞是白细胞。

6.  权利要求1所述的方法，其中所述炎性细胞是粒细胞。

7.  权利要求1所述的方法，其中所述炎性细胞选自中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和其组合组成的组。

8.  权利要求1所述的方法，其中所述炎性细胞是单核细胞或者巨噬细胞。

9.  权利要求1所述的方法，其中所述炎性介质选自以下物质组成的组：髓过氧化物酶(MPO)，嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)，主要碱性蛋白[MBP]，溶菌酶，粒酶，组胺，蛋白多糖，蛋白酶，趋化因子，细胞因子，花生四烯酸的代谢物，防卫素，杀菌性通透性-增加蛋白(BPI)，弹性蛋白酶，组织蛋白酶G，组织蛋白酶B，组织蛋白酶D，beta-D-葡糖醛酸糖苷酶，alpha-甘露糖苷酶，磷脂酶A₂，软骨素-4-硫酸酯，蛋白酶3，乳铁蛋白，胶原酶，补体活化剂，补体受体，N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受体，层粘连蛋白受体，细胞色素b₅₅₈，单核细胞-趋化因子，组胺酶，维生素B12结合蛋白，明胶酶，纤溶酶原激活物，beta-D-葡糖醛酸糖苷酶，及其组合。

10.  权利要求1所述的方法，其中所述炎性介质选自髓过氧化物酶(MPO)，嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)，主要碱性蛋白(MBP)，溶菌酶，粒酶及其组合组成的组。

11.  权利要求1所述的方法，其中所述有效量的所述肽包括脱颗粒抑制量的MANS肽或者其活性片段，与在不存在MANS肽或者其活性片段的条件下至少一种炎性细胞释放的量相比，所述脱颗粒抑制量的MANS肽或者其活性片段使得所述至少一种炎性细胞释放的炎性介质的量减少大约1％到大约99％。

12.  权利要求1所述的方法，其中所述有效量的所述肽包括脱颗粒抑制量的MANS肽或者其活性片段，与在不存在MANS肽或者其活性片段的条件下至少一种炎性细胞释放的量相比，所述脱颗粒抑制量的MANS肽或者其活性片段使得所述至少一种炎性细胞释放的炎性介质的量减少大约5—50％到大约99％。

13.  抑制对象的组织和/或体液中至少一种炎性细胞的至少一种炎性介质释放的方法，包括：
给药所述对象的组织和/或体液治疗有效量的药物组合物，其中所述组织和/或所述体液包括含有至少一种炎性介质的至少一种炎性细胞，所述炎性介质包含在该细胞的囊泡内，所述药物组合物包括治疗有效量的选自MANS肽和其活性片段的至少一种肽，与在不存在所述至少一种肽的条件下至少一种相同类型炎性细胞的所述炎性介质释放相比，所述的方法将减少自所述至少一种炎性细胞的所述炎性介质释放。

14.  权利要求13所述的方法，其中所述减少炎性介质的释放包括阻断或者抑制使得所述炎性细胞释放炎性介质的机制。

15.  权利要求13所述的方法，其中所述肽是包括SEQ ID NO：1的MANS肽。

16.  权利要求13所述的方法，其中所述活性片段包括至少一种包含至少6个氨基酸的肉豆蔻酰化SEQ ID NO：1N端片段，所述至少一种包含至少6个氨基酸的肉豆蔻酰化SEQ ID NO：1N端片段的第一个氨基酸起始于SEQ ID NO：1的N端甘氨酸。

17.  权利要求16所述的方法，其中所述活性片段选自以下片段组成的组：N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV(SEQ ID NO：20)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA(SEQ ID NO：3)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA(SEQ ID NO：4)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE(SEQ ID NO：5)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPG(SEQ ID NO：6)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERP(SEQ ID NO：7)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAER(SEQ ID NO：8)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAE(SEQ ID NO：9)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAA(SEQ ID NO：10)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAA(SEQ ID NO：11)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEA(SEQ ID NO：12)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGE(SEQ ID NO：13)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKG(SEQ ID NO：14)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAK(SEQID NO：15)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAA(SEQ ID NO：16)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTA(SEQ ID NO：17)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKT(SEQ ID NO：18)；和N-肉豆蔻酰-GAQFSK(SEQ ID NO：19)。

18.  权利要求13所述的方法，其中所述炎性细胞是白细胞。

19.  权利要求13所述的方法，其中所述炎性细胞是粒细胞。

20.  权利要求13所述的方法，其中所述炎性细胞选自中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和其组合组成的组。

21.  权利要求13所述的方法，其中所述炎性细胞是单核细胞或者巨噬细胞。

22.  权利要求13所述的方法，其中所述炎性介质选自以下物质组成的组：髓过氧化物酶(MPO)，嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)，主要碱性蛋白[MBP]，溶菌酶，粒酶，组胺，蛋白多糖，蛋白酶，趋化因子，细胞因子，花生四烯酸的代谢物，防卫素，杀菌性通透性-增加蛋白(BPI)，弹性蛋白酶，组织蛋白酶G，组织蛋白酶B，组织蛋白酶D，beta-D-葡糖醛酸糖苷酶，alpha-甘露糖苷酶，磷脂酶A2，软骨素-4-硫酸酯，蛋白酶3，乳铁蛋白，胶原酶，补体活化剂，补体受体，N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受体，层粘连蛋白受体，细胞色素b₅₅₈，单核细胞-趋化因子，组胺酶，维生素B12结合蛋白，明胶酶，纤溶酶原激活物，beta-D-葡糖醛酸糖苷酶，及其组合。

23.  权利要求13所述的方法，其中所述炎性介质选自髓过氧化物酶(MPO)，嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)，主要碱性蛋白(MBP)，溶菌酶，粒酶及其组合组成的组。

24.  权利要求13所述的方法，其中所述有效量的所述肽包括脱颗粒抑制量的MANS肽或者其活性片段，与在不存在MANS肽或者其活性片段的条件下至少一种炎性细胞释放的量相比，所述脱颗粒抑制量的MANS肽或者其活性片段使得至少一种炎性细胞释放的炎性介质的量减少大约1％到大约99％。

25.  权利要求13所述的方法，其中所述有效量的所述肽包括脱颗粒抑制量的MANS肽或者其活性片段，与不存在MANS肽或者其活性片段的条件下至少一种炎性细胞释放的量相比，所述脱颗粒抑制量的MANS肽或者其活性片段使得至少一种炎性细胞释放的炎性介质的量减少大约5—50％到大约99％。

26.  权利要求13所述的方法，其中所述对象患有呼吸系统疾病。

27.  权利要求26所述的方法，其中所述呼吸系统疾病选自哮喘、慢性支气管炎和COPD组成的组。

28.  权利要求13所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。

29.  权利要求28所述的方法，其中所述哺乳动物选自人、犬、马和猫组成的组。

30.  权利要求13所述的方法，其中所述给药选自局部给药、经肠胃外给药、经直肠给药、经肺部给药、经鼻给药和口服给药组成的组。

31.  权利要求30所述的方法，其中所述肺部给药选自气雾剂给药、干粉吸入器给药、定量吸入器给药和喷雾器给药组成的组。

32.  权利要求13所述的方法，还包括给药所述对象选自抗生素、抗病毒化合物、抗寄生虫化合物、抗炎化合物和免疫抑制剂的第二分子组成的组。

33.  权利要求13所述的方法，其中所述对象患有选自肠疾病、皮肤病、自身免疫病、疼痛综合症及其组合组成的组的疾病。

34.  权利要求33所述的方法，其中所述肠疾病选自溃疡性结肠炎、克罗恩氏病和肠易激综合征组成的组。

35.  权利要求33所述的方法，其中所述皮肤病选自红斑痤疮、湿疹、银屑病和重度痤疮组成的组。

36.  权利要求13所述的方法，其中所述对象患有关节炎或者囊性纤维化。

调节炎性介质的方法及用于该方法的肽
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求享有2006年3月6日提交的美国专利申请11/367,449的优先权，后一申请是2004年3月17日提交的美国专利申请10/802,644的部分延续申请，后一申请是2002年6月26日提交、现已放弃的美国专利申请10/180,753的继续申请，后一申请要求享有2001年6月26日提交的美国临时申请60/300,933的优先权，上述申请公开的内容在此完整引入作为参考。
联邦政府支持的声明
[0002]本发明是在美国联邦政府的资助下完成的，国立卫生研究院项目号R01 HL36982。美国政府对本发明享有一定权利。
发明领域
[0003]本发明涉及调节细胞分泌过程的方法。更具体地，本发明涉及调节炎性介质的释放。本发明还涉及调节炎性细胞中膜结合的囊泡或者颗粒分泌炎性介质的胞内信号机制。
发明背景
[0004]在人类和非人类动物中，粘液的分泌过多导致大量气道炎性疾病的发病。以下情形中经常可以见到增加的粘液分泌：慢性疾病，例如哮喘，慢性梗阻性肺病(COPD)和慢性支气管炎；遗传性疾病例如囊性纤维化；变应性疾病(特应性，变态反应性炎症)；支气管扩张症；和许多急性、传染性呼吸道疾病例如肺炎，鼻炎，流感或者普通感冒。
[0005]在这些呼吸性疾病中伴随粘液分泌过多的是气道中炎性细胞的持久存在。这些细胞对这类疾病的病理学作用很大，其通过这些细胞释放的炎性介质造成组织损伤。该慢性炎症造成的这类损伤的一个实例存在于囊性纤维化患者，其中中性粒细胞释放的介质(例如，髓过氧化物酶)诱导气道上皮组织的脱落。
[0006]粘液的分泌不足(under-secretion)也具有不良影响。气道粘液作为物理屏障可以抗吸入的生物学活性颗粒，并且可以预防气道的细菌定殖和灭活白细胞释放的细胞毒性产物。King等，Respir.Physiol.62：47-59(1985)；Vishwanath和Ramphal，Infect.Immun.45：197(1984)；Cross等，Lancet1：1328(1984)。在眼部，粘液维持泪膜，对眼睛健康和舒适非常重要。胃肠道的粘液分泌还具有细胞保护功能。粘液作为化学、生物学和机械屏障的作用说明，粘膜分泌异常低的粘液是有害的。
[0007]哺乳动物气道布满由气道上皮(杯状)细胞和粘膜下腺产生和分泌的粘液薄层。在气道疾病例如哮喘、慢性支气管炎和囊性纤维化中，粘液的分泌过多是共同症状。过量的粘液可能导致阻塞和对传染的易感性。粘液的主要成分是由分泌细胞合成并保存在胞质粒中的粘蛋白。粘蛋白是由呼吸道、胃肠道和雌性生殖道中包括的上皮细胞分泌的糖蛋白家族。粘蛋白造成粘液的粘弹性质，已知至少8种粘蛋白基因。Thornton，等，J.Biol.Chem.272，9561-9566(1997)。由粘蛋白分泌过多和/或粘液细胞增生造成的粘液纤毛损伤导致气道粘液填塞，这将加速慢性感染、气流阻塞，有时甚至是死亡。许多气道疾病，例如慢性支气管炎，慢性阻塞性肺病，支气管扩张，哮喘，囊性纤维化和细菌感染的特征在于粘蛋白的过度产生。E.Prescott，等，Eur.Respir.J.，8：1333-1338(1995)；K.C.Kim，等，Eur.Respir.J.，10：1438(1997)；D.Steiger，等Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，12：307-314(1995)。在合适的刺激下，粘蛋白颗粒通过胞吐过程释放，其中颗粒转移到细胞外周，在那里所述颗粒的膜与质膜融合，允许内容物的腔分泌。
[0008]尽管该过程具有明显的病理生理重要性，但只是最近才阐明了连接细胞表面刺激与粘蛋白颗粒释放的胞内信号机制。参见，Li等，Journal ofBiological Chemistry，276：40982-40990(2001)。众所周知多种试剂和炎性/体液介质引起粘蛋白的分泌。这些包括胆碱能激动剂，脂介质，氧化剂，细胞因子，神经肽，ATP和UTP，细菌产物，中性粒细胞弹性蛋白酶，和吸入污染物。参见，Adler等，Res.Immunol.149，245-248(1998).有趣的是，这些粘蛋白促分泌剂中的许多已知还能够活化数种蛋白激酶，利用来自不同种属的气道上皮细胞来检测粘蛋白过量分泌调节的研究一直涉及在分泌过程中使用蛋白激酶C(PKC)或者cGMP-依赖的蛋白激酶(PKG)。参见，例如，Ko等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.16，194-198(1997)；Abdullah等，Am.J.Physiol.273，L201-L210(1997)；Abdullah等，Biochem.J.316，943-954(1996)；Larivee等Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.11，199-205(1994)；和Fischer等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.20，413-422(1999)。只是最近才证明这两种蛋白激酶在调节粘蛋白分泌中的协调相互作用或者“交互作用(cross-talk)”涉及MARCKS蛋白。参见，Li等，Journal of Biological Chemistry，276：40982-40990(2001)。但是，还没有完全阐明这些蛋白激酶协同作用下游的信号转导事件，这最终导致粘蛋白颗粒的胞吐释放。
[0009]MARCKS，一种大约82KD的蛋白，具有3个进化-保守区(Aderem等，Nature 1988；332：362-364；Thelen等，Nature 1991；351：320-322；Hartwig等，Nature 1992；356：618-622；Seykora等，J Biol Chem 1996；271：18797-18802)：N-端，磷酸化位点结构域(PSD)和多重同源2(MH2)结构域。所述N-端(24氨基酸序列，具有与末端甘氨酸残基连接的肉豆蔻酸部分)涉及MARCKS与膜的结合(Seykora等，J Biol Chem 1996；271：18797-18802)，并可能涉及MARCKS与钙调蛋白的结合(Matsubara等，J Biol Chem 2003；278：48898-48902)。该24氨基酸序列被称为MANS肽。在细胞中MANS肽和其活性片段能够与天然的MARCKS竞争膜结合。MARCKS蛋白在浸润白细胞的颗粒释放炎性介质过程中的参与和所有组织和器官中疾病的炎症有关，包括特征为气道炎症的肺疾病，例如哮喘、COPD和囊性纤维化。但是，气道中炎症和粘液分泌是两个分离并且独立的过程(Li等，J Biol Chem 2001；276：40982-40990；Singer等，Nat Med 2004；10：193-196)。尽管许多因子包括炎性细胞释放的介质都能引起粘液产生和分泌，但是在过量粘液和炎症之间还没有已知的直接联系。
发明概述
[00010]本发明涉及24氨基酸、肉豆蔻酰化多肽(亦称为MANS肽)的新用途。本发明还涉及一种阻断任意细胞分泌过程的新方法，尤其涉及炎性细胞的炎性介质释放，所述炎性细胞的刺激途径涉及蛋白激酶C(PKC)底物MARCKS蛋白和胞内囊泡或者颗粒的内容物释放。
[00011]本发明涉及抑制至少一种炎性细胞的至少一种炎性介质的胞吐释放，包括：将至少一种炎性细胞(该细胞包括至少一种包含在细胞内囊泡中的炎性介质)与有效量的选自MANS肽和其活性片段的至少一种肽接触，与在不存在所述至少一种肽的条件下相同类型炎性细胞的炎性介质释放相比，所述方法将减少所述炎性细胞的炎性介质释放。
[00012]本发明还涉及在对象的组织和/或体液中抑制至少一种炎性细胞的至少一种炎性介质的释放，包括给药所述对象的组织和/或体液治疗有效量的药物组合物，其中所述组织和/或所述体液包括含有至少一种炎性介质的至少一种炎性细胞，所述炎性介质包含在细胞的囊泡内，所述药物组合物包括治疗有效量的选自MANS肽和其活性片段的至少一种肽，与在不存在所述至少一种肽的条件下至少一种相同类型炎性细胞的所述炎性介质释放相比，这将减少所述至少一种炎性细胞的所述炎性介质释放。
[00013]更特别地，本发明包括一种减轻对象炎症的方法，包括给药治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括MANS肽[即，N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV(SEQ ID NO：20)]或者其活性片段。所述活性片段的长度为至少6个氨基酸。当在本文中使用时，MARCKS蛋白的“活性片段”是影响(抑制或者增强)MARCKS蛋白-介导的释放的片段。活性片段可以选自：N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA(SEQID NO：3)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA(SEQ ID NO：4)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE(SEQ ID NO：5)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPG(SEQ ID NO：6)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERP(SEQ ID NO：7)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAER(SEQ ID NO：8)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAE(SEQ ID NO：9)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAA(SEQ ID NO：10)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAA(SEQ ID NO：11)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEA(SEQ ID NO：12)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGE(SEQ ID NO：13)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKG(SEQ ID NO：14)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAK(SEQID NO：15)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAA(SEQ ID NO：16)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTA(SEQ ID NO：17)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKT(SEQ ID NO：18)；和N-肉豆蔻酰-GAQFSK(SEQ ID NO：19)。这些肽中疏水性N端肉豆蔻酸酯部分的存在能够增强它们与质膜的相容性，并有可能增强它们对质膜的渗透性，从而有可能使所述肽被细胞摄取。肉豆蔻酸酯在双分子层的疏水性插入能够使脂的分配系数或者表观吸附常数达104M-1或者大约8kcal/mol的单(unitary)Gibbs自由结合能(参见，例如，Peitzsch，R.M.，和McLaughlin，S.1993，Binding of acylated peptides and fatty acids tophospholipid vesicles：pertinence to myristoylated proteins.Biochemistry.32：10436-10443)，这足以，至少部分允许MANS肽和本文描述的肉豆蔻酰化MANS肽片段进入细胞质膜，而其他官能团以及它们在MANS肽(其被肉豆蔻酰化)和肉豆蔻酰化MANS肽片段内的相互作用能够增强它们的相对膜渗透性。所述片段均能显示代表其各自结构的分配系数和膜亲和力。所述片段可以通过本领域已知的肽合成方法制备，例如通过固相肽合成进行(参见，例如，Chan，Weng C.和White描述的方法，Peter D.Eds.，Fmoc Solid PhasePeptide Synthesis：A Practical Approach，Oxford University Press，New York，New York(2000)；和Lloyd-Williams，P.等，Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins(1997))并利用本领域已知的纯化，例如通过高压液相层析进行。各种肽的分子量均可以通过质谱法确定，每个均显示适当分子量的峰值。利用本文公开的实施例中描述的步骤，无需过度实验就可以轻易地确定本文方法中个体肽和个体肽组合(例如，2种肽的组合，3种肽的组合，4种肽的组合)的功效。优选的组合将包括两种肽；肽的优选摩尔比例可以从50:50到99.99:0.01，该比例利用本文公开的实施例中描述的步骤可以轻易地确定。
[00014]优选的MANS肽或者其活性片段被包含在用于阻断炎症的药物组合物中。本发明还包括在对象中调节细胞分泌过程的方法，包括给药治疗有效量的包含MANS肽或者其活性片段的化合物，其调节对象的炎性介质。所述给药通常选自局部给药，经肠胃外给药，经直肠给药，经肺部给药、经吸入给药和经鼻给药或者口服给药，其中经肺部给药通常包括种气雾剂给药，干粉吸入器给药，干粉吸入器给药，定量吸入器给药或者喷雾器给药。
[00015]将组合物(包括脱颗粒抑制量的MANS肽或者脱颗粒抑制量的其活性片段，例如MANS肽或者其活性片段的药物组合物)用于人或者动物至少将MANS肽或者其活性片段提供给组织内或者组织上的位点或者与组织表面接触的体液-包含层或者粘液-包含层(在那里存在炎性粒细胞或者炎性粒细胞将侵入那里)，从而使MANS肽或者其活性片段能够接触炎性粒细胞。一方面，在炎症的最初发病或者最初检出，或者人或者动物最初感觉到炎症，或者在人或者动物的炎症水平最初出现可感知的变化时，可以给药这类组合物，以减少炎症的量，所述炎症将在不存在MANS肽或者其活性片段的条件下发生。另一方面，可以在人或者动物组织的炎症进行期间进行给药，以减少其他炎症的量，所述其他炎症将在不存在MANS肽或者其活性片段的条件下发生。尽管给药的剂量和频率可以通过临床评估来确定，并且随炎症的疾病或者来源和组织涉及的程度以及患者的年龄和体重而发生变化，但是可以预料在3到8小时之后可以重复药物组合物的给药，优选的在药物组合物的第一次给药后6到8小时进行。
[00016]本发明还包括减轻对象炎症的方法，包括给药治疗有效量的抑制与MARCKS相关的炎性介质释放的化合物，由此对象中至少一种炎性介质的释放相对于没有所述治疗时发生的炎性介质释放减少。本文使用的“减少”通常表示炎症作用的减轻。优选的，炎性介质被所述公开的方法抑制或者阻断。
[00017]本发明的另一个实施方式包括减轻对象炎症的方法，包括给药治疗有效量的抑制与MARCKS相关的炎性介质释放的化合物，由此对象的炎症相对于没有所述治疗时发生的炎症减轻。本发明还公开了减轻或者抑制对象炎症的方法，包括给药治疗有效量的的MANS肽或者其活性片段以有效调节炎症部位的炎性介质。术语“抑制”表示炎性介质分泌量的减少。术语“完全抑制”表示炎性介质的分泌量减少到零。此外，如上所述，所述活性片段的长度为至少6个氨基酸。术语“胞吐过程”表示胞吐作用，即，细胞分泌或者排泄的过程，其中位于细胞内的囊泡包含的物质通过囊泡液胞膜与外细胞膜的融合从细胞释放。“脱颗粒”表示细胞颗粒内容物的释放。术语“脱颗粒抑制”表示炎性细胞颗粒内包含的炎性介质释放的减少。因此，脱颗粒抑制量的MANS肽和/或其活性片段是足以使颗粒内包含的炎性介质的释放相对于没有相同肽时的释放减少的这些肽的量。
[00018]MANS肽和其活性片段可用于预防或者减少动物组织中炎性介质造成的炎症的量。MANS肽和其活性片段可用于预防或者减少动物中炎性介质产生或者造成的组织损伤的量。

