用于治疗庞贝氏症的方法 相关申请的引用
本申请要求于2007年2月7日提交的美国临时专利申请No.60/900,187、于2007年1月5日提交的美国临时专利申请No.60/879,255、于2006年11月13日提交的美国临时专利申请No.60/858,514的优先权，将其每一申请的内容以其全文结合于此。本申请也涉及于2005年2月10日提交的美国专利申请No.11/057,058，将其全部内容结合于此作为参考。
【技术领域】
本发明涉及用于治疗庞贝氏症(庞皮病，Pompe disease)的方法和组合物。更具体地，本发明涉及用于通过以非甘露糖-6-磷酸依赖型(mannose-6-phosphate-independent)方式将酸性α-葡糖苷酶靶向溶酶体来治疗庞贝氏症的治疗方法。
背景技术
庞贝氏症是由溶酶体水解酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)、糖原降解溶酶体酶缺乏或功能障碍引起的常染色体隐性遗传病(基因紊乱，genetic disorder)。GAA的缺乏导致庞贝氏症患者许多组织内发生溶酶体糖原累积，伴随心肌和骨骼肌组织遭受最严重影响。所有形式的庞贝氏症的合计发生率估计为1∶40,000，且该病症影响所有群体同时无种族倾向。据估计，将近三分之一患有庞贝氏症的人群具有迅速发展的致命性幼儿发病形式，而大多数患者表现为更缓慢发展的青少期或更晚的发作形式。
药物治疗策略、饮食控制和骨髓移植被采用作为治疗庞贝氏症的手段，但是都没有显著成功的。近年来，酶替代疗法(ERT)已经提供了治疗庞贝氏症的新希望。例如，一种重组GAA蛋白药物，2006年在美国和欧洲正式批准用于患有庞贝氏症的患者。依赖于用于向溶酶体递送的GAA蛋白表面上的甘露糖-6-磷酸(M6P)。
【发明内容】
本发明提供了治疗庞贝氏症的新型和改进的方法。具体而言，本发明提供用于以非甘露糖-6-磷酸依赖性方式将酸性α-葡糖苷酶(GAA)靶向溶酶体的方法和组合物。因此，本发明的方法更简单、更有效、更具潜力和更具成本有效性。因而本发明显著地推进了用于庞贝氏症的酶替代疗法的进展。
在一个方面，本发明提供了一种通过向主体给予治疗有效量的融合蛋白而治疗主体的庞贝氏症的方法。该融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶体靶向结构域。该溶酶体靶向结构域以非甘露糖-6-磷酸依赖型方式连接人非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体。
在一个实施方式中，溶酶体靶向结构域包含成熟人胰岛素样生长因子II(IGF-II)，或成熟人IGF-II的片段或序列变体(sequencevariant)。在一个实施方式中，溶酶体靶向结构域包含成熟人IGF-II的氨基酸8-67。优选地，溶酶体靶向结构域包含成熟人IGF-II的氨基酸1和8-67(即成熟人GAA的Δ2-7)。在另一实施方式中，融合蛋白包含人GAA的氨基酸70-952。
在一个实施方式中，相比于野生型人GAA，适用于本发明的融合蛋白在该蛋白表面上具有降低的甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。在另一实施方式中，适用于本发明的融合蛋白在该蛋白表面上不具有功能性M6P水平。
在另一实施方式中，治疗有效量为在每千克主体体重约2.5～20毫克(mg/kg)的范围内。
在一个实施方式中，融合蛋白经由静脉内给药。在其他实施方式中，融合蛋白以每两月、每月、每三周、每两周、每周、每天给药或以变化的时间间隔给药。如本文中所用的，术语“每两月给药”是指每两个月给药一次(即每两个月一次)；术语“每月给药”是指每一个月给药一次；术语“每三周给药”是指每三个星期给药一次；术语“每两周给药”是指每两个星期给药一次；术语“每周给药”是指每一个星期给药一次；而术语“每天给药”是指每天给药一次。
在进一步的实施方式中，融合蛋白联合免疫抑制剂进行给药。免疫抑制剂可以在融合蛋白任何给药之前进行给药。在一些实施方式中，用于治疗庞贝氏症的方法进一步包括使主体免疫耐受(tolerizing)的附加步骤。