附图简述
[00019]图1A-1D是条线图，说明NHBE细胞的粘蛋白分泌过多通过PKC和PKG的活化达到最大。
[00020]图2A-2B证明MARCKS蛋白是粘蛋白分泌途径的关键组分。
[00021]图3A-3C显示凝胶图，说明针对MARCKS的反义寡核苷酸下调MARCKS表达并减弱粘蛋白分泌过多。
[00022]图4A-4B说明PKC依赖的磷酸化将MARCKS从质膜释放到细胞质。
[00023]图5A-5C显示PKG通过活化PP2A诱导MARCKS的脱磷酸作用。
[00024]图6显示条线图，证明PP2A是粘蛋白分泌途径的主要成分。
[00025]图7是凝胶图，说明MARCKS与细胞质中的肌动蛋白和肌球蛋白结合。
[00026]图8显示控制人气道上皮细胞粘蛋白分泌的信号转导机制。
[00027]图9是条线图，显示MANS肽阻断分离的犬中性粒细胞分泌髓过氧化物酶的能力。
[00028]图10是条线图，显示MANS肽阻断分离的人中性粒细胞分泌髓过氧化物酶的能力。
[00029]图11是条线图，显示PMA刺激来自LPS-刺激的人中性粒细胞的MPO分泌的少量增加，所述分泌通过用8-溴-cGMP共刺激以浓度依赖的方式增强。
[00030]图12是条线图，显示8-溴-cGMP刺激对来自LPS-刺激的人中性粒细胞的MPO分泌几乎没有作用，直到以浓度-依赖的方式发生与PMA的共刺激作用。
[00031]图13是条线图，显示PMA刺激来自LPS-刺激的犬中性粒细胞的MPO分泌的少量增加，所述分泌通过用8-溴-cGMP共刺激以浓度依赖的方式增强。
[00032]图14是条线图，显示8-溴-cGMP刺激对来自LPS-刺激的犬中性粒细胞的MPO分泌几乎没有作用，直到以浓度-依赖的方式发生与PMA的共刺激作用。
[00033]图15是条线图，显示来自LPS-刺激的犬中性粒细胞的最大MPO分泌需要用PMA+8-Br-cGMP共刺激。
发明详述
[00034]现在参考附图将在下文中更全面的描述本发明，其中举例说明本发明的优选实施方式。但是，本发明可以采用不同的形式实施，不应被理解为限于本文阐述的实施方式。此外，提供这些实施方式使得这种公开是彻底和完整的，将本发明的范围全面的传达给本领域技术人员。
[00035]除非另外限定，所有此处使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。所有此处提及的出版物、专利申请、专利和其他参考文献在此完整引入作为参考。本文使用“一个”或者“一种”描述本发明的任意方面将被解释为表示一个或多个。
[00036]本发明涉及抑制至少一种炎性细胞的至少一种炎性介质的胞吐释放的方法，包括：将至少一种炎性细胞与有效量的选自MANS肽和其活性片段的至少一种肽接触，所述细胞包括至少一种包含在细胞内囊泡中的炎性介质，与相同类型炎性细胞在不存在至少一种肽的条件下的炎性介质释放相比，这将减少所述炎性细胞的炎性介质释放。
[00037]本发明还涉及在对象的组织和/或体液中抑制至少一种炎性细胞的至少一种炎性介质的释放的方法，包括给对象的组织和/或体液施用治疗有效量的药物组合物，所述组织和/或体液中包括至少一种炎性细胞，所述炎性细胞包含至少一种炎性介质，所述炎性介质包含在细胞的囊泡内，所述药物组合物包括治疗有效量的选自MANS肽和其活性片段的至少一种肽，与在不存在至少一种肽的条件下至少一种相同类型炎性细胞的炎性介质释放相比，这将减少至少一种炎性细胞的炎性介质释放。更具体地，减少炎性介质的释放包括阻断或者抑制炎性细胞释放炎性介质的机制。
[00038]用于如上所述的本方法的MANS肽包括SEQ ID NO：1。可用于本发明的活性片段包括至少一种包含至少6个氨基酸的SEQ ID NO：1肉豆蔻酰化N端片段，其中所述片段的第一个氨基酸起始于SEQ ID NO：1的N端甘氨酸。更具体的，所述活性片段选自N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA(SEQ ID NO：3)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA(SEQ ID NO：4)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPGE(SEQ ID NO：5)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERPG(SEQ ID NO：6)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAERP(SEQ ID NO：7)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAER(SEQ ID NO：8)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAAE(SEQ ID NO：9)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAAA(SEQ ID NO：10)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEAA(SEQ ID NO：11)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGEA(SEQ ID NO：12)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKGE(SEQ ID NO：13)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAKG(SEQ ID NO：14)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAAK(SEQID NO：15)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTAA(SEQ ID NO：16)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKTA(SEQ ID NO：17)；N-肉豆蔻酰-GAQFSKT(SEQ ID NO：18)；和N-肉豆蔻酰-GAQFSK(SEQ ID NO：19)。
[00039]本发明涉及将上文和贯穿说明书描述的肽接触和/或给药可能包含在对象的组织或者体液中的任意已知炎性细胞，所述炎性细胞包含至少一种炎性介质，所述炎性介质包含在细胞的囊泡内。所述炎性细胞优选的是白细胞，更优选的是粒细胞，所述粒细胞还可以进一步被分为中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或者其组合。本方法中被接触的炎性细胞还可以是单核细胞/巨噬细胞。
[00040]本发明涉及减少包含在炎性细胞囊泡内的炎性介质的释放，这些炎性介质选自髓过氧化物酶(MPO)，嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)，主要碱性蛋白(MBP)，溶菌酶，粒酶，组胺，蛋白多糖，蛋白酶，趋化因子，细胞因子，花生四烯酸的代谢物，防卫素，杀菌性通透性-增加蛋白(BPI)，弹性蛋白酶，组织蛋白酶G，组织蛋白酶B，组织蛋白酶D，beta-D-葡糖醛酸糖苷酶，alpha-甘露糖苷酶，磷脂酶A2，软骨素-4-硫酸酯，蛋白酶3，乳铁蛋白，胶原酶，补体活化剂，补体受体，N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受体，层粘连蛋白受体，细胞色素b₅₅₈，单核细胞-趋化因子，组胺酶，维生素B12结合蛋白，明胶酶，纤溶酶原激活物，beta-D-葡糖醛酸糖苷酶，及其组合。优选的，这些炎性介质选自髓过氧化物酶(MPO)，嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)，主要碱性蛋白(MBP)，溶菌酶，粒酶及其组合。
[00041]本发明将有效量的肽与炎性细胞接触，其中有效量被定义为脱颗粒抑制量的MANS肽或者其活性片段，与不存在MANS肽或者其活性片段的条件下至少一种炎性细胞释放的量相比，所述脱颗粒抑制量的MANS肽或者其活性片段将至少一种炎性细胞释放的炎性介质的量减少大约1％到大约99％。更优选的，这种有效量的接触肽包括脱颗粒抑制量的MANS肽或者其活性片段，与不存在MANS肽或者其活性片段的条件下至少一种炎性细胞释放的量相比，所述脱颗粒抑制量的MANS肽或者其活性片段将至少一种炎性细胞释放的炎性介质的量减少从大约5-50％之间到大约99％。
[00042]在一个实施方式中本发明涉及将治疗有效量的包括MANS肽和其活性片段的至少一种肽给药对象的组织或者体液，其中所述对象患有呼吸系统疾病，优选的是哮喘、慢性支气管炎或者COPD。在另一个实施方式中，对象可能患有肠疾病(bowel disease)、皮肤病(skin disease)、自身免疫病(autoimmune disease)、疼痛综合症(pain syndrome)及其组合。所述肠疾病可以是溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、克罗恩氏病(Crohn’s disease)或者肠易激综合征(irritable bowel syndrome)。对象可能患有皮肤病，例如红斑痤疮(rosacea)、湿疹(eczema)、银屑病(psoriasis)或者重度痤疮(severe acne)。对象还可能患有关节炎，例如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、银屑病关节炎(psoriatic arthritis)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)。本方法和肽也可以治疗患有囊性纤维化的对象。本方法优选的用于对象的治疗，例如哺乳动物，并且优选的是人、犬、马和猫。
[00043]治疗对象的本方法是通过给药一种或者多种包括本文描述的MANS肽或者活性片段的肽，所述给药包括局部给药，经肠胃外给药，经直肠给药，经肺部给药，经鼻给药或者口服给药。更具体地，经肺部给药选自气雾剂给药，干粉吸入器给药，定量吸入器给药和喷雾器给药。此外，公开的方法还可以包括给药对象选自抗生素、抗病毒化合物、抗寄生虫化合物、抗炎化合物和免疫抑制剂的第二分子。
[00044]一方面，本发明涉及给药药物组合物的方法。所述药物组合物包括治疗有效量的已知化合物和药学上可接受的载体。本文使用的“治疗有效量”是足以改善对象症状的化合物的量。治疗有效量将随以下因素变化：对象的年龄和身体健康状况，被治疗对象病症的严重程度，治疗持续时间，任意同期治疗的性质，使用的药学上可接受的载体以及属于本领域技术人员知识和专长的类似因素。药学上可接受的载体优选的是固体剂型例如片剂或者胶囊。也可以使用用于口服给药的液体制剂，可以制备成糖浆剂或者悬浮液的形式，例如，包含活性成分，糖，以及乙醇、水、甘油和丙二醇的混合物的溶液。如果需要，这类液体制剂可以包括一种或者多种下列物质：着色剂，调味剂和糖精。此外，还可以使用增稠剂例如羧甲基纤维素以及其他可接受的载体，对它们的选择是本领域已知的。
[00045]如上所述，本发明涉及调节细胞分泌过程的方法，尤其是炎性细胞释放炎性介质的过程。本文使用的术语“调节”表示阻断、抑制、降低、减少、增加、增强或者刺激。许多细胞分泌过程涉及胞内膜-结合的囊泡或者颗粒释放内容物。膜-结合的囊泡或者颗粒被定义为胞内颗粒，其主要是囊状的(或者胞内囊泡)并包含能够被分泌的贮料(stored material)。这类囊泡中的一些内容物，例如炎性细胞包含的那些，已经被认为在许多哺乳动物组织中导致各种病理。这类分泌物的一些效应看来包括炎症期间对先前健康组织的损伤。本发明提供一种阻断任意膜-结合的囊泡分泌的方法，包括在炎性细胞中发现的那些，其通过用合成肽靶向胞内分泌途径中重要的特异分子进行。该方法对于人和动物多种高分泌和炎性病症的治疗具有治疗意义。
[00046]更具体地，本发明靶向包含炎性介质的炎性细胞，所述炎性介质位于细胞的胞质内一个或者多个颗粒或者囊泡中。所述细胞与选自MANS肽或者其活性片段的一种或者多种肽接触，所述MANS肽或者其活性片段均在本文详细描述。优选的肽与炎性细胞的接触是通过给药受疾病折磨或者患有疾病的对象，其中这些炎性细胞存在于特定组织或者组织内的体液。当所述肽被给药细胞或者与细胞接触时，所述肽竞争性地争夺并竞争性地抑制天然MARCKS蛋白与胞内颗粒或者囊泡的膜的结合，所述颗粒或者囊泡包含炎性介质。由于阻断了炎性细胞中MARCKS蛋白与囊泡的结合，这些细胞中的这些囊泡不能像通常一样当受到刺激时移动到细胞的质膜，从而外吐释放它们的炎性介质内容物到胞外。因此，本发明方法抑制囊泡到细胞质膜的移动，从而减少炎性细胞的炎性介质释放。细胞释放炎性介质的量随时间降低，因为炎性细胞的释放速率和介质释放量取决于给药和接触炎性细胞的肽的浓度。
[00047]本发明的一个益处是它可以结合一种疗法，所述疗法包括利用独特抗炎疗法直接阻断粘液分泌。本发明超出现有抗炎疗法(影响免疫系统的全身性抑制)的一个益处是所述肽被认为只阻断炎性细胞分泌的胞内组分的分泌。因此，即使抑制了炎性介质，免疫系统的许多方面将仍然能够起作用。
[00048]本发明的化合物可以调节，即阻断，来自细胞的炎性介质释放。炎性介质释放的这种抑制对于预防和治疗各种疾病(例如，涉及炎症的疾病和病理学病症)是一种有吸引力的方法。因此，本发明的化合物可以用于这类病症的治疗。这些包括气道疾病和慢性炎性疾病，包括但不限于，骨关节炎，多发性硬化，Guillain-Barre综合征，克罗恩氏病，溃疡性结肠炎，银屑病，移植抗宿主病，系统性红斑狼疮和胰岛素-依赖性糖尿病。本发明的化合物还可用于治疗与促炎介质和酶的活性水平升高有关的其他疾病，例如对不同传染原的应答和许多自身免疫疾病例如类风湿性关节炎，中毒性休克综合症，糖尿病和炎性肠病。
[00049]本发明肽和方法的用途包括抗炎疗法以及将肽的抗炎活性与其阻断粘液分泌的能力结合的疗法。利用所述肽阻断炎症和粘液分泌的能力可以被治疗的疾病包括但不限于炎性肠病，消化疾病(即，胆囊炎症，Menetier′s病)和炎性气道疾病。所述肽还可用于阻断胰岛细胞释放过量的胰岛素。
[00050]其他促炎介质已经与各种疾病状态建立联系，所述疾病状态与中性粒细胞流入炎症或者损伤位点有关。阻断抗体已经被证明是急性炎症中抗中性粒细胞相关组织损伤的有效疗法(Harada等，1996，Molecular MedicineToday 2，482)。除了中性粒细胞外还可以释放炎性介质的细胞包括其他白细胞，例如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，治疗可以针对这些细胞的分泌物。中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞是粒细胞的各种类型，即，在其细胞质中具有颗粒的白细胞。白细胞合成许多在细胞质颗粒中包装和贮存的炎性介质。这些介质包括，例如，中性粒细胞中的髓过氧化物酶[MPO](Borregaard N，Cowland JB.Granules of thehuman neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.Blood 1997；89：3503-3521)，嗜酸性粒细胞中的嗜酸性粒细胞过氧化物酶[EPO]和主要碱性蛋白[MBP](Gleich G J.Mechanisms of eosinophil-associated inflammation.JAllergy Clin Immunol 2000；105：651-663)，单核细胞/巨噬细胞中的溶菌酶(Hoff T，Spencker T，Emmendoerffer A.，Goppelt-Struebe M.Effects ofglucocorticoids on the TPA-induced monocytic differentiation.J Leukoc Biol1992；52：173-182；Balboa M A，Saez Y，Balsinde J.Calcium-independentphospholipase A2 is required for lysozyme secretion in U937 promonocytes.JImmunol 2003；170：5276-5280)，以及天然杀伤(NK)细胞细胞毒性淋巴细胞中的粒酶(Bochan MR，Goebel WS，Brahmi Z.Stably transfected antisensegranzyme B and perforin constructs inhibit human granule-mediated lytic ability.Cell Immunol 1995；164：234-239；Gong J H.，Maki G，Klingemann HG.Characterization of a human cell line(NK-92)with phenotypical and functionalcharacteristics of activated natural killer cells.Leukemia 1994；8：652-658；MakiG，Klingemann HG，Martinson JA，Tam YK.Factors regulating the cytotoxicactivity of the human natural killer cell line，NK-92.J Hematother Stem CellRes 2001；10：369-383；和Takayama H，Trenn G，Sitkovsky MV.A novelcytotoxic T lymphocyte activation assay.J Immunol Methods 1987；104：183-1907-10)。由于这些细胞浸润损伤或者疾病的组织部位，这些介质可以在损伤部位被释放，并可能导致炎症和修复，例如在肺部和其他地方。白细胞通过胞吐机制释放这些颗粒(Burgoyne RD，Morgan A.Secretorygranule exocytosis.Physiol Rev 2003；83：581-632；Logan MR，Odemuyiwa SO，Moqbel R.Understanding exocytosis in immune and inflammatory cells：themolecular basis of mediator secretion.J Allergy Clin Immunol 2003；111：923-932)。