本发明的另一方面提供了一种通过向主体给予治疗有效量的融合蛋白而治疗主体的庞贝氏症的方法。该融合蛋白包含成熟人胰岛素样生长因子II(IGF-II)的氨基酸1和8-67(即成熟人GAA的Δ2-7)和人酸性α葡糖苷酶(GAA)的氨基酸70-952。在一个优选的实施方式中，融合蛋白包含在人GAA的氨基酸和成熟人IGF-II的氨基酸之间的间隔序列Gly-Ala-Pro。
在一个实施方式中，相比于野生型人GAA，适用于本发明的融合蛋白在该蛋白表面上具有降低地甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。在另一实施方式中，适用于本发明这个方面的融合蛋白在该蛋白表面上不具有功能性M6P水平。
本发明的另一个方面提供了一种通过向患有庞贝氏症的主体给予治疗有效量的融合蛋白而降低体内糖原水平的方法。该融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶体靶向结构域。该溶酶体靶向结构域以非甘露糖-6-磷酸依赖型方式结合人非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体。
在一个实施方式中，溶酶体靶向结构域包含成熟人胰岛素样生长因子II(IGF-II)，或成熟人IGF-II片段或序列变体。在一个实施方式中，溶酶体靶向结构域包含成熟人IGF-II的氨基酸8-67。优选地，溶酶体靶向结构域包含成熟人IGF-II的氨基酸1和8-67(即成熟人GAA的Δ2-7)。在另一优选实施方式中，融合蛋白包含人GAA的氨基酸70-952。
在一个实施方式中，相比于野生型人GAA，适用于本发明这方面的融合蛋白在该蛋白表面上具有降低的甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。在另一实施方式中，适用于本发明的融合蛋白在该蛋白表面上不具有功能性M6P水平。
在另一实施方式中，有效量为在每千克主体体重约2.5～20毫克(mg/kg)的范围内。
在一些实施方式中，融合蛋白经由静脉内给药。在其他实施方式中，融合蛋白以每两月给药、每月给药、每三周给药、每两周给药、每周给药、每天给药或以变化的时间间隔给药。
在另一个方面，本发明提供了一种通过向溶酶体靶向治疗有效量的融合蛋白而降低哺乳动物溶酶体内糖原水平的方法。该融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶体靶向结构域。该溶酶体靶向结构域以非甘露糖-6-磷酸依赖型方式结合人非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体。
在一个实施方式中，溶酶体靶向结构域包含成熟人胰岛素样生长因子II(IGF-II)，或成熟人IGF-II片段或序列变体。在一个实施方式中，溶酶体靶向结构域包含成熟人IGF-II的氨基酸8-67。优选地，溶酶体靶向结构域包含成熟人IGF-II的氨基酸1和8-67(即成熟人GAA的Δ2-7)。在另一优选实施方式中，融合蛋白包含人GAA的氨基酸70-952。
在另一个方面，本发明提供了一种通过向肌肉组织递送治疗有效量的融合蛋白而降低患有庞贝氏症的主体的肌肉组织内糖原水平的方法。该融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶体靶向结构域。该溶酶体靶向结构域以非甘露糖-6-磷酸依赖型方式结合人非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体。在一个实施方式中，肌肉组织是骨骼肌。
本发明的另一个方面提供了一种通过向主体给予治疗有效量的融合蛋白而治疗该主体内与庞贝氏症有关的心肌病(cardiomyopathy)的方法。该融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶体靶向结构域。该溶酶体靶向结构域以非甘露糖-6-磷酸依赖型方式结合人非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体。
在另一个方面，本发明提供了一种通过向主体给予治疗有效量的融合蛋白而治疗该主体内与庞贝氏症有关的肌病(myopathy)的方法。该融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶体靶向结构域。该溶酶体靶向结构域以非甘露糖-6-磷酸依赖型方式结合人非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体。
本发明的另一个方面提供了一种通过向主体给予融合蛋白而增加患有庞贝氏症的该主体内酸性α-葡糖苷酶活性的方法，该融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶体靶向结构域。该溶酶体靶向结构域以非甘露糖-6-磷酸依赖型方式结合人非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体。
本发明的另一方面提供了一种适用于治疗庞贝氏症的药物组合物。该药物组合物包含治疗有效量的融合蛋白，该融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶体靶向结构域。该溶酶体靶向结构域以非甘露糖-6-磷酸依赖型方式结合人非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体。
在一个实施方式中，溶酶体靶向结构域包含成熟人胰岛素样生长因子II(IGF-II)，或成熟人IGF-II片段或序列变体。在一个实施方式中，溶酶体靶向结构域包含成熟人IGF-II的氨基酸8-67。优选地，溶酶体靶向结构域包含成熟人IGF-II的氨基酸1和8-67(即成熟人GAA的Δ2-7)。在另一优选实施方式中，融合蛋白包含人GAA的氨基酸70-952。
在另一实施方式中，融合蛋白包含人GAA的氨基酸70-952和成熟人IGF-II的氨基酸1和8-67(即，成熟人GAA的Δ2-7)。在另一实施方式中，融合蛋白进一步包含在成熟人IGF-II的片段(氨基酸1和8-67)和人GAA片段(氨基酸70-952)之间的间隔序列Gly-Ala-Pro。
在一个实施方式中，相比于野生型人GAA，适用于本发明这个方面的融合蛋白在该蛋白表面上具有降低的甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。在另一实施方式中，适用于本发明这个方面的融合蛋白在该蛋白表面上不具有功能性M6P水平。
在另一实施方式中，该药物组合物包含药用载体。
如本申请中所用的，术语“人酸性α-葡糖苷酶(GAA)”是指人GAA的前体野生型形式、或者能够降低哺乳动物溶酶体中糖原水平或可以挽救或减轻一种或多种庞贝氏症症状的功能性变体。
如本申请中所用的，术语“约”和“大约”等同替换使用。在本申请中在有或没有约或大约的情况下使用的任何数字都意指涵盖相关领域技术人员所理解的任何正常波动范围。
本发明的其他特征、目的和优点在下文的详细描述中将会变得很明显。然而，应该理解，尽管指出了本发明的具体实施方式，但是这些详细说明仅仅是通过举例说明的方式给出，而非进行限制。根据以下详细描述，对于本领域技术人员来说，本发明范围内的各种变化和修改将会变得显而易见。
【附图说明】
附图仅仅是出于举例说明的目的，而非限制性的。
图1示出了GILT-标记的GAA ZC-701的示意图。
图2A-C示出了野生型未标记的GAA和GILT-标记的GAAZC-701的SDS-PAGE和蛋白质印迹。图2A示出了银染色之前的SDS-PAGE。图2B示出了使用抗-GAA抗体的蛋白质印迹。图2C示出了使用抗-IGF-II抗体的蛋白质印迹。
图3A示出了p1288和p1355的示意图，p1288和p1355是两种分别含野生型CI-MPR结构域10-13和点突变变体的生物素化和His-标记的重组蛋白。
图3B描述了通过银染色的1288和1355的表达。
图4A-B描述了GILT-标记的GAA ZC-701与CI-MPR相互作用的分析的示例性结果。图4A描述了IGF-II的示例性结合曲线。图4B描述了GILT-标记的GAA ZC-701的示例性结合曲线。