[00051]肥大细胞(其通常不在血流中循环)和嗜碱性粒细胞包含分泌性细胞质颗粒，所述细胞质颗粒保存并在细胞活化时释放预先形成的炎性(过敏性)介质，例如组胺；蛋白多糖，例如肝素和硫酸软骨素；蛋白酶例如类胰蛋白酶，胃促胰酶，羧肽酶，和组织蛋白酶G-样蛋白酶；趋化因子，细胞因子和花生四烯酸的代谢物，它们作用于脉管系统，平滑肌，结缔组织，粘膜腺和炎性细胞。
[00052]中性粒细胞，亦称为多形核白细胞(PMN)，包括全部循环白细胞的50到60％。中性粒细胞作用于抗传染原，例如细菌，真菌，原生动物，病毒，病毒感染细胞以及肿瘤细胞，它们在传染或者损伤部位渗透机体的物理屏障。中性粒细胞的成熟经过6个形态阶段：原粒细胞，早幼粒细胞，中幼粒细胞，晚幼粒细胞，不分叶(带状)中性粒细胞，和分叶(功能活性)中性粒细胞。
[00053]在中性粒细胞中，炎性介质被保存在一级(嗜苯胺蓝)，次级(特殊)，和三级(明胶酶)颗粒以及分泌小泡中。在大量炎性介质中，一级(嗜苯胺蓝)颗粒包含髓过氧化物酶(MPO)，溶菌酶，防卫素，杀菌性通透性-增加蛋白(BPI)，弹性蛋白酶，组织蛋白酶G，组织蛋白酶B，组织蛋白酶D，beta-D-葡糖醛酸糖苷酶，alpha-甘露糖苷酶，磷脂酶A₂，软骨素-4-硫酸酯，和蛋白酶3(参见，例如，Hartwig JH，Thelen M，Rosen A，Janmey PA，Nairn AC，Aderem A.MARCKS is an actin filament crosslinking proteinregulated by protein kinase C and calcium-calmodulin.Nature 1992；356：618-622)；次级(特殊)颗粒包含溶菌酶，乳铁蛋白，胶原酶，补体活化剂，磷脂酶A₂，补体受体，例如，CR3，CR4，N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受体，层粘连蛋白受体，细胞色素b₅₅₈，单核细胞-趋化因子，组胺酶，和维生素B12结合蛋白；以及小贮存颗粒包含明胶酶，纤溶酶原激活物，组织蛋白酶B，组织蛋白酶D，beta-D-葡糖醛酸糖苷酶，alpha-甘露糖苷酶和细胞色素b₅₅₈。
[00054]中性颗粒包含抗菌剂或者细胞毒性物质，中性蛋白酶类，酸性水解酶类和细胞质膜受体库。在嗜苯胺蓝颗粒的组成中，髓过氧化物酶(MPO)是过氧化氢到次氯酸转化的关键酶。它与过氧化氢和卤化辅因子共同构成白细胞-髓过氧化物酶系统有效的杀微生物和细胞毒性机制。
[00055]防卫素，其构成嗜苯胺蓝颗粒蛋白的30到50％，是小分子(分子量<4000)的有效抗微生物肽，它对大量细菌、真菌和一些病毒具有细胞毒性。它们的毒性可能归因于对靶细胞的膜透化作用，这类似于其他的通道-形成蛋白(穿孔素)。
[00056]细菌通透性-增强(BPI)蛋白是穿孔素的一个成员。它对革兰氏阴性细菌是高毒性的，但不针对革兰氏阳性细菌或者真菌，并且它还可以中和内毒素(革兰氏阴性细菌细胞被膜的毒性脂多糖成分)。
[00057]乳铁蛋白捕获游离的铁，从而防止摄入微生物的生长，所述微生物逃过杀伤过程并增加溶菌酶的细菌通透性。
[00058]丝氨酸蛋白酶例如弹性蛋白酶和组织蛋白酶G在细菌的细胞被膜水解蛋白。粒细胞弹性蛋白酶的底物包括胶原交联物和蛋白多糖，以及血管、韧带和软骨的弹性蛋白组分。组织蛋白酶D切割软骨蛋白多糖，而粒细胞胶原酶类对切割I型是有活性的，对来自骨、软骨和肌腱的III型胶原活性程度要低。胶原分解产物对于中性粒细胞、单核细胞和成纤维细胞具有趋化活性。
[00059]利用蛋白酶抑制剂例如alpha2-巨球蛋白和alpha1-抗蛋白酶介导溶酶体蛋白酶对组织破坏性潜在作用的调节。这些抗蛋白酶存在于血清和滑液。它们可能通过结合和覆盖蛋白酶的活性位点起作用。蛋白酶-抗蛋白酶失调可能在肺气肿的发病机制中非常重要。
[00060]嗜苯胺蓝颗粒主要在胞内环境(在phagolysosomal空泡中)起作用，在那里它们参与微生物的杀伤和降解。中性粒细胞特异性颗粒易于向胞外释放它们的内容物，在引发炎症中起着重要作用。特异性颗粒代表不同质膜组分的胞内储存器(reservoir)，所述质膜组分包括细胞色素b(NADPH氧化酶的组分，NADPH氧化酶是负责过氧化物产生的酶)，补体片段iC3b(CR3，CR4)、层粘连蛋白和甲酰甲硫氨酰-肽趋化因子的受体。除此以外，还有参与组胺降解的组胺酶，维生素结合蛋白，以及导致胞浆素形成和负责从C5切割出C5a的纤溶酶原激活物。
[00061]对具有先天颗粒异常的数例患者的研究清楚显示了中性颗粒在炎症中的重要性。患有Chédiak-Higashi综合症的患者在炎性应答的建立速率方面非常反常，并且具有异常大的溶酶体颗粒。特异性颗粒缺陷的先天综合症是一种极度罕见的疾病，其特征为减弱的炎性应答以及皮肤和深层组织的严重细菌感染。
[00062]尽管调节调节这些颗粒胞吐分泌的机制只被部分了解，但已经鉴定出该过程中数个关键分子，包括胞内Ca²⁺瞬变(transient)(Richter等ProcNatl Acad Sci USA 1990；87：9472-9476；Blackwood等，Biochem J 1990；266：195-200)，G蛋白，酪氨酸和蛋白激酶(PK，especially PKC)(Smolen等，Biochim Biophys Acta 1990；1052：133-142；Niessen等，Biochim.Biophys.Acta 1994；1223：267-273；Naucler等，Pettersen等，Chest 2002；121；142-150)，Rac2(Abdel-Latif等，Blood 2004；104：832-839；Lacy等，JImmunol 2003；170：2670-2679)，以及各种SNARE′s、SNAP′s和VAMP′s(Sollner等，Nature 1993；362：318-324；Lacy，Pharmacol Ther 2005；107：358-376)。
[00063]SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺附着蛋白受体)蛋白是一个膜-结合蛋白家族，其特征为alpha-螺旋卷曲-螺旋，称为SNARE模体(Li等，Cell.Mol.Life Sci.60：942-960(2003))。根据定位于囊泡还是靶向膜，这些蛋白被分为v-SNAREs和t-SNAREs；另一种分类法基于SNARE模体中心的保守精氨酸或者谷氨酰胺残基，分为R-SNAREs和Q-SNAREs。SNAREs定位于分泌和内吞运输途径的不同膜小室，造成胞内膜融合过程的特异性。t-SNARE结构域由具有卷曲螺旋捻(coiled-coil twist)的4-螺旋束构成。SNARE模体导致两个膜的融合。SNARE模体属于4种类型：syntaxin la的同系物(t-SNARE)，VAMP-2(v-SNARE)以及SNAP-25的N-和C-端SNARE模体。来自每种类型的成员可以相互作用形成SNARE复合物。SNARE模体被发现存在于某些syntaxin家族成员的N-端结构域，所述syntaxin家族成员例如syntaxin la(其是神经递质释放需要的(Lerman等，Biochemistry 39：8470-8479(2000)))，和syntaxin 6(在内涵体转运小泡中发现(Misura等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：9184-9189(2002)))。
[00064]SNAP-25(突触体-结合蛋白25kDa)蛋白是SNARE复合物的组分，其可以解释膜融合的特异性并可以通过形成紧密复合物(SNARE或者核心复合物)直接实现融合，所述紧密复合物将突触小泡和质膜结合在一起。SNAREs构成一个大的蛋白家族，其特征是被称为SNARE模体的60-残基序列，所述序列具有很高的倾向形成卷曲螺旋并经常位于羧基末端跨膜区之前。突触核心复合物是由4个SNARE模体(两个来自SNAP-25，各一个分别来自突触囊泡蛋白和syntaxin 1)形成的，所述SNARE模体在分离时是无特定结构的，但组装后形成平行的4-螺旋束。核心复合物的晶体结构已经显示所述螺旋束是高度扭曲的，并且包含数个表面盐桥以及多个内部疏水性残基层。复合物中心的极性层由3个谷氨酰胺(两个来自SNAP-25，1个来自syntaxin 1)和1个精氨酸(来自突触囊泡蛋白)(Rizo等，Nat Rev Neurosci 3：641-653(2002))形成。SNAP-25家族成员包含一组半胱氨酸残基，所述残基可以被棕榈酰化用于膜附着(Risinger等，J.Biol.Chem.268：24408-24414(1993))。
[00065]中性粒细胞的主要作用是吞噬和破坏传染原。它们还在获得性(特异)免疫应答发生前限制一些微生物的生长。尽管中性粒细胞对宿主防御必不可少，但是它们还涉及许多慢性炎性病症的病理以及局部缺血-再灌注损伤。从炎性部位分离的体液中可以检测出中性粒细胞来源的水解酶和氧化灭活的蛋白酶抑制剂。在正常情况下，中性粒细胞可以迁移到感染部位而不破坏宿主组织。但是，有时可能发生对宿主组织的有害破坏。这种损伤可能通过数种独立的机制发生。这些包括迁移期间的过早活化，杀伤一些微生物期间毒性产物的胞外释放，作为组织重建第一步的感染或者受损宿主细胞和碎片的去除，或者无法终止急性炎性应答。局部缺血-再灌注损伤与中性粒细胞流入被感染的组织及后续活化有关。这可以由受损宿主细胞释放的物质触发，或者是通过黄嘌呤氧化酶产生过氧化物的结果。
[00066]在正常情况下，血液可能包含正常的、被激发的，活化的和消耗的中性粒细胞的混合物。在炎性部位，主要存在活化和消耗的中性粒细胞。活化的中性粒细胞增强反应性氧中间物(ROI)的生成。在患有急性细菌感染的人以及患有成人呼吸窘迫综合征(ARDS)患者的血液中检测出具有增强的呼吸爆发的中性粒细胞亚群。这是中性粒细胞反论的一个实例。中性粒细胞涉及该病症的病理，因为这些细胞大规模流入肺部以及由活化中性粒细胞释放的氧化剂和水解酶造成的相关组织损伤。当ARDS加重时发生的中性粒细胞杀微生物活性的降低对宿主而言可能是一种保护性应答，所述应答由炎性产物局部诱导。
[00067]温度损伤的急性期也与中性粒细胞活化有关，这之后是不同中性粒细胞功能的广泛削弱。滑液中免疫复合物对中性粒细胞的活化造成类风湿性关节炎的病理。中性粒细胞的慢性活化还可能引发肿瘤发展，因为中性粒细胞产生的一些ROI损伤DNA和蛋白酶，从而促进肿瘤细胞转移。在患有严重烧伤的患者中，在细菌感染发病与抗体和补体受体阳性的中性粒细胞的比例和绝对数降低之间已经建立了联系。中性粒细胞来源的氧化剂还氧化低密度脂蛋白(LDL)，然后LDL更有效的通过特异清道夫受体结合巨噬细胞的质膜。巨噬细胞摄入这些氧化的LDL可能引发动脉粥样硬化。此外，在患有原发性高血压、霍奇金病、炎症性肠病、银屑病、结节病和败血病的人中发现了激发的中性粒细胞，其中激发与高浓度的循环TNF-alpha(恶病质素)有关。
[00068]当抗氧化剂和抗蛋白酶表面被覆盖时，可能发生宿主组织的水解破坏，从而发生慢性炎性病症。一般认为抗蛋白酶缺陷导致肺气肿的病理。许多抗蛋白酶是丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)家族的成员。尽管循环液富含抗蛋白酶，但这些大分子蛋白在炎症部位可能被选择性排除，因为中性粒细胞粘附到它们的靶上。氧化应激可能通过将胞外抗蛋白酶的浓度降低到低于抑制释放的蛋白酶所需水平来引发组织损伤。氯化氧化剂和过氧化氢能够灭活抗蛋白酶例如alpha1-蛋白酶抑制剂和alpha2-巨球蛋白，所述抗蛋白酶是弹性蛋白酶的内源抑制剂，但同时活化潜在的金属蛋白酶例如胶原酶类和明胶酶，它们有助于抗蛋白酶的进一步灭活。
[00069]中性粒细胞的细胞质成分还可能是特异抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)的成因，所述ANCA与全身性血管炎和肾小球肾炎的发展紧密相关。ANCA是针对酶的抗体，所述酶主要在中性粒细胞的嗜苯胺蓝或者一级颗粒中发现。存在3种类型的ANCA，可以通过对正常乙醇-固定的中性粒细胞的间接免疫荧光产生的图谱来进行区分。弥散性细粒状细胞质荧光(cANCA)通常在Wegener氏肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)，显微镜下多动脉炎(microscopic polyarteritis)和变应性肉芽肿性血管炎(Churg Strausssyndrome)的一些病例，以及新月体性和节段坏死性肾小球肾炎的一些病例中被发现。靶抗原通常是蛋白酶3。在显微镜下多动脉炎和肾小球肾炎的许多病例中发现核周荧光(pANCA)。这些抗体通常针对髓过氧化物酶，也针对其他靶标包括弹性蛋白酶，组织蛋白酶G，乳铁蛋白，溶菌酶和beta-D-葡糖醛酸糖苷酶。称为“非典型”ANCA的第三组包括中性粒细胞核荧光和一些不寻常的细胞质图谱，虽然还有几个靶抗原被pANCA共享，但还没有鉴定出其它的抗原。在1/3患有克罗恩氏病的患者中也发现了pANCA。类风湿性关节炎和SLE中报道的ANCA发生率显著不同，但图谱主要是pANCA和非典型ANCA。
[00070]嗜酸性粒细胞是终末分化的终末期白细胞，主要存在于粘膜下层组织，并被募集到特异性免疫反应(包括变应性疾病)部位。嗜酸性粒细胞细胞质包含具有电子-致密晶核和部分可渗透基片的大椭圆颗粒。除了这些大的一级结晶状颗粒，还存在另一种更小(小颗粒)并缺少晶核的颗粒类型。嗜酸性粒细胞的大特异性颗粒包含至少4个不同的阳离子蛋白，其对宿主细胞和微生物靶标(主要碱性蛋白(MBP)，嗜伊红阳离子蛋白质(ECP)，嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(EDN)和嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO))施加广泛的生物效应。嗜碱性粒细胞包含大约是嗜酸性粒细胞1/4的主要碱性蛋白，以及可检测数量的EDN、ECP和EPO。在中性粒细胞中也发现了少量EDN和ECP(Gleich G J.Mechanisms of eosinophil-associatedinflammation.J Allergy Clin Immunol 2000；105：651-663)。MBP看起来缺少酶活性，但它是高阳离子的多肽，可以通过与类脂膜相互作用导致其紊乱来发挥其毒性。MBP和EPO可以作为激动剂的选择性变构抑制剂结合M2毒蕈碱受体。这些蛋白对M2受体功能障碍有利，增强哮喘中迷走神经介导的支气管收缩。EDN可能特异性损伤神经元的髓包膜(myelin coat)。组胺酶和各种水解溶酶体酶也存在于嗜酸性粒细胞的大特异性颗粒中。嗜酸性粒细胞的小颗粒中包含的酶是芳基硫酸酯酶、酸性磷酸酶和92kDa的金属蛋白酶，明胶酶。嗜酸性粒细胞能够产生细胞因子，包括那些对嗜酸性粒细胞具有潜在自分泌生长-因子活性以及在急性和慢性炎性应答中具有潜在作用的细胞因子。3种细胞因子对嗜酸性粒细胞具有生长-因子活性：粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)、IL-3和IL-5。人嗜酸性粒细胞产生的其他细胞因子可能在急性和慢性炎性应答中具有活性，包括IL-1-alpha、IL-6、IL-8、TNF-alpha和两种转化生长因子，TGF-alpha和TGF-beta。