图5描述了将GILT-标记的GAA ZC-701的标记-依赖型摄取而进入大鼠L6成肌细胞的示例性结果。
图6描述了纯化GILT-标记的GAA ZC-701和野生型未标记GAA摄取进入大鼠L6成肌细胞的示例性饱和曲线。
图7描述了反映GILT-标记的GAA ZC-701和野生型未标记GAA(ZC-635)在大鼠L6成肌细胞中的半衰期的示例性结果。
图8A-B是显示在摄取进入大鼠L6成肌细胞之后GILT-标记的GAA ZC-701的蛋白水解加工的示例性蛋白质印迹。图8A是显示在摄取后GILT标签丧失的示例性蛋白质印迹。图8B是显示在摄取后野生型和GILT-标记的GAA进入各种肽物种中的加工的示例性蛋白质印迹。
图9描述了反映在三个不同组织培养基中产生的GILT-标记的GAA ZC-701的野生型129小鼠中的血清半衰期的示例性结果。红线对应于PF-CHO培养基，t1/2＝43min；橙线对应于CDM4培养基，t1/2＝38min；而绿线对应于CD17培养基，t1/2＝52min。
图10A-D描述了野生型未标记的GAA(ZC-635)、GILT-标记的GAA ZC-701和GILT-标记的GAA ZC-1026的庞贝氏症小鼠的各种组织中的示例性衰变曲线。图10A描述了在四头肌组织中的示例性衰变曲线。图10B描述了在心脏组织中的示例性衰变曲线。图10C描述了在隔膜组织中的示例性衰变曲线。图10D描述了在肝脏组织中的示例性衰变曲线。
图11描述了GILT-标记的GAA和溶酶体标记物LAMP1的协同定位(co-localization)。
图12描述了证实在取自用单注射GILT-标记的GAA蛋白ZC-701或未标记的GAA治疗的庞贝氏症小鼠的心脏组织样品中清除糖原的示例性结果。
图13A-H是显示在注射野生型未标记GAA或GILT-标记的GAA ZC-701之后，在庞贝氏症小鼠的各种肌肉组织中清除糖原的示例性曲线图。
图14示出了临床研究程序的详细流程图。
【具体实施方式】
本发明提供了基于非糖基化依赖型溶酶体靶向技术(GILT)的用于治疗庞贝氏症的方法和组合物。具体地，本发明提供了通过以非甘露糖-6-磷酸-依赖型方式将酸性α-葡糖苷酶靶向溶酶体而用于治疗庞贝氏症的方法和组合物。
本发明的各个方面将在以下部分详细地进行描述。使用这些部分并不意味着限制本发明。每一部分都可以适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外指出，使用的“或”都是指“和/或”之意。
庞贝氏症
庞贝氏症是一种稀有的遗传性疾病，是由于酶中缺乏需要用于破坏糖原(用于能量的糖的一种储存形式)的酸性α-葡糖苷酶(GAA)所引起的。庞贝氏症也称为糖原贮积病II型(GSD II)，II型糖原贮积病，糖原病II型，酸性麦芽糖酶缺乏症，α-1，4-葡糖苷酶缺乏症，弥漫性肝糖心肥大(cardiomegalia glycogenic diffusa)和全身性糖原病的心脏病形式。糖原的积聚引起整个身体的渐进性肌无力(肌病)并影响各个体组织，特别是心脏、骨骼肌、肝脏、呼吸和神经系统。
庞贝氏症呈现的临床表现根据发病年龄和残留GAA活性而广泛变化。残留GAA活性与糖原累积的数量和组织分布以及该疾病的严重度有关。幼发性庞贝氏症(低于正常GAA活性的1％)是最严重的形式，并且其特征是张力过低、全身性肌无力和肥厚型心肌病，以及在心脏和其它肌肉组织中出现的大量糖原累积。由于心脏呼吸障碍，所以通常会在出生后1年内就发生死亡。Hirschhorn et al.(2001)″Glycogen Storage Disease Type II：Acid Alpha-glucosidase(Acid Maltase)Deficiency，″in Scriver et al.，eds.，The Metabolic andMolecular Basis of Inherited Disease.8th Ed.，New York：McGraw-Hill，3389-3420。青少期-发作性(正常GAA活性的1％～10％)和成年期-发作性(正常GAA活性的10％～40％)庞贝氏症是更加临床多种类的，在发作年龄、临床表现和疾病进展方面具有更大的变化。