[00071]嗜酸性粒细胞包含结晶状颗粒，所述颗粒包含MBP，嗜伊红阳离子蛋白质，EPO和嗜酸性粒细胞-来源的神经毒素(Gleich，J Allergy ClinImmunol 2000；105：651-663)。人前髓细胞性细胞系HL-60克隆15可用于检测EPO的分泌。该细胞系从HL-60克隆建立，所述HL-60已经在升高的pH条件下生长2个月(Fischkoff，Leuk Res 1988；12：679-686)，然后用丁酸处理让细胞分化以显示大量的外周血嗜酸性粒细胞特征，包括嗜酸性粒细胞-特异性颗粒蛋白的表达(Rosenberg等，J Exp Med 1989；170：163-176；Tiffany等，J Leukoc Biol 1995；58：49-54；Badewa等，Exp Biol Med 2002；227：645-651)。
[00072]嗜酸性粒细胞可能参与过敏性反应，尤其通过两种脂质炎性介质，白细胞三烯C⁴(LTC⁴)和血小板活化因子(PAF)。两种介质感染气道平滑肌，促进粘液分泌，改变血管通透性并引发嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润。除了这些嗜酸性粒细胞-来源的介质的直接活性以外，MBP能够刺激嗜碱性粒细胞和肥大细胞的组胺释放，并且MBP能够刺激肥大细胞的EPO释放。嗜酸性粒细胞可以作为特异性脂介质的局部来源，以及诱导肥大细胞和嗜碱性粒细胞的介质释放。在受到与中性颗粒类似的刺激(例如受调理颗粒的吞噬期间以及被趋化因子刺激)后，嗜酸性粒细胞颗粒的内容物被释放。中性粒细胞溶酶体酶主要作用于吞噬溶酶体吞噬的物质，而嗜酸性粒细胞颗粒内容物主要作用于胞外的靶结构例如寄生虫和炎性介质。
[00073]单核细胞和巨噬细胞的发育在骨髓中发生，并经历以下步骤：干细胞；定向干细胞；成单核细胞；原单核细胞；骨髓中的单核细胞；外周血中的单核细胞；和组织中的巨噬细胞。单核细胞分化在骨髓中快速进行(1.5到3天)。分化期间，颗粒在单核细胞的细胞质中形成，这些颗粒在中性粒细胞中可以被分裂成至少两种类型。但是，它们少于并且小于它们的中性粒细胞对应物(嗜苯胺蓝和特异性颗粒)。它们的酶内容物是相似的。
[00074]单核细胞/巨噬细胞的颗粒-结合酶包括溶菌酶、酸性磷酸酶和beta-葡糖醛酸糖苷酶。利用来自U937细胞的溶菌酶分泌作为体内研究的模型。该细胞系来源于人组织细胞淋巴瘤，已经被用作能够被各种激动剂例如PMA活化的单核细胞的细胞系(Hoff等，J Leukoc Biol 1992；52：173-182；Balboa等，J Immunol 2003；170：5276-5280；Sundstrom等，Int J Cancer 1976；17：565-577)。
[00075]天然杀伤(NK)细胞和细胞毒性淋巴细胞包含有效的细胞毒性颗粒，包括穿孔素、孔形成蛋白和粒酶，淋巴细胞-特异性丝氨酸蛋白酶。例如，NK-92细胞系是IL-2-依赖的人细胞系，从患有快速进展性非霍奇金淋巴瘤的患者建立(Gong JH.，Maki G，Klingemann HG.Characterization of ahuman cell line(NK-92)with phenotypical and functional characteristics ofactivated natural killer cells.Leukemia 1994；8：652-658)。NK-92细胞表达高水平的参与穿孔素-粒酶溶胞途径的分子，所述途径针对广泛的恶性细胞(Gong等，vide infra，和Maki G，Klingemann HG，Martinson JA，Tam YK.Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line，NK-92.J Hematother Stem Cell Res 2001；10：369-383)。
[00076]粒酶是细胞毒性T细胞和天然杀伤细胞内细胞质颗粒释放的外源丝氨酸蛋白酶。粒酶可以在病毒感染细胞内诱导凋亡，从而摧毁它们。
[00077]炎症介质(炎性介质)从粒细胞(或者白细胞)的胞外释放，以及超过一种的炎症介质(炎性介质)从粒细胞(或者白细胞)的胞外释放在本文中有时被称为脱颗粒。在优选的实施方式中，炎症介质的释放包括所述介质从位于粒细胞或者白细胞内部的颗粒释放。炎性介质的释放优选的是炎性介质从这些颗粒的释放。
[00078]在通过促炎剂(炎性刺激剂)例如TNFα激发后，中性粒细胞和巨噬细胞显著增加它们的MARCKS蛋白合成：中性粒细胞响应TNFα或者脂多糖(LPS)而形成的新蛋白中差不多90％是MARCKS(Thelen M，Rosen A，Nairn AC，Aderem A.Tumor necrosis factor alpha modifies agonist-dependentresponses in human neutrophils by inducing the synthesis and myristoylation ofa specific protein kinase C substrate.Proc Natl Acad Sci USA 1990；87：5603-5607)。因此当包含颗粒的细胞(例如中性粒细胞和巨噬细胞)被激动剂(尤其是那些通过活化PKC起作用的激动剂)刺激时，MARCKS可能在炎性介质的后续释放中具有重要作用(Burgoyne等，Physiol Rev2003；83：581-632；Logan等J Allergy Clin Immunol 2003；111：923-932；Smolen等，Biochim Biophys Acta 1990；1052：133-142；Niessen等，Biochim.Biophys.Acta 1994；1223：267-273；Naucler等，J Leukoc Biol 2002；71：701-710)。
[00079]在本发明的一方面，给药脱颗粒抑制量的本文所述MANS肽或者其活性片段到对象的炎症部位(所述炎症部位源于疾病、病症、创伤、异物或者其组合开始进入对象的炎症部位)，能够降低炎症部位浸润白细胞释放的炎症介质的量，其中所述白细胞优选的是粒细胞。MANS肽和/或至少一种其活性片段的给药能够降低白细胞例如渗入炎症部位的粒细胞释放的炎症介质的量。脱颗粒抑制量的MANS肽，或者脱颗粒抑制量的其活性片段，足以减少或者抑制炎性介质的胞吐释放，所述炎性介质来自渗入所述部位的炎性细胞内包含的颗粒。在给药MANS肽或者其片段后测量脱颗粒抑制效果，通过比较所述细胞(白细胞或者粒细胞或者其他炎性细胞)释放的炎症介质相对于不存在MANS肽和/或其活性片段的条件下大约相同时间释放或者产生的所述炎症介质的水平或者量或者浓度的抑制百分比(即，降低百分比)。此外，熟练的临床医生通过检查被称为疾病指标的炎症症状和参数能够确定组织部位的炎症是否减轻，从而确定是否已经给药了足够量或者治疗有效量的MANS肽和/或其活性片段。足够的脱颗粒抑制量是炎症部位粒细胞释放的炎症介质的降低百分比为所述粒细胞在不存在MANS肽或者其活性片段、相同条件下测出的释放所述炎症介质的量的从大约1％到大约99％，优选的从5％到大约99％，更优选的从大约10％到大约99％，甚至更优选的从大约25％到99％，并且甚至更优选的从大约50％到大约99％的。
[00080]在本发明的一方面，给药脱颗粒抑制量的MANS肽到动物的炎性刺激部位(所述炎性刺激部位通过给药炎症-刺激量的炎性刺激剂到所述部位产生)能够降低粒细胞(所述粒细胞被所述炎性刺激部位的所述炎性刺激剂刺激)释放炎症介质的量，所述降低的量为在不存在MANS肽并存在相同炎症刺激量的所述炎性刺激剂条件下所述粒细胞释放的所述炎症介质的量的从大约1％到大约99％，优选的从5％到大约99％，更优选的从大约10％到大约99％，更优选的从大约25％到99％，并且甚至更优选的从大约50％到大约99％。
[00081]在本发明的另一方面，给药脱颗粒抑制量的MANS肽到动物的炎性刺激部位(所述炎性刺激部位通过给药炎症-刺激量的炎性刺激剂到所述部位产生)，能够降低粒细胞(所述粒细胞被所述炎性刺激部位的所述炎性刺激剂刺激)释放炎症介质的量，达到在不存在MANS肽并存在相同炎症-刺激量的所述炎性刺激剂条件下所述粒细胞释放的所述炎症介质的量的100％。
[00082]用于本文体外实施例的一个炎性刺激剂实例是佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)。单核细胞趋化因子蛋白(MCP-1)与C5a在嗜碱性粒细胞的脱颗粒中几乎一样有效，并且比IL-8更有效，导致组胺释放。在用趋化因子(即，趋化细胞因子)、RANTES和MIP-1刺激后，可能发生组胺释放。
[00083]在优选的实施方式中，相对于炎性刺激部位存在的MARCKS肽的基础浓度，给药动物炎性刺激部位的脱颗粒抑制量的MANS肽包括所述炎性刺激部位MARCKS肽浓度的大约1倍到大约1,000,000倍，优选的所述炎性刺激部位MARCKS肽浓度的大约1倍到大约100,000倍，更优选的所述炎性刺激部位MARCKS肽浓度的大约1倍到大约10,000倍，甚至更优选的所述炎性刺激部位MARCKS肽浓度的大约1倍到大约1,000倍，甚至更优选的所述炎性刺激部位MARCKS肽浓度的大约1倍到大约100倍，并且甚至更优选的所述炎性刺激部位MARCKS肽浓度的大约1倍到大约10倍。
[00084]在优选的实施方式中，粒细胞位于动物(优选的是人)的气道表面或者内部，MANS肽通过吸入给药，例如通过吸入包括MANS肽的药物组合物，例如包括MANS肽和水溶液的药物组合物(所述组合物以气雾剂形式给药)，或者包括干粉形式MANS肽的药物组合物(所述组合物利用干粉吸入器给药)。本领域已知的通过吸入给药溶液或者粉剂的其他方法和设备例如，微滴、喷雾剂和喷雾器，能够起作用。
[00085]在一些实施方式中，本发明的肽有可能阻断生理上重要的包括基本分泌功能的分泌过程。尽管发明人不希望受到本发明任意特定理论的束缚，但普遍认为调节这类基础分泌的机制不同于那些调节受激分泌的机制。此外，基础分泌机制可能比受刺激分泌需要更少的MARCKS蛋白。基础分泌可能仍然被保留，因为所有阻断MARCKS-介导分泌的疗法都不能消除所有的MARCKS功能。
[00086]本文使用的术语“MARCKS核苷酸序列”是指源自编码MARCKS蛋白的基因的任意核苷酸序列，包括，例如，DNA或者RNA序列，基因的DNA序列，任意转录的RNA序列，前信使RNA或者mRNA转录产物的RNA序列，以及与蛋白结合的DNA或者RNA。
[00087]MARCKS-阻断肽的准确输送还可以克服阻断重要分泌过程的任意可能的局限性。利用吸入剂应该可以轻易实现将这类药剂输送到呼吸道。因为这些药剂可用于治疗炎症性肠病，可以想到通过灌肠剂或者栓剂将所述阻断剂输送入直肠/结肠/肠道。注射或者透皮输送入发炎的关节通过减少局部炎性细胞的分泌，可以缓解患有关节炎或者自身免疫疾病的患者。注射入神经末梢周围的区域可以抑制一些神经递质类型的分泌，阻断严重疼痛或者不受控肌肉痉挛的传播。利用本领域已知的不同局部制剂应该可以轻易的实现用于炎性皮肤病治疗的肽的输送。
[00088]已经证明肉豆蔻酰化丙氨酸-富集的C激酶底物(MARCKS)(一种广泛分布的PKC底物)可能是介导正常人支气管上皮(NHBE)细胞释放粘蛋白颗粒的关键调节分子。来自这些细胞的粘蛋白分泌通过PKC和PKG的活化可以达到最大化。普遍认为MARCKS作为协调这两种蛋白激酶作用的集合点以控制粘蛋白颗粒释放。所述机制看起来涉及MARCKS的PKC-依赖磷酸化，这将从质膜释放MARCKS进入细胞质，然后在那里MARCKS被PKG活化的蛋白磷酸酶2A(PP2A)去磷酸化。这种脱磷酸允许MARCKS恢复其膜-结合能力，使其粘附到细胞质粘蛋白颗粒的膜上。此外，MARCKS与细胞质中的肌动蛋白和肌球蛋白相互作用，因此能够将颗粒栓系到细胞的收缩装置，从而介导后续的颗粒运动和胞吐作用。来自中性粒细胞的炎性调节MPO的分泌也可以通过PKC和PKG的活化达到最大化(如图11-15)。有可能MARCKS作为协调这两种蛋白激酶作用的集合点，控制炎性细胞中膜-结合小室的分泌(即中性粒细胞的MPO分泌)。
[00089]本发明显示犬或者人中性粒细胞炎性介质MPO的分泌被PKC和PKG的共同活化增强，而单独一种酶的活化不足以诱导最大的分泌应答。在NHBE细胞(图1，栏4)和中性粒细胞(图11)中记载有对单独PMA的增强分泌应答，尽管应答的强度要比其他人在大鼠杯状细胞系中观察到的低得多。参见，Abdullah等，上文。此外，尽管先前报道cGMP类似物能够诱导培养的豚鼠气管上皮细胞显著的粘蛋白分泌(Fischer等，上文)，但是应注意到该应答直到接触8小时后才达到显著水平。这么长延迟期的分泌应答不可能是直接作用，并可能涉及重新的蛋白合成，与预先形成和保存的细胞质颗粒的释放相反。尽管如此，涉及PKC和PKG协同活化的明显协同作用指示了一种介导粘蛋白分泌和/或炎性介质的复合物和严谨的信号转导机制。申请人记载了下面公开的途径被用于研究中性粒细胞的炎性介质释放，并且所述途径与用于研究杯状细胞分泌的途径可能是相同的。
[00090]如上所述，本发明可以在药物制剂中使用。在某些实施方式中，药物产品存在于适于口服给药的固体药物组合物中。可以形成本发明的固体组合物，并且所述组合物可以与赋形剂混合或者用赋形剂稀释。固体组合物也可以包装入载体，可以采用，例如，胶囊、囊剂、片剂、纸容器或者其他容器的形式。当赋形剂作为稀释剂时，它可以是作为物质组合物的赋形剂、载体或者培养基的固体、半固体或者液体材料。
[00091]不同的合适赋形剂是本领域技术人员都清楚的，并且可以在国家处方集(National Formulary)19：2404-2406(2000)中找到，其第2404到2406页的公开在此完整引入作为参考。合适赋形剂的实例包括，但不限于，淀粉，阿拉伯树胶，硅酸钙，微晶纤维素，异丁烯酸，虫胶，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，水，糖浆剂和甲基纤维素。药物产品制剂还可以包括润滑剂，例如，滑石，硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂例如甲基-和丙基羟基苯酸盐；甜味剂；或者调味剂。还可以使用多元醇、缓冲液和惰性填料。多元醇的实例包括，但不限于，甘露醇，山梨糖醇，木糖醇，蔗糖，麦芽糖，葡萄糖，乳糖，葡萄糖，等等。合适的缓冲液包括，但不限于，磷酸酯，柠檬酸盐，酒石酸盐，琥珀酸，等等。可以使用的其他惰性填料包括本领域已知的并且可用于不同剂型制备的那些填料。如果需要，所述固体制剂可以包括其他组分例如填充剂和/或成粒剂，等等。通过使用本领域公知的步骤，可以将本发明的药物产品配制成给药患者后提供活性成分的快速、持久或者延缓释放。
[00092]为了形成用于口服给药的片剂，本发明物质的组合物可以通过直接压片法制备。在该过程中，活性药物成分可以与固态、pulverant载体(例如，乳糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，淀粉，支链淀粉，纤维素衍生物或者明胶，和其混合物)以及润滑剂(例如，硬脂酸镁，硬脂酸钙和聚乙二醇蜡)混合。然后利用具有合适穿孔器和冲模的装置将所述混合物压成片剂以获得所需的片剂大小。所述设备的工作参数可以由熟练技工选择。此外，用于口服给药片剂的可以通过湿颗粒法形成。活性药物成分可以与赋形剂和/或稀释剂混合。所述固态物质可以被研磨或者筛选为所需粒径。所述药物中可以添加结合剂。所述结合剂可以在合适的溶剂中悬浮和匀浆。所述活性成分和辅料也可与结合剂溶液混合。所获干混合物用溶液均匀润湿。所述润湿通常造成颗粒轻微聚集，然后将挤压所获物质穿过具有所需大小的不锈钢筛网。然后在受控的干燥器内干燥所述混合物预定的时间，所述时间是实现所需粒径和硬度(consistency)必需的。干混合物的颗粒经过筛网去除任何粉末。该混合物中可以添加分解剂、润滑剂和/或防粘剂。最后，利用具有合适穿孔器和冲模的装置将所述混合物压成片剂以获得所需的片剂大小。所述设备的工作参数可以由熟练技工选择。