青少期发作性和成年期发作性庞贝氏症总体特征是缺少严重心脏受累、更晚发病年龄和更慢的疾病进展，，但最终呼吸或肢肌受累导致显著的发病率和死亡率。尽管预期寿命可以变化，但是死亡一般会由于呼吸衰竭而发生。Hirschhorn et al.(2001)“Glycogen StorageDisease Type II：Acid Alpha-glucosidase(Acid Maltase)Deficiency，”inScriver et al.，eds.，The Metabolic and Molecular Basis of InheritedDisease.8th Ed.，New York：McGraw-Hill，3389-3420。
酶替代疗法
酶替代疗法(ERT)是一种通过向血流中灌注缺少的酶而矫正酶缺乏的治疗策略。作为血液灌注的患者组织，酶通过细胞摄取并运送到溶酶体，其中发挥作用而清除由于酶缺乏而在溶酶体中累积的物质。为了使溶酶体酶替代疗法有效，治疗用酶必须递送到在其中表现储存缺陷的组织的合适细胞中的溶酶体。传统的溶酶体酶替代疗法采用天然连接到蛋白的碳水化合物以配合靶细胞表面上的特定受体而进行递送的。一种受体，非阳离子依赖型M6P受体(CI-MPR)，特别适用于靶向替代溶酶体酶，因为CI-MPR存在于大多数细胞型的表面上。
术语“非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)”、“M6P/IGF-II受体”和“CI-MPR/IGF-II受体”在本文中可以互换使用，是指结合M6P和IGF-II二者的细胞受体。
非糖基化依赖型溶酶体靶向
本发明开发了一种非糖基化作用依赖型溶酶体靶向(GILT)技术，用于将治疗用酶靶向于溶酶体。具体而言，本发明采用了肽标签代替M6P以配合用于溶酶体靶向的CI-MPR。典型地，GILT标签是一种以非甘露糖-6-磷酸依赖型方式结合CI-MPR的蛋白、肽或其他部分。有利的是，这种技术模拟了摄取溶酶体酶的标准生物学机制，也以非甘露糖-6-磷酸依赖型方式进行。
优选的GILT标签来源于人胰岛素样生长因子II(IGF-II)。人IGF-II是CI-MPR的高亲和性配体，其也称为IGF-II受体。GILT-标记的治疗用酶与M6P/IGF-II受体的结合使得该蛋白经由胞吞途径靶向溶酶体。这种方法相对于涉及糖基化的方法具有很多优点，包括简单和成本有效性，因为一旦蛋白被分离，就不再需要做进一步的修饰。
GILT技术和GILT标签的详细描述能够在美国公开No.20030082176、20040006008、20040005309和20050281805中找到，其全部内容结合于此作为参考。
GILT-标记的GAA
通过将编码恰当GILT标签的一个盒融合到GAA-编码序列，本发明提供了一种GILT-标记的GAA，其可以以高亲和力结合CI-MPR，而不依赖于该蛋白上的M6P含量。另外，本发明提供了一种GAA制剂，其中每一种酶分子具有用于CI-MPR的高亲和力配体。正如在实施例部分所描述的，通过分析，GILT-标记的GAA对CI-MPR具有高亲和力，并且在体内从治疗上讲比传统的溶酶体酶替代疗法更有效。
GILT-标记的GAA的优异效能提供了许多临床益处。增加的效能将会简单地导致在相同或更低剂量下更有利的临床预断。GILT-标记的GAA能够更有效地递送到多个受疾病影响的组织。例如，GILT-标记的GAA可以具有向骨骼肌增加的递送，尤其是在更低的剂量下。增加的效能也可以准许剂量足够低从而最小化患者经常遭受的有害情形，以及减少针对患者体内药物的抗体的产生。增加的效能也可以准许利用在灌输之间增大的时间间隔的治疗方案。
在一个优选的实施方式中，GILT-标记的GAA包括保持切割线性寡糖中的α1-4键接的能力的人GAA、或其片段或序列变体，以及以非甘露糖-6-磷酸依赖型方式结合人CI-MPR的溶酶体靶向结构域。合适的溶酶体靶向结构域包含成熟的人IGF-II、或其片段或序列变体。