[00093]如果需要糖衣片剂，上述制备的核可以用糖或者纤维聚合物(可以包含阿拉伯树胶、明胶、滑石、二氧化钛)的浓溶液或者用溶于挥发性有机溶剂或者溶剂混合物的涂料(lacquer)包被。所述包衣中可以添加不同的染料，以便区别具有不同活性化合物或者不同量的所述活性化合物的片剂。在特定实施方式中，所述活性成分可以存在于被一层或者多层包括肠溶衣层包围的核中。
[00094]可以制备软胶胶囊，其中胶囊包含所述活性成分和植物油的混合物。硬胶囊可以包含活性成分的颗粒以及固态、粉状载体，例如，乳糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，马铃薯淀粉，玉米淀粉，支链淀粉，纤维素衍生物和/或明胶。
[00095]用于口服给药的液体制剂可以制成糖浆剂或者悬浮液的形式，例如，包含活性成分，糖，以及乙醇、水、甘油和丙二醇的混合物的溶液。如果需要，这类液体制剂可以包括一种或者多种下列物质：着色剂，调味剂和糖精。还可以使用增稠剂例如羧甲基纤维素。
[00096]在上述药物用于肠胃外给药的情况下，这类制剂可以包括无菌水性注射液，非水注射液或者两者，它们均包含本发明物质的组合物。当制备水性注射液时，所述物质的组合物可以是水溶性药学上可接受的盐。肠胃外制剂可以包含抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂，以及使所述制剂与预期受体血液等渗的溶质。水性和非水的无菌悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以存在于单位-剂量或者多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶。从先前描述种类的无菌粉剂、颗粒和片剂可以制备即用注射液和悬浮液。
[00097]也可以将物质的所述组合物配制成适于局部给药(例如，护肤霜)。这些制剂可以包含本领域技术人员已知的各种赋形剂。合适的赋形剂可能包括，但不限于，十六基酯蜡，鲸蜡醇，白蜡，单硬脂酸甘油酯，丙二醇，一硬脂酸，硬脂酸甲酯，苯甲醇，硫酸月桂酯钠，甘油，矿物油，水，卡波姆，乙醇，丙烯酸酯胶粘剂，聚异丁烯胶粘剂和硅酮胶粘剂。
[00098]现在已经描述了本发明，下面将参考某些实施例对相同内容进行说明，这包括在本文中只是为了说明目的，而不是为了限制本发明。
实施例
NHBE细胞的粘蛋白分泌过多涉及PKC和PKG的活化
[00099]为了确定PKC和/或PKG在粘蛋白分泌过程中的可能作用，将NHBE细胞接触下列两种特定蛋白激酶活化剂：用于PKC活化的佛波醇酯，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)，和用于PKG活化的非水解cGMP类似物，8-溴-cGMP。检测粘蛋白分泌响应不同浓度不同时间(直到1μM2小时)的PMA刺激的初步研究表明，单独的PKC活化不诱导NHBE细胞的显著粘蛋白分泌，尽管在大于100nM的PMA浓度反复观察到中等程度的分泌应答(0.05<p<0.1)。并且，所述细胞不对与浓度高达500μM的cGMP类似物直至2小时的接触产生应答。但是，PMA+8-Br-cGMP的组合，影响PKC和PKG的双重活化，引起分泌的快速增加，在接触15分钟内大约加倍(图1A)。PMA+8-Br-cGMP诱导的这种分泌应答是浓度-依赖的，在100nM PMA+1μM 8-Br-cGMP达到最大刺激(图1B和1C)。在图1A、1B和1C中，NHBE接触指定的试剂或者单独的培养基(CTL)15分钟。在图1D中，NHBE细胞与指定的抑制剂预保温15分钟，然后用100.mu.M UTP刺激2小时。收集并通过ELISA分析响应所述处理分泌的粘蛋白。数据表示为平均值+-.S.E.(每个点n＝6)。^*代表显著不同于培养基对照(p<0.05)；#代表不同于培养基对照(0.05<p<0.1)；以及.代表显著不同于UTP刺激(p<0.05)。
[000100]UTP是一种界定明确的病理生理相关的粘蛋白促分泌剂。Lethem等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.9，315-322(1993)。本发明还证明不同浓度的UTP，优选的40到140μM，在接触2小时后可以诱导NHBE细胞粘蛋白分泌的显著增加。为了确定PKC和PKG是否涉及响应病理生理刺激的粘蛋白分泌的调节，研究了PKC/PKG抑制剂对UTP诱导的粘蛋白分泌的作用。NHBE细胞与各种抑制剂预保温15分钟，然后接触UTP(100μm)加抑制剂2小时。通过ELISA测定分泌的粘蛋白。结果表明UTP引起的粘蛋白分泌可能需要PKC和PKG活性，因为分泌应答被PKC抑制剂calphostinC(500nM)、PKG抑制剂Rp-8-Br-PET-cGMP(10μM)或者可溶性鸟苷酰基环化酶(GC-S)抑制剂LY83583(50μM)减弱，但可能不被蛋白激酶A(PKA)抑制剂KT5720(500nM)减弱(图1D)。显然，NHBE细胞中的粘蛋白分泌可以被涉及PKC和PKG的信号转导机制调节。
[000101]为了阐明PKG参与所述分泌过程，在这些研究中使用8-Br-cGMP。尽管8-Br-cGMP的主要生理作用是活化PKG，它还被报道在一些细胞中作为cGMP-门控离子通道的激动剂，并且在高浓度交叉活化PKA。为了排除cGMP-门控离子通道和/或PKA在NHBE细胞粘蛋白分泌中起作用的可能性，Rp-8-Br-cGMP(一种独特的cGMP类似物，它类似于8-Br-cGMP能够活化cGMP-门控离子通道但抑制PKG活性)被用作激动剂以区分PKG和cGMP-门控离子通道对粘蛋白释放的作用。如附图尤其是图1A(栏11)所示，当Rp-8-Br-cGMP与PMA一起被添加到细胞时，Rp-8-Br-cGMP不增加粘蛋白分泌。同样地，特异性PKA抑制剂，KT5720(500nM)，不影响PMA+8-Br-cGMP或者UTP诱导的粘蛋白分泌(图1D，栏4)。这些研究可以否定cGMP-门控离子通道或者PKA与粘蛋白分泌有关的可能性，表明NHBE细胞中PKG的活化是8-Br-cGMP有助于分泌增强的机制。此外，因为UTP诱导的粘蛋白分泌过多可以被可溶性鸟苷酰基环化酶(GC-S)抑制剂LY83583减弱，很可能PKG的活化通过一氧化氮(NO)→GC-S→cGMP→PKG的信号转导途径发生，就像之前在体外分化的豚鼠气管上皮细胞中显示的那样。
[000102]考虑到PKC和PKG均参与粘蛋白分泌过程，本发明检测了这些酶的可能胞内底物，它们可能在激酶活化的信号转导事件下游起作用。许多胞内底物都能被PKC或者PKG磷酸化，这样一种底物MARCKS蛋白被PKC的磷酸化，看起来具有特定意义。已经观察到MARCKS磷酸化与许多细胞过程有关，所述细胞代谢过程涉及PKC信号转导和细胞骨架收缩，例如细胞运动、促有丝分裂和神经递质释放。因为分泌的动态过程需要两种激酶的活化和胞内颗粒移位到细胞外围，MARCKS看起来是连接PKC/PKG活化和粘蛋白颗粒胞吐作用的介质分子的候选物。MARCKS是NHBE细胞中连接PKC/PKG活化与粘蛋白分泌的关键分子
[000103]为了阐明蛋白激酶活化下游的信号转导机制，研究PKC的特异细胞底物MARCKS蛋白在连接激酶活化与颗粒释放中的可能作用。首先，通过[³H]肉豆蔻酸-标记的免疫沉淀分析证明NHBE细胞中MARCKS的存在。如图2A所示，MARCKS在NHBE细胞中表达，并且在未刺激条件下该蛋白的大部分是膜结合的。在图2A中，细胞用[³H]肉豆蔻酸标记过夜，然后通过差速离心分离膜(第1道)和胞浆(第2道)部分。MARCKS作为粘蛋白分泌途径的关键调节组分的作用可以用3种不同的方式证明。
[000104]如上所述，MARCKS直接参与NHBE细胞的粘蛋白分泌可以被3组不同的证据证明。首先，响应PMA+8-Br-cGMP或者UTP刺激的粘蛋白分泌以浓度-依赖的方式被MANS肽抑制，所述MANS肽与MARCKS的N端区域具有相同的氨基酸序列，而相应的对照肽(RNS)不影响分泌，所述RNS包含相同的氨基酸组成但按照随机顺序排列。已知MARCKS的N端肉豆蔻酰化结构域介导MARCKS-膜结合。如图8所示，MARCKS通过在其N端结构域与颗粒膜相互作用并在其PSD部位结合肌动蛋白丝，起到分子连接子的作用，从而将颗粒栓系到收缩细胞骨架用于运动和胞吐作用。图8显示显示一种可能的机制，描述粘蛋白促分泌剂与气道上皮(杯状)细胞相互作用并活化两种不同的蛋白激酶，PKC和PKG。活化的PKC磷酸化MARCKS，造成MARCKS从质膜移位到细胞质，而PKG，通过一氧化氮(NO)→GC-S→cGMP→PKG途径活化，依次活化细胞质PP2A，所述PP2A使MARCKS去磷酸化。这种脱磷酸作用稳定MARCKS与颗粒膜的粘附。此外，MARCKS还与肌动蛋白和肌球蛋白相互作用，从而将颗粒连接到细胞收缩装置用于后续运动和胞吐释放。在MARCKS被释放入细胞质后，MARCKS与颗粒的粘附还可能受特定靶蛋白或者其他形式的蛋白-蛋白相互作用的引导，其中MARCKS的N端结构域参与所述相互作用。在任意一种情况下，MANS肽或者包括至少6个氨基酸的其活性片段，将起竞争性抑制MARCKS靶向粘蛋白颗粒膜的作用，从而阻断分泌。
[000105]第二个试验证明MARCKS-特异性反义寡核苷酸对粘蛋白分泌的抑制效果。如图3A-3C所示，所述反义寡核苷酸下调NHBE细胞的MARCKSmRNA和蛋白水平，基本上减弱PKC/PKG活化诱导的粘蛋白分泌。所述抑制不如MANS肽观察到的显著，这可能归因于NHBE细胞中高水平的内源MARCKS蛋白和MARCKS mRNA相对较长的半衰期(t_1/2＝4-6小时)。在图3A-3C中，NHBE细胞用反义或者对照寡核苷酸处理3天，然后用PMA(100nM)+8-Br-cGMP(1μM)刺激15分钟。通过ELISA分析粘蛋白分泌。从被处理的细胞分离总RNA和蛋白。通过Northern杂交评价MARCKS mRNA，并通过Western印迹评价蛋白。在PMA(100nM)+8-Br-cGMP(1μM)图3A是Northern印迹，显示与附表中的对照相比，MARCKS mRNA降低大约15％；图3B是Western印迹，显示附表中MARCKS蛋白降低大约30％；和图3C显示粘蛋白分泌过多被反义寡核苷酸显著减弱，而对照寡核苷酸没有效果。数据表示为平均值±S.E.(每点n＝6)，其中*表示显著不同于培养基对照(p<0.05)；和表示显著不同于PMA+8-Br-cGMP刺激(p<0.05)。此外，应注意到术语CTO是对照寡核苷酸，而术语ASO是反义寡核苷酸。
[000106]已经证明与特异RNAs互补的反义寡核苷酸能够抑制细胞基因表达为蛋白。参见Erickson和Izant，Gene Regulation：Biology Of Antisense RNAAnd DNA，Vol.1，Raven Press，N.Y.，1992。例如，已经报道了通过单个核苷酸对不同于正常基因的p21基因的选择性抑制。Chang等，Biochemistry(1991)，30：8283-8286。已经提出许多假设来解释反义寡核苷酸抑制基因表达的机制，但是，牵涉的特异机制可能取决于研究的细胞类型、针对的RNA、针对的RNA上的特定位点和寡核苷酸的化学性质。Chiang等，J.Biol.Chem.1991，266：18162-18171；Stein and Cohen，Cancer Res.1988，48：2659-2668。
[000107]第三个实验表明用去除PSD的突变MARCKS转染的HBE1细胞导致PKC/PKG活化诱导的粘蛋白分泌的显著抑制。PSD的缺失将消除MARCKS结合肌动蛋白的能力。如图8所示，通过与天然MARCKS竞争结合颗粒膜，PSD-截短的MARCKS从而能够抑制颗粒释放，因为它不能与肌动蛋白丝相互作用。用野生型MARCKS cDNA转染这些细胞不会进一步增强粘蛋白分泌。Western印迹分析显示HBE1细胞中内源MARCKS的表达水平非常高，与NHBE细胞中的相当，而在这些细胞中野生型MARCKScDNA的转染不导致总MARCKS蛋白水平的显著增加。这可以解释为什么用野生型MARCKS转染不进一步增强分泌以及为什么用去除PSD的MARCKS转染只部分地阻止粘蛋白分泌。
[000108]肽阻断研究--NHBE细胞用MANS或者RNS肽(1-100.mu.M)预保温15分钟，然后添加PMA(100nM)+8-Br-cGMP(1μM)或者UTP(100μM)，所述细胞再分别保温另外15分钟或者2小时。通过ELISA测量粘蛋白分泌。如图2B所示，NHBE细胞与MANS肽的保温导致响应PKC/PKG活化或者UTP刺激的粘蛋白分泌的浓度依赖的抑制，而对照肽(RNS)在这些相同的浓度可能不影响分泌。在图2B中，MANS肽以浓度依赖的方式阻断PMA+8-Br-cGMP或者UTP诱导的粘蛋白分泌过多。NHBE细胞与指定的肽预保温15分钟，然后接触PMA(100nM)+8-Br-cGMP(1.mu.M)15分钟或者UTP(100μM)2小时。通过ELISA测量粘蛋白分泌。数据表示为平均值+-.S.E.(每点n＝6)，其中*是显著不同于培养基对照(p<0.05)；是显著不同于PMA+8-Br-cGMP刺激(p<0.05)；和是显著不同于UTP刺激(<0.05)。MANS肽的作用很可能与细胞毒性或者细胞代谢活动的常规抑制无关，因为MANS或者RNS肽均不影响乳酸脱氢酶释放或者细胞摄取[³H]脱氧葡萄糖。
[000109]反义寡核苷酸研究--为了进一步证明MARCKS是粘蛋白分泌途径的关键信号组分，检测了针对MARCKS的反义寡核苷酸对粘蛋白分泌的作用。如图3所示，该反义寡核苷酸下调NHBE细胞中MARCKS的mRNA和蛋白水平，并且显著减弱PMA+8-Br-cGMP诱导的粘蛋白分泌，而对照寡核苷酸没有效果。
MARCKS作为介导PKC和PKG途径交互作用(cross-talk)的集合信号转导分子
[000110]总起来说，上述结果证明MARCKS全面参与粘蛋白分泌过程。然后本发明人阐明MARCKS如何作为PKC和PKG集合的关键调节分子来调节粘蛋白分泌。如图5所示，MARCKS被PKC磷酸化，因此从膜移位到细胞质。在这里，PKG诱导MARCKS的脱磷酸作用(图5A，第4道，和图5B)。这种脱磷酸作用可以被PKG抑制剂Rp-8-Br-PET-cGMP(图5A，第5道)逆转，表明所述脱磷酸作用是特异性PKG依赖的。在图5中，NHBE细胞用[³²P]正磷酸盐标记，然后接触指定的试剂。通过免疫沉淀分析评估响应所述处理的MARCKS磷酸化作用。在图5A中，8-Br-cGMP逆转PMA诱导的MARCKS磷酸化，而8-Br-cGMP的这种作用能够被Rp-8-Br-PET-cGMP(PKG抑制剂)或者冈田酸(PP1/2A抑制剂)阻断。在图5B中，MARCKS的PMA-诱导磷酸化被后续细胞暴露于8-Br-cGMP所逆转。第1道，单独的培养基8分钟；第2道，100nM PMA 3分钟；第3道，100nM PMA 3分钟然后与1μM 8-Br-cGMP 5分钟；第4道，100nM PMA 8分钟；第5道，单独的培养基3分钟然后100nM PMA+1μM 8-Br-cGMP 5分钟。在图5C中，8-Br-cGMP-诱导的MARCKS脱磷酸作用被福司曲星(fostriecin)以浓度依赖的方式减弱。
[000111]普遍认为PKG通过蛋白磷酸酶的活化来使MARCKS去磷酸化。如图5A(第6道)所示，500nM(能够抑制PP1和PP2A的浓度)的冈田酸阻断PKG诱导的MARCKS脱磷酸作用，表明PKG通过活化PP1和/或PP2A造成脱磷酸。利用福司曲星和磷酸酶直接分析的进一步研究表明只有PP2A被PKG活化，并且引起MARCKS的磷酸基去除(图5C)。如图6所示，很可能在抑制PKG诱导的MARCKS脱磷酸作用的浓度，冈田酸或者福司曲星减弱PMA+8-Br-cGMP或者UTP诱导的粘蛋白分泌。图6有助于证明PP2A是粘蛋白分泌途径的主要成分。NHBE细胞与指定浓度的福司曲星、冈田酸(500nM)或者单独的培养基预保温15分钟，然后用PMA(100nM)+8-Br-cGMP(1μm)刺激15分钟或者用UTP(500μM)刺激2小时。通过ELISA测量分泌的粘蛋白。数据表示为平均代表+-.S.E.(每点n＝6)，其中*代表显著不同于培养基对照(p<0.05)；代表显著不同于PMA+8-Br-cGMP刺激(p<0.05)；和代表显著不同于UTP刺激(p<0.05)。因此，PKG-活化的PP2A对MARCKS的脱磷酸作用成为是导致粘蛋白颗粒胞吐作用的信号途径的主要组成部分。
[000112]为了弄清通过何种分子事件MARCKS将激酶活化与粘蛋白分泌联系起来，彻底研究了响应PKC/PKG活化的MARCKS的磷酸化。如图4A所示，PMA(100nM)在NHBE细胞中可能诱导MARCKS磷酸化的显著增加(3-4倍)，而这种磷酸化被PKC抑制剂calphostin C(500nM)减弱。一旦被磷酸化，MARCKS从质膜移位到细胞质(图4B)。更具体地，图4A显示PKC的活化导致NHBE细胞中MARCKS的磷酸化。细胞用[³²P]正磷酸盐标记2小时，然后接触刺激剂和/或抑制剂。按照描述通过免疫沉淀评估响应所述处理的MARCKS磷酸化作用。第1道，培养基对照；第2道，赋形剂，0.1％ Me.sub.2SO；第3道，100nM 4α-PMA；第4道，100nM PMA；第5道，100nM PMA+500nM calphostin C；第6道，500nM calphostin C。图4B显示磷酸化的MARCKS从质膜移位到细胞质。³²p标记的细胞接触PMA(100nM)或者单独的培养基5分钟，然后分离膜和胞浆部分。8-Br-cGMP(1μM)对PKG的活化，引起粘蛋白分泌必需的另一起激酶活化事件，不导致MARCKS磷酸化，但实际上，观察到相反的作用：PMA诱导的MARCKS磷酸化被8-Br-cGMP逆转(图5A)。8-Br-cGMP的这种作用不是归因于PKC活性的抑制，因为PMA诱导的磷酸化能够被后续向细胞中添加8-Br-cGMP来逆转(图5B)。因此，PKG活化有可能导致MARCKS的脱磷酸作用。
[000113]进一步的研究显示PKG诱导的MARCKS脱磷酸作用被500nM冈田酸阻断，所述冈田酸是蛋白磷酸酶(1和/或2A型(PP1/2A))抑制剂(图5A，第6道)。因此，看起来脱磷酸作用通过PP1和/或PP2A介导。为了确定涉及的蛋白磷酸酶的亚型，在其他的磷酸化研究中使用一种新的并且更特异的PP2A抑制剂，福司曲星(IC₅₀＝3.2nM)。如图5C所示，福司曲星以浓度依赖的方式(1-500nM)抑制PKG诱导的MARCKS脱磷酸作用，表明PKG通过PP2A的活化诱导脱磷酸作用。为了证实NHBE细胞中PKG对PP2A的进一步活化，在细胞接触8-Br-cGMP后测定细胞溶质PP1和PP2A的活性。在低至0.1.mu.M的8-Br-cGMP浓度，PP2A活性增加大约3倍(从0.1到0.3nmol/分钟/mg蛋白，p<0.01)，而PP1活性仍然没有改变。该数据表明PP2A可以被PKG活化，并且造成MARCKS的脱磷酸化作用。因此，这种PP2A活性对粘蛋白分泌的发生非常关键；当PKG诱导的MARCKS脱磷酸作用被冈田酸或者福司曲星阻断时，响应PKC/PKG活化或者UTP刺激的分泌被改善(图6)。
MARCKS与细胞质中的肌动蛋白和肌球蛋白结合
[000114]图7显示放射标记的免疫沉淀分析，其表明MARCKS可以与细胞质中的两种其他蛋白(大约200和大约40kDa)结合。在图7中，NHBE细胞用[³H]亮氨酸和[³H]脯氨酸标记过夜，然后按照“实验步骤”的描述制备膜和胞浆部分。分离的部分用非免疫的对照抗体(6F6)预清除。所述胞浆然后被等分成两个部分，分别用于在10μM细胞松弛素D(Biomol，PlymouthMeeting，Pa.)以及抗MARCKS抗体2F12(第2道)和未免疫对照抗体6F6(lane 3)存在条件下进行的免疫沉淀。还利用抗体2F12通过免疫沉淀评价膜部分的MARCKS蛋白(第1道)。所述沉淀的蛋白复合物经过8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨，并通过增强放射自显影术显像。MARCKS看起来分别与分子量为大约200和大约40kDa的两种胞质蛋白结合。从凝胶上切下这两种MARCKS结合蛋白，并通过基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱/内部测序(洛克斐勒大学的蛋白/DNA技术中心(Protein/DNATechnology Center of Rockefeller University，N.Y.))进行分析。通过因特网程序ProFound and MS-Fit，利用得到的肽分子量和序列数据搜索蛋白数据库。结果表明它们分别是肌球蛋白(重链，非肌肉型A)和肌动蛋白。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱/内部测序分析表明这两种MARCKS结合蛋白分别是肌球蛋白(重链，非肌肉型A)和肌动蛋白。
[000115]这些研究提供一种控制气道粘蛋白颗粒胞吐分泌的信号转导机制的新范式，以及提供被认为是证明MARCKS在生理过程中特异生物功能的第一个直接证据。MARCKS作为关键介质分子调节人气道上皮细胞的粘蛋白颗粒释放。普遍认为气道粘蛋白分泌的引发需要PKC和PKG的双重活化和协同作用。活化的PKC磷酸化MARCKS，导致MARCKS从质膜内表面移位到细胞质。PKG的活化依次活化PP2A，然后PP2A去磷酸化细胞质中的MARCKS。因为MARCKS的膜结合能力取决于其磷酸化状态，这种脱磷酸作用允许MARCKS恢复其膜结合能力，并且使MARCKS能够粘附到细胞质粘蛋白颗粒的膜上。还通过与细胞质中肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用(图7)，然后MARCKS能够将颗粒栓系到细胞收缩装置，介导到细胞外围的颗粒运动和后续的胞吐释放。MARCKS的广泛分布表明，有可能这种或者类似的机制可以在正常或者病理条件下调节不同细胞类型中膜结合颗粒的分泌。
[000116]本发明还涉及一种阻断任意细胞胞吐分泌过程的新方法，尤其涉及炎性细胞内包含的颗粒的炎性介质释放，所述刺激途径涉及蛋白激酶C(PKC)底物MARCKS蛋白和膜结合囊泡的内容物释放。具体地，本发明人证明，人(图9)或者犬(图10)中性粒细胞的炎性介质髓过氧化物酶的受激释放被MANS肽以浓度依赖的方式阻断。具体地，图9显示被100nMPMA和10.mu.M 8-Br-cGMP刺激分泌髓过氧化物酶(MPO)的分离的中性粒细胞。相对对照水平，100μM MANS肽减少MPO的分泌(^*＝p<0.05)。10μMMANS造成MPO分泌的轻微下降。10或者100μM的对照肽(RNS)对MPO分泌没有效果。在图10中，分离的中性粒细胞被100nM PMA和10μM8-Br-cGMP刺激分泌髓过氧化物酶(MPO)。相对对照水平，100μM MANS肽减少MPO的分泌(^*＝p<0.05)。10μM MANS造成MPO分泌的轻微下降。10或者100μM的对照肽(RNS)对MPO分泌没有效果。因此，可以治疗性使用所述肽以阻断任意组织中浸润炎性细胞分泌的炎症介质的释放。许多这类被释放的介质造成各种慢性炎性疾病(即，呼吸性疾病例如哮喘，慢性支气管炎和COPD，炎性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病，自身免疫病，皮肤病例如红斑痤疮，湿疹；和重度痤疮，关节炎和疼痛综合症例如类风湿性关节炎和纤维肌痛)中观察到的大范围组织损伤。本发明可用于治疗疾病关节炎、慢性支气管炎、COPD和囊性纤维化。因此本发明可用于人类和动物疾病的治疗，尤其是那些影响马、犬、猫和其他家庭宠物的疾病。
[000117]图11-15显示人和犬的MPO分泌。在所有这些实验中，在添加如图所示的刺激剂前，分离的中性粒细胞用浓度为1×10^-6M的LPS在37℃刺激10分钟。LPS激发细胞使它们能够对促分泌剂做出应答。
[000118]在一个实施方式中，本发明公开一种调节对象炎症的方法，包括给药治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括MANS肽或者其活性片段。在该实施方式的一方面，MANS蛋白的所述活性片段包括至少6个氨基酸。另一方面，所述炎症由呼吸性疾病、肠疾病、皮肤病、自身免疫病和疼痛综合症造成。另一方面，所述呼吸系统疾病选自哮喘、慢性支气管炎和COPD。另一方面，所述肠疾病选自溃疡性结肠炎、克罗恩氏病和肠易激综合征。另一方面，所述皮肤病选自红斑痤疮、湿疹、银屑病和重度痤疮。另一方面，所述炎症由关节炎或者囊性纤维化造成。另一方面，所述对象是哺乳动物。此外，另一方面，所述哺乳动物选自人、犬、马和猫。另一方面，所述给药步骤选自局部给药、经肠胃外给药、经直肠给药、经肺部给药、经鼻给药和口服给药。另一方面，所述经肺部给药选自气雾剂给药、干粉吸入器给药、定量吸入器给药和喷雾器给药。
[000119]在另一个实施方式中，本发明公开一种调节对象细胞分泌过程的方法，包括给药治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括至少一种包括MANS肽或者其活性片段的化合物，所述MANS肽或者其活性片段调节对象的炎性介质。在该实施方式的一方面，MANS蛋白的所述活性片段包括至少6个氨基酸。另一方面，所述调节细胞分泌过程是阻断或者减少细胞分泌过程。另一方面，所述炎性介质由呼吸性疾病、肠疾病、皮肤病、自身免疫病和疼痛综合症造成。另一方面，所述呼吸系统疾病选自哮喘、慢性支气管炎和COPD。另一方面，所述肠疾病选自溃疡性结肠炎、克罗恩氏病和肠易激综合征。另一方面，所述皮肤病选自红斑痤疮、湿疹、银屑病和重度痤疮。另一方面，所述炎性介质由关节炎或者囊性纤维化造成。另一方面，所述对象是哺乳动物。另一方面，所述哺乳动物选自人、犬、马和猫。另一方面，所述给药步骤选自局部给药、经肠胃外给药、经直肠给药、经肺部给药、经鼻给药和口服给药。另一方面，所述肺部给药选自气雾剂给药、干粉吸入器给药、定量吸入器给药和喷雾器给药。
[000120]在另一个实施方式中，本发明公开一种减轻对象炎症的方法，包括给药治疗有效量的抑制与MARCKS相关的炎性介质释放的化合物，由此对象的炎性介质释放相对于没有所述治疗时存在的炎性介质释放降低。在该实施方式的一方面，所述化合物是MARCKS蛋白的至少一个活性片段。另一方面，所述所述活性片段的长度为至少6个氨基酸。另一方面，所述化合物是MANS肽或者其活性片段。另一方面，所述化合物是针对MARCKS蛋白或者其活性片段的编码序列的反义寡核苷酸。另一方面，所述所述活性片段的长度为至少6个氨基酸。
[000121]在另一个实施方式中，本发明公开一种减轻对象炎症的方法，包括给药治疗有效量的药学活性组合物，所述组合物包括抑制与MARCKS相关的炎性介质释放的化合物，由此对象的炎症相对于没有所述治疗时发生的炎症减轻。在该实施方式的一方面，所述化合物是MARCKS蛋白的活性片段。另一方面，所述所述活性片段的长度为至少6个氨基酸。另一方面，所述化合物是MANS肽或者其活性片段。另一方面，所述化合物是针对MARCKS蛋白或者其活性片段的编码序列的反义寡核苷酸。另一方面，所述所述活性片段的长度为至少6个氨基酸。本发明旨在包括一种组合物及其在抑制炎性细胞的颗粒或者囊泡释放炎性介质的治疗中的用途，所述组合物包含一种或者多种MANS肽或者其活性片段。
[000122]在另一个实施方式中，本发明公开一种调节对象粘蛋白颗粒释放的方法，包括给药调节粘蛋白颗粒释放的化合物，由此粘蛋白颗粒相对于没有所述化合物的情况下的减少。在该实施方式的一方面，所述化合物是MARCKS蛋白的活性片段。另一方面，所述化合物是MANS肽。
[000123]在另一个实施方式中，本发明公开一种调节对象的气道粘蛋白颗粒胞吐分泌的方法，包括：给药调节粘蛋白颗粒释放的化合物，由此粘蛋白颗粒相对于没有所述化合物的情况下的减少。在该实施方式的一方面，所述化合物是MARCKS蛋白的活性片段。另一方面，所述化合物是MANS肽。
[000124]在另一个实施方式中，本发明公开一种调节对象粘液分泌的方法，包括：给药治疗量的与编码MARCKS蛋白或者其活性片段的序列互补的反义序列，其中与没有这种给药的情况下发生的粘液分泌相比，所述细胞的粘液分泌被抑制。在该实施方式的一方面，所述序列至少长18个核酸。另一方面，所述化合物与编码MANS肽或者其活性片段的序列互补。另一方面，所述调节粘液分泌是阻断或者减少粘液分泌。
[000125]在另一个实施方式中，本发明公开一种减轻或者抑制对象炎症的方法，包括给药治疗有效量的至少一种肽以有效调节炎症部位的炎性介质，所述肽包括MANS肽或者其活性片段。在该实施方式的一方面，所述活性片段的长度为至少6个氨基酸。另一方面，所述炎性介质由选自中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和白细胞的细胞产生。优选的细胞是白细胞，更优选的是粒细胞，并且甚至更优选的是中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或者其组合。另一方面，所述药剂通过口、非肠胃、腔、直肠或者通过气道给药。另一方面，所述组合物还包括选自抗生素、抗病毒化合物、抗寄生虫化合物、抗炎化合物和免疫抑制剂的第二分子。
[000126]MANS肽的活性片段可以选自下列序列的肉豆蔻酰化肽：SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ IDNO：17，SEQ ID NO：18和SEQ ID NO 19。
[000127]在本发明的另一方面，本发明公开的方法可以通过使用或者给药本发明公开的肽的组合实现，即，通过使用或者给药选自下列序列的肽：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO 19，和其组合。优选的按照本文公开的方法使用或者给药单一肽。
[000128]通过与MARCKS蛋白N末端区相同的肽预保温和共保温，细胞中响应于炎性刺激剂造成的蛋白激酶C(PKC)活化的脱颗粒作用被减弱，所述细胞选自中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞，其中所述肽选自MANS肽(SEQ ID NO：1)及其肉豆蔻酰化的N端片段(SEQ IDNO：3到19)。尽管细胞类型间的时程和浓度不同，但在所有情况下MANS肽减弱PKC诱导的脱颗粒作用。
方法和材料
[000129]NHBE细胞培养--按照先前的描述进行NHBE细胞在空气/液体界面的扩增、低温保存和培养。参见，Krunkosky等。简单来说，将NHBE细胞(Clonetics，San Diego，Calif.)种于通气的T75组织培养烧瓶(500细胞/cm²)，并培养直至细胞达到75-80％的汇合度。然后利用胰蛋白酶/EDTA解离细胞，当传代2次后冷冻。气/液界面培养起始于将传代2次的细胞(2×10⁴细胞/cm²)种于TRANSWELL透明培养池(Costar，Cambridge，Mass.)，所述培养池用I型鼠尾胶原(Collaborative Biomedical，Bedford，Mass.)包被。细胞在湿润的95％空气、5％ CO₂环境下浸入培养基中培养5-7天直到几乎汇合。此时，通过去除顶部培养基并在基底外侧部(basalaterally)饲养细胞产生气/液界面。此后每天更换培养基。细胞再培养14天以便完全分化。
[000130]通过ELISA测量粘蛋白分泌--在收集“基线”和“测试”粘蛋白样品前，通过用pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤去除细胞顶部表面积聚的粘液。为了收集基线分泌，细胞与培养基单独保温，收集并保存在培养基顶部分泌的粘蛋白。细胞休息24小时，然后接触包含所选刺激剂和/或抑制剂(或者合适的对照)的培养基，之后收集并保存分泌的粘蛋白作为测试样品。所述基线和测试样品的保温时间是相同的，但根据使用的测试剂会改变。利用本领域已知的抗体捕获方法通过ELISA分析基线和测试分泌。参见，例如，Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，pp.570-573，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)。该分析中的一抗是17Q2(Babco，Richmond，Calif.)，一种与人气道粘蛋白上的糖表位特异反应的单克隆抗体。测试/基线粘蛋白的比例，类似于“分泌指数”，被用于定量粘蛋白分泌，允许每个培养皿作为它自己的对照，因此可以将培养孔之间差异造成的偏差最小化。Wright等，Am.J.Physiol.271，L854-L861(1996)。粘蛋白分泌的水平用培养基对照的百分比来表示。