IGF-II优选特异性地靶向CI-MPR。特别有用的是在IGF-II多肽中的突变，其导致产生以高亲和力结合CI-MPR的蛋白，同时不再以明显亲和力结合其它IGF-II受体。IGF-II也能够进行修饰以最小化与血清IGF-结合蛋白的结合(Baxter(2000)Am.L PhysiolEndocrinol Metab.278(6)：967-76)，从而避免IGF-II/GILT构建体的螯合。许多研究都定位在对于与IGF结合蛋白必需的IGF-II中的残基。在这些残基处具有突变的构建体可以筛选保持对M6P/IGF-II受体的高亲和力结合以及降低对IGF-结合蛋白的亲和力。例如，据报道用Ser替代IGF-II的Phe 26能够降低IGF-II对IGFBP-1和IGFBP-6的亲和力，而不会影响对M6P/IGF-II受体的结合(Bach etal.(1993)J.Biol.Chem.268(13)：9246-54)。其它替代，例如Lys替代Glu 9，也可以是有利的。利用IGF-II高度保守的IGF-I的区域中的类似突变，单独的或者是组合的，导致IGF-BP结合的大大降低(Magee et al.(1999)Biochemistry 38(48)：15863-70)。
一种替换方法是鉴定能够以高亲和力结合到M6P/IGF-II受体的IGF-II的最小区域。在结合到M6P/IGF-II受体的IGF-II中隐含的残基大多数都在IGF-II的一个面上成簇(Terasawa et al.(1994)EMBO J.13(23)：5590-7)。尽管IGF-II三级结构一般由三个分子内二硫键维持，但是整合在IGF-II的M6P/IGF-II受体结合表面上的氨基酸序列的肽可以设计成正确地折叠并具有结合活性。这种最小结合肽是高度优选的溶酶体靶向结构域。例如，优选的溶酶体靶向结构域就是人IGF-II的氨基酸8-67。基于氨基酸48-55周围的区域，所设计的结合M6P/IGF-II受体的肽也是所期望的溶酶体靶向结构域。可替代地，可以对肽的随机文库进行筛选，以筛选经由酵母两次杂交测定或经由噬菌体显示类型测定的结合M6P/IGF-II受体的能力。
GILT标签可以融合到GAA多肽的N-端或C-端。GILT标签能够直接融合到GAA多肽或能够通过连接区(linker)或间隔区(spacer)与GAA多肽分开。氨基酸连接区并入不同于在天然蛋白质的该位置出现的氨基酸序列，并通常设计成是柔性的或者在两个蛋白部分之间插入一个结构，例如α-螺旋结构。连接区可以是相对较短的，例如序列Gly-Ala-Pro或Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro，或者可以是较长的，例如10～25个氨基酸的长度。融合接头的部位应该认真选择以促进融合伴侣的正确折叠和活性，以及防止肽标签与GAA多肽过早分离。在一个优选实施方式中，连接区序列是Gly-Ala-Pro。
能够用于本发明方法和组合物中的GILT-标记的GAA蛋白的其它构建体在美国公开No.20050244400中详细描述，其全部内容结合于此作为参考。
GILT-标记的GAA能够在各种哺乳动物细胞系中表达，包括但不限于人胚肾(HEK)293、中国仓鼠卵巢(CHO)、猴肾(COS)、HT1080、C10、HeLa(海拉)、仓鼠婴肾(BHK)、3T3、C127、CV-1、HaK、NS/O和L-929细胞。GILT-标记的GAA也能够在各种非哺乳动物宿主细胞中表达，例如昆虫(例如Sf-9、Sf-21、Hi5)、植物(例如，豆科植物(Leguminosa)、谷类植物或烟草类植物)、酵母(例如，酿酒酵母(S.cerivisae)、甲醇型酵母(P.pastoris))、原核生物(例如，大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和其它杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属)或真菌。
在一些实施方式中，GILT-标记的GAA可以利用促分泌信号肽产生，以有利于融合蛋白的分泌。例如，GILT-标记的GAA能够利用IGF-II信号肽产生。一般而言，与野生型人GAA相比，利用IGF-II信号肽生产的GILT-标记的GAA在该蛋白表面上具有降低的甘露糖-6磷酸(M6P)水平。如实施例部分中所表明的，已经通过N-连接的寡糖分析和功能性摄取测定确认，在本发明的示例性治疗用融合蛋白上不存在可检测的M6P。