[000131]放射标记的免疫沉淀分析--当用[³²P]磷酸酯标记时，细胞在包含0.2％牛血清白蛋白的无磷酸盐Dulbecco′s改良的Eagle′s培养基中预保温2小时，然后用0.1mCi/ml[³²P]正磷酸盐(9000Ci/mmol，PerkinElmer LifeSciences)标记2小时。为了用[³H]肉豆蔻酸³H-氨基酸标记，细胞在包含50μCi/ml[³H]肉豆蔻酸(49Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)或者0.2mCi/ml[³H]亮氨酸(159 Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)加0.4mCi/ml[³H]脯氨酸(100 Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)的培养基中保温过夜。标记后，细胞接触刺激剂5分钟。当使用抑制剂时，在刺激前细胞与抑制剂预保温15分钟。处理结束时，在包含50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1mMEDTA、10％甘油、1％ Nonidet P-40、1mM苯甲基磺酰氟、1mM苯甲脒、10μg/ml抑胃肽A和10μg/ml亮肽素的缓冲液中裂解细胞。三氯乙酸沉淀和闪烁计数可以确定每个培养物中的放射性标记效率。利用包含相等计数/分钟的细胞裂解产物，按照Spizz和Blackshear的方法进行MARCKS蛋白的免疫沉淀。Spizz等，J.Biol.Chem.271，553-562(1996)。沉淀蛋白经8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨，并通过放射自显影术显像。该分析使用抗人MARCKS抗体(2F12)和未免疫的对照抗体(6F6)。
[000132]为了评价在不同亚细胞部分的MARCKS或者MARCKS结合蛋白复合物，将放射标记并处理过的细胞刮入匀浆缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM NaCl，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟，1mM苯甲脒，10μg/ml抑胃肽A，10μg/ml亮肽素)，然后通过氮空化破坏(4℃ 800磅/平方英寸20分钟)。细胞裂解产物在4℃ 600×g离心10分钟以去除细胞核和未被打破的细胞。通过在4℃ 400,000×g超速离心30分钟，将去核后上清分为膜和胞浆部分。通过超声处理在溶解缓冲液中溶解所述膜沉淀。然后如上所述进行免疫沉淀。
[000133]MARCKS相关肽--肉豆蔻酰化N端序列(MANS)和随机N端序列(RNS)肽均在Genemed Synthesis，Inc.(San Francisco，Calif.)和合成，然后通过高压液相层析纯化(>95％纯)，并且通过质谱分析确认，每个均显示具有适当分子量的单一峰。所述MANS肽包括与MARCKS前24个氨基酸相同的序列，即介导MARCKS插入膜的肉豆蔻酰化MARCKS N端区，MA-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1(其中MA＝N端肉豆蔻酸酯链)。相应的对照肽(RNS)包含和MANS相同的氨基酸组成，但是按照随机顺序排列，MA-GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF(SEQ IDNO：2)。这些合成肽中疏水性肉豆蔻酸酯部分的存在能够增强它们对质膜的渗透性，从而使所述肽能够被细胞轻易摄取。为了确定这些肽对粘蛋白分泌的作用，在添加促分泌剂前细胞与所述肽预保温15分钟，然后通过ELISA测量粘蛋白分泌。
[000134]反义寡核苷酸--MARCKS反义寡核苷酸和其相应的对照寡核苷酸在Biognostik GmbH(Gottingen，Germany)合成。NHBE细胞用5μM反义或者对照寡核苷酸在顶部(apically)处理3天(前24小时存在2μg/ml lipofectin)。细胞然后与促分泌剂保温，并通过ELISA测量粘蛋白分泌。从被处理的细胞分离总RNA和蛋白。利用人MARCKS cDNA作为探针，按照常规步骤通过Northern杂交检测MARCKS mRNA。利用纯化的抗MARCKS IgG1(克隆2F12)作为第一检测抗体，通过Western印迹测定MARCKS蛋白水平。
[000135]瞬时转染--MARCKS的磷酸化位点结构域(PSD)包含PKC依赖的磷酸化位点和肌动蛋白丝结合位点。为了构建去除PSD的MARCKS cDNA，利用聚合酶链式反应产生PSD序列(编码25个氨基酸)侧翼的两个片段，然后通过XhoI位点连接，所述XhoI位点粘附在为聚合酶链式反应设计的寡核苷酸引物的5′端。生成的突变cDNA和野生型MARCKS cDNA均被插入哺乳动物表达载体pcDNA4/TO(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)。通过限制性消化和DNA测序确认分离的重组构建体。
[000136]HBE1是一种乳头状瘤病毒转化的人支气管上皮细胞系，当在气/液界面培养时能够分泌粘蛋白。按照制造商的说明书利用Effectene转染剂(Qiagen，Valencia，Calif.)进行HBE1细胞的转染。简单来说，在气/液界面生长的HBE1细胞通过胰蛋白酶/EDTA解离，然后再按照1×10⁵细胞/cm²种于12孔培养板。过夜保温后，细胞用野生型MARCKS cDNA、PSD-截短的MARCKS cDNA或者载体DNA转染。培养细胞48小时以允许基因表达，然后接触促分泌剂，并通过ELISA测量粘蛋白分泌。全部转染均在pcDNA4/TO/lacZ质粒(Invitrogen)(DNA比例6:1，共1μgDNA，DNA对Effectene试剂的比例＝1:25)存在的条件下进行以监控转染效率的变化。结果显示从转染细胞分离的细胞裂解产物中β-半乳糖苷酶活性没有显著差异，表明不同的DNA构建体间转染效率相似(数据未显示)。
[000137]蛋白磷酸酶活性分析--按照本领域已知的并进行轻微改变，利用蛋白磷酸酶分析系统(Life Technologies，Inc.)测量PP1和PP2A活性。Huang等，Adv.Exp.Med Biol.396，209-215(1996)。简单来说，NHBE细胞用8-Br-cGMP或者单独的培养基处理5分钟。细胞然后被刮入溶解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.4)，0.1％β-巯基乙醇，0.1mM EDTA，1mM苯甲脒，10μg/ml抑胃肽A，10μg/ml亮肽素)，并在4℃通过超声处理20秒进行破坏。离心细胞裂解产物，并收集上清用于磷酸酶活性分析。利用³²P标记的磷酸化酶A作为底物进行所述分析。通过闪烁计数释放的³²P_i。通过Bradford分析测定每个样品的蛋白浓度。PP2A活性表示为样品总磷酸酶活性减去存在1nM冈田酸的条件下仍然保留的活性。PP1活性表示为分别存在1nM和1μM冈田酸条件下仍然保留的活性之间的差异。蛋白磷酸酶活性表示为每分钟/mg总蛋白释放的P_inmol。
[000138]细胞毒性分析--通过测量来自细胞的乳酸脱氢酶的总释放量，检查所有用于处理NHBE细胞的试剂的细胞毒性。按照制造商的说明书利用Promega Cytotox 96试剂盒进行所述分析。全部实验都是用处于非细胞毒性浓度的试剂进行。
[000139]统计分析--通过Bonferroni检验后修正(post-test corrections)利用单向方差分析来分析数据的显著性。在p<0.05时处理之间的差异被认为是显著的。
[000140]犬血液中PMNs的分离--分离PMN的步骤包括收集10ml ACD抗凝血。然后将5ml平铺在3.5ml PMN分离培养基上，并确保PMN分离培养基(IM)处于室温(RI)。然后，所述血在1700rpms 550×g室温下离心30分钟。将更低的白色带转移到15ml尖底离心管(CCFT)。然后，添加包含10％胎牛血清(PBS)的2倍体积HESS，在1400RPMs 400×g室温下离心10分钟。沉淀然后重悬于5ml含有PBS的HESS。向包含20ml冰0.88％ NH₄Cl的50ml CCFT中添加所述细胞悬液，翻转2到3次。所获产物在2000RPMs800×g离心10分钟，然后吸出并重悬于5ml含有FBS的HBSS。通过计数和细胞离心涂片器检测所述产物，优选的对于全血，细胞数目应该在10⁹-10¹¹个细胞之间，而对于PMNs，细胞数目应该在2-4×10⁷个细胞之间。一般参见Wang等，J.Immunol.，＂Neutrophil-induced changes in thebiomechanical properties of endothelial cells：roles of ICAM-1 and reactiveoxygen species，＂6487-94(2000)。
[000141]MPO比色酶分析--利用夹心ELISA试剂盒(R & D Systems，Minneapolis，Minn.)在96孔圆底微量滴定板中分析样品的MPO活性。简单来说，20微升样品与180微升底物混合物在独立的微量滴定孔中混合，所述底物混合物包含33mM磷酸钾，pH6.0，0.56％ Triton X-100，0.11mM过氧化氢和0.36mM O-Diannisidine二盐酸盐。分析混合物中的终浓度是：30mM磷酸钾，pH6.0，0.05％ Triton X-100，0.1mM过氧化氢和0.32mMO-Diannisidine二盐酸盐。混合后，所述分析混合物在室温下保温5分钟，利用分光光度计在550纳米测定MPO酶活性。样品一式两份进行分析。
炎性介质分泌研究
[000142]使用4种不同的白细胞类型或者模型，所述白细胞类型或者模型响应佛波酯诱导的PKC活化分泌特定颗粒内容物。从人血液分离中性粒细胞，并检测这些细胞在体外的MPO释放。还鉴定商品化提供的人白细胞系中膜结合炎性介质的释放。人前髓细胞性细胞系HL-60克隆15可用于检测EPO的分泌(Fischkoff SA.Graded increase in probability of eosinophilicdifferentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells induced by culture underalkaline conditions.Leuk Res 1988；12：679-686；Rosenberg HF，Ackerman S J，Tenen DG.Human eosinophil cationic protein：molecular cloning of a cytotoxinand helminthotoxin with ribonuclease activity.J Exp Med 1989；170：163-176；Tiffany HL，Li F，Rosenberg HF.Hyperglycosylation of eosinophilribonucleases in a promyelocytic leukemia cell line and in differentiatedperipheral blood progenitor cells.J Leukoc Biol 1995；58：49-54；Badewa AP，Hudson CE，Heiman AS.Regulatory effects of eotaxin，eotaxin-2，and eotaxin-3on eosinophil degranulation and superoxide anion generation.Exp Biol Med2002；227：645-651)。单核细胞性白血病细胞系U937被用于检测溶菌酶的分泌(Hoff T，Spencker T，Emmendoerffer A.，Goppelt-Struebe M.Effects ofglucocorticoids on the TPA-induced monocytic differentiation.J Leukoc Biol1992；52：173-182；Balboa M A，Saez Y，Balsinde J.Calcium-independentphospholipase A2 is required for lysozyme secretion in U937 promonocytes.JImmunol 2003；170：5276-5280；Sundstrom C，Nilsson K.Establishment andcharacterization of a human histiocytic lymphoma cell line(U-937).Int J Cancer1976；17：565-577)。淋巴细胞天然杀伤细胞系NK-92被用于评价粒酶的释放(Gong JH.，Maki G，Klingemann HG.Characterization of a human cell line(NK-92)with phenotypical and functional characteristics of activated naturalkiller cells.Leukemia 1994；8：652-658；Maki G，Klingemann HG，Martinson JA，Tam YK.Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killercell line，NK-92.J Hematother Stem Cell Res 2001；10：369-383；Takayama H，Trenn G，Sitkovsky MV.A novel cytotoxic T lymphocyte activation assay.JImmunol Methods 1987；104：183-190)。在所有情况下，所述细胞与较大浓度范围的合成肽或者错义对照肽预保温，所述合成肽与24个氨基酸的MARCKS N端[MANS-肉豆蔻酰化的N端序列肽；MA-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ IN NO：1)]相同，其中MA是通过酰胺键与肽的N端胺连接的肉肉豆蔻酰，所述错义对照肽[RNS：随机N端序列肽；MA-GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF(SEQ ID NO：2)]包括相同的24个氨基酸，但是按照随机顺序序列排列，所述随机顺序序列与MANS肽序列具有低于13％的序列同一性。
[000143]在各种细胞类型中，MANS，但不是RNS，以浓度依赖的方式减弱炎性介质的释放。观察到的有效时程是0.5-3.0小时。所述结果与MARCKS蛋白的N端区参与导致白细胞脱颗粒的胞内途径吻合。
[000144]人中性粒细胞分离-这些研究得到州立北卡罗来纳大学(NCSU)人类研究伦理审查委员会(Institutional Review Board，IRB)的批准。按照先前的描述(参见Takashi S，OkuboY，Horie S.Contribution of CD54 to humaneosinophil and neutrophil superoxide production.J Appl Physiol 2001；91：613-622)，并进行轻微改变，分离人中性粒细胞。简单来说，从正常的健康志愿者获得肝素化的静脉血，按照1:1比例用RPMI-1640(Cellgro；Mediatech，Inc.，Herndon，VA)稀释，平铺在Histopaque(密度，1.077g/ml；Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO)并在4℃ 400g离心20分钟。小心去除界面处的上清和单核细胞，然后在预冷的蒸馏水中裂解沉淀物中的红细胞。分离的粒细胞用Hanks′平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次，在冰上重悬于HBSS。用于实验的中性粒细胞纯度>98％，嗜酸性粒细胞污染<2％，并且通过台盼蓝染料排除法确定活性>99％。
[000145]释放的中性粒细胞MPO活性的测量-对于MPO释放的测量，悬浮在HBSS中纯化人中性粒细胞按照4×10⁶细胞/ml被等分到15ml管中，并与50或者100μM的MANS或者RNS肽在37℃预保温10分钟。所述细胞然后用100nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)刺激直到3小时。利用悬浮于HBSS中的纯化人中性粒细胞按照4×10⁶细胞/ml等分到15ml管，并用100nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)在没有MANS或者RNS肽的条件下刺激相同时间，建立对照参照物(PMA对照参照物)。通过将管置于冰上并在4℃ 400g离心5分钟，终止所述反应。
[000146]根据之前建立的技术(Abdel-Latif D，Steward M，Macdonald DL，Francis GA.，Dinauer MC，Lacy P.Rac2 is critical for neutrophil primarygranule exocytosis.Blood 2004；104：832-839)，利用四甲基联苯胺(TMB)分析细胞上清中的MPO活性。简单来说，100μl TMB底物溶液被添加到96孔微板中的50μl细胞上清或者标准品人MPO(EMD Biosciences，Inc.，SanDiego，CA)，然后室温下保温15分钟。通过添加50μl 1M H₂SO₄终止反应，利用分光光度微板读数器(VERSA max，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450nm读取吸光度。
白细胞培养研究。
[000147]三种类型的人白细胞系，具体的是前髓细胞性细胞系HL-60克隆15，单核细胞系U937和淋巴细胞天然杀伤细胞系NK-92均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Rockville，MD)。HL-60克隆15细胞(ATCC CRL-1964)在37℃包含5％ CO₂的环境中，在包括RPMI 1640和L-谷氨酰胺的培养基中培养，所述培养基还添加有10％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco；InvitrogenCo.，Carlsbad，CA)，50IU/ml青霉素，50μg/ml链霉素和5mM HEPES缓冲液，pH7.8。按照先前的描述(Tiffany HL，Li F，Rosenberg HF.Hyperglycosylation of eosinophil ribonucleases in a promyelocytic leukemiacell line and in differentiated peripheral blood progenitor cells.J Leukoc Biol1995；58：49-54；Tiffany HL，Alkhatib G，Combadiere C，Berger EA，MurphyPM.CC chemokine receptors 1 and 3 are differentially regulated by IL-5 duringmaturation of eosinophilic HL-60 cells.J Immunol1 998；160：1385-1392)，将细胞在包含0.5mM丁酸(Sigma-Aldrich Co.)的上述培养基中按照5×10⁵细胞/ml培养5天，以起始向嗜酸性粒细胞-样表型的最终分化。U937细胞(ATCC CRL-1593.2)在37℃5％ CO₂的环境下，在包括RPMI 1640和L-谷氨酰胺的完全培养基中生长，所述完全培养基还添加有10％ FBS，50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素。NK-92细胞(ATCC CRL-2407)在37℃包含5％ CO₂的环境中，在alpha-MEM培养基(Sigma-Aldrich Co.)中培养，所述培养基添加有20％ FBS，100U/ml白介素-2(IL-2)(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)，5×10^-5M 2-巯基乙醇，50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素。通过Wright-Giemsa-染色细胞的评定来判断细胞形态。通过台盼蓝排除法评价收集用于实验的细胞的活性，使用活性>95％的细胞群。
用于脱颗粒分析的细胞保温。
[000148]洗涤HL-60克隆15、U937和NK-92细胞，并按照2.5×10⁶细胞/ml重悬于不含酚红的RPMI-1640(Cellgro；Mediatech，Inc.)中用于所有的脱颗粒分析。15ml管中分装的细胞与指定浓度的MANS或者RNS肽在37℃预保温10分钟。所述细胞然后用PMA刺激直到2小时。分别利用HL-60克隆15、U937和NK-92细胞建立各种细胞类型的对照参照物(PMA对照参照物)，所述细胞被洗涤并按照2.5×10⁶细胞/ml重悬于不含酚红的RPMI-1640中，然后在没有MANS或者RNS肽的条件下用PMA刺激相同的时间段。通过将管置于冰上并在4℃ 400g离心细胞5分钟，终止所述反应。
[000149]为了测量中性粒细胞释放的MPO和U937细胞释放的溶菌酶，我们可分别利用标准品人MPO和卵清蛋白定量分泌。对于HL-60克隆15细胞释放的EPO和NK-92细胞释放的粒酶，没有标准品可以用来定量。因此，测量释放的和胞内的(来自裂解的细胞)EPO和粒酶的水平，释放的EPO和粒酶分别表示为总数的百分比(胞内的和释放的)。为了测量HL-60克隆15细胞的胞内EPO和NK-92细胞的胞内粒酶，如下所述提取适量0.1％triton X-100裂解的细胞用于胞内颗粒蛋白的定量。所有处理均表示为对照的百分比以最小化培养物间的差异性。
HL-60EPO释放的测量。
[000150]按照先前建立的技术(Lacy P，Mahmudi-Azer S，Bablitz B，Hagen SC，Velazquez JR，Man SF，Moqbel R.Rapid mobilization of intracellularly storedRANTES in response to interferon-gamma in human eosinophils.Blood 1999；94：23-32)，利用TMB分析HL-60克隆15细胞释放的EPO活性。因此，向96孔微板中的50μl(μl＝微升)样品添加100μl TMB底物溶液，并在室温保温15min(min＝分钟)。通过添加50μl 1.0M H₂SO₄终止反应，利用分光光度微板读数器在450nm(nm＝纳米)读取吸光度。利用在相同数目的tritonX-100裂解的细胞中获得的量，分泌EPO的量表示为总内容物的百分比。单核细胞溶菌酶分泌的测量。
[000151]按照先前的描述(Balboa M A，Saez Y，Balsinde J.Calcium-independent phospholipase A2 is required for lysozyme secretion inU937 promonocytes.J Immunol 2003；170：5276-5280)并进行轻微改变，利用分光光度分析测量U937细胞分泌的溶菌酶。因此，100μl样品与96孔微板中的100μl溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus，Sigma-Aldrich Co.)悬浮液(0.3mg/ml，溶于0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.0)混合。在室温测得450nm的吸光度下降。利用鸡蛋白溶菌酶(EMD Biosciences，Inc.)作为标准品绘制校准曲线。
NK细胞粒酶分泌的测量。
[000152]基本上按照先前的描述(Takayama H，Trenn G，Sitkovsky MV.Anovel cytotoxic T lymphocyte activation assay.J Immunol Methods 1987；104：183-190)，通过测量Nα-苄氧羰基-L-赖氨酸硫代苯甲酯(BLT)的水解来分析NK-92细胞的粒酶分泌。将50μl上清转移到96孔板，然后向上清中添加150μl溶于磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)的BLT溶液(0.2mM BLT；EMD Biosciences，Inc.，and 0.22mM DTNB；Sigma-Aldrich Co.)(mM＝毫摩)。室温下保温30分钟后读取410nm的吸光度。利用在相同数目的triton X-100裂解的细胞中获得的量，结果表示为总细胞酶内容物的百分比。
统计分析。
[000153]利用单向ANOVA评价不同处理组之间差异的统计显著性。P值<0.05被认为是显著的。
中性粒细胞MPO释放
[000154]发现相对于第30分钟PMA对照参照物中的对照水平，100nM PMA(作为炎性介质释放的激发剂)增加人中性粒细胞MPO释放大约三倍，3小时后MPO的释放增加到大约5-6倍。第30分钟，以无PMA和无PMA加MANS或者RNS的条件下对照MPO活性作为100％，PMA对照参照物的MPO活性大约是275％，PMA加50μM MANS条件下的所述活性大约是275％，100μM MANS条件下的所述活性大约是305％。因此，在第30分钟没有检测到MANS肽的作用。但是，到了1小时更高浓度的MANS(100μm)具有显著的抑制效果(测得大约是对照的260％)，或者相对PMA对照参照物水平(测得大约是对照的340％)MPO释放大约减少25％。50μM MANS样品测得为对照的大约290％或者相对于PMA对照参照物降低大约15％。到了2个小时并延续到第3个小时，MANS肽以浓度依赖的方式显著降低MPO活性。在第2个小时，PMA对照参照物的MPO活性是对照的大约540％，50μM MANS(测得大约为对照的375％)造成MPO释放相对于PMA对照参照物降低大约30％；和100μM MANS(测得大约为对照的295％)造成MPO释放相对于PMA对照参照物降低大约45％。在第3个小时，PMA对照参照物的MPO活性大约是对照的560％，50μM MANS(测得大约为对照的375％)造成MPO释放相对于PMA对照参照物降低大约33％；100μM MANS(测得大约为对照的320％)造成MPO释放相对于PMA对照参照物降低大约40％。在测试的任意时间点或者浓度，RNS肽均不影响PMA诱导的MPO释放。
HL-60EPO释放
[000155]在PMA刺激后的第1个和第2个小时，HL-60克隆15细胞上清中的EPO活性显著增加。在第1个小时，相对于作为100％的EPO活性对照，PMA对照参照物测得大约为110％；包含10μM MANS的样品测得大约为95％，EPO活性相对于PMA对照参照物降低大约15％；包含50μMMANS的样品测得大约为78％，EPO活性相对于PMA对照参照物降低大约30％；和包含100μM MANS的样品测得大约为65％，EPO活性相对于PMA对照参照物降低大约40％。在第2个小时，相对于作为100％的EPO活性对照，PMA对照参照物测得大约为145％；包含10μM MANS的样品测得大约为130％，EPO活性相对于PMA对照参照物降低大约10％；包含50μM MANS的样品测得大约为70％，EPO活性相对于PMA对照参照物降低大约50％；和包含100μM MANS的样品测得大约为72％，EPO活性相对于PMA对照参照物降低大约50％。因此，在第1个和第2个小时50或者100μM的MANS显著减少EPO释放。在测试的任意时间点或者浓度，RNS肽均不影响PMA增强的EPO释放。
U937溶菌酶释放
[000156]U937细胞的溶菌酶分泌在保温小时后因PMA刺激而增加，在第2个小时增加更多。在第1个小时，相对于作为100％的U937细胞的溶菌酶分泌对照，PMA对照参照物测得大约为210％；包含10μM MANS的样品测得大约为170％，U937细胞的溶菌酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约20％；包含50μM MANS的样品测得大约为170％，U937细胞的溶菌酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约20％；和包含100μM MANS的样品测得大约为115％，U937细胞的溶菌酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约45％。在第2个小时，相对于作为100％的U937细胞的溶菌酶分泌对照，PMA对照参照物测得大约为240％；包含10μM MANS的样品测得大约为195％，U937细胞的溶菌酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约20％；包含50μM MANS的样品测得大约为185％，U937细胞的溶菌酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约25％；和包含100μM MANS的样品测得大约为140％，U937细胞的溶菌酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约40％。因此，在100μM MANS刺激后1和2小时，溶菌酶分泌被显著降低，但是50或者10μM MANS达不到这样的效果。在测试的任意时间点或者浓度，RNS肽均不影响PMA增强的溶菌酶分泌。
NK细胞粒酶释放
[000157]在第1个小时，相对于作为100％的NK-92细胞的粒酶分泌对照，PMA对照参照物测得大约为125％；包含10μM MANS的样品测得大约为115％，NK-92细胞的粒酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约10％；和包含100μM MANS的样品测得大约为85％，NK-92细胞的粒酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约30％。在第2个小时，相对于作为100％的NK-92细胞的粒酶分泌对照，PMA对照参照物测得大约为220％；包含10μM MANS的样品测得大约为200％，NK-92细胞的粒酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约10％；和包含100μM MANS的样品测得大约为80％，NK-92细胞的粒酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约60％。因此，在第1个小时NK-92细胞的粒酶分泌没有因PMA而显著增加，但在第2个小时增加超过两倍。100μM MANS，但不是10μM MANS，在保温后1和2小时减少粒酶分泌。在测试的任意时间点或者浓度，RNS肽均不影响PMA增强的粒酶分泌。
细胞毒性
[000158]通过LDH保留/释放(retention/release)检测(数据未显示)(还可参见Park J-A，He F，Martin LD，Li Y，Adler KB.Human neutrophil elastaseinduces hypersecretion of mucin from human bronchial epithelial cells in vitrovia a PKC δ-mediated mechanism.Am J Pathol 2005；167：651-661)，没有一种处理在细胞中产生毒性反应。
[000159]上述实施例只是为了说明本发明，而不应被理解对其进行限制。本发明通过下列权利要求进行限定，所述权利要求的等同物也包括在其中。
序列表
<110>拜欧马克医药有限公司(BioMarck Pharmaceuticals，Ltd.)
     北卡罗来纳州大学(North Carolina State University)
<120>调节炎性介质的方法及用于该方法的肽
<130>BMRK-003/03WO
<150>US 11/367,499
<151>2006-03-06
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<170>Patent In Ver.3.3
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