本发明的GILT-GAA通常具有的特异性酶活性在约150,000～600,000nmol/h/mg蛋白的范围内，优选在约250,000～500,000nmol/h/mg蛋白的范围内。在一个实施方式中，GAA具有的特异性酶活性至少为约150,000nmol/h/mg蛋白；优选地，特异性酶活性至少为约300,000nmol/h/mg蛋白；更优选地，特异性酶活性至少为约400,000nmol/h/mg蛋白；而甚至优选地，特异性酶活性至少为约600,000nmol/h/mg蛋白。GAA活性通过GAA4MU单位定义。
庞贝氏症的治疗
本发明的方法在治疗由幼发性、青少期发作性或成年期发作性庞贝氏症侵袭的个体方面是等效的。通常，本文中描述的治疗方法和组合物在治疗患有青少期发作性-或成年期发作性庞贝氏症的个体方面可能更为有效，因为这些个体具有更高的残余GAA活性水平(分别为1％～10％和10％～40％)，因此，可能对所给予GILT-标记的GAA更具免疫耐受性。不期望受到理论的束缚，这些患者一般对于内源性GAA呈交叉反应性免疫物质(CRIM)-阳性。因此，它们的免疫系统可能不会将GILT-标记的GAA的GAA部分识别成“外来”蛋白，并且不可能形成针对对GILT-标记的GAA的GAA部分的抗体。
如本文中所用的，术语“治疗”或“处理”是指改善与该疾病相关的一种或多种症状，预防或延迟该疾病一种或多种症状的发作，和/或降低该疾病一种或多种症状的严重度或频率。例如，治疗可以是指心脏状态的改进(例如，舒张末期容积和/或收缩末期容积的增加，或者通常在庞贝氏症中发现的进展性心肌病的降低、改善或预防)或肺功能的改进(例如，啼哭肺活量比基线肺活量增加，和/或啼哭期间氧去饱和作用规范化)；在神经发育和/或运动技巧方面的改进(例如，在AIMS评分方面增加)；降低了由该病侵害的患者组织中的糖原水平；或者这些效果的任何组合。在一个优选的实施方式中，治疗包括糖原清除的改进，尤其是降低或预防庞贝氏症相关的心肌病。如本文中所用的，术语“改进”、“增加”或“降低”是指相对于基线测量值的值，例如在本文中描述的治疗开始之前的相同个体中的测定值，或者在没有本文中所描述治疗下的对照个体(或者多个对照个体)中的测定值。“对照个体”是与所治疗个体患有相同形式的庞贝氏症(幼发性的、青少期发作性的或成年期发作性)的个体，其与所治疗个体年龄大致相同(以确保在所治疗个体和对照个体中的疾病阶段是相当的)。
所治疗的个体(也称为“患者”或者“主体”)是患有庞贝氏症(即幼发性的、青少期发作性的或成年期发作性庞贝氏症)或者具有发展成为庞贝氏症可能的个体(胎儿、婴儿、小孩、青少年或成人)。个体能够具有残余的内源GAA活性，或者没有可测量的活性。例如，患有庞贝氏症的个体可以具有的GAA活性，为低于约1％的正常GAA活性(即通常与幼发性庞贝氏症相关的GAA活性)，为正常GAA活性的约1％～10％(即通常与青少期发作性庞贝氏症相关的GAA活性)，或者为正常GAA活性的约10％～40％(即通常与成年期发作性庞贝氏症相关的GAA活性)。个体可以是对内源GAA呈CRIM-阳性或CRIM-阴性。在一个实施方式中，个体对内源GAA呈CRIM-阳性。在另一个实施方式中，个体是最近诊断患有该疾病的个体。早期治疗(诊断之后就立即尽可能地开始治疗)对于最小化疾病的影响和最大化治疗效益是很重要的。
GILT-标记的GAA的给药
在本发明的方法中，GILT-标记的GAA通常是单独给予个体，或者以包含GILT-标记的GAA的组合物或药剂给药(例如在该疾病治疗的药剂生产中的)，如本文中所描述的。组合物能够用生理学可接受的载体或赋形剂进行配制以制成药物组合物。载体和组合物可以是无菌的。制剂应该适于给药方式。
合适的药用载体包括但不限于水、盐溶液(例如NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯树胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物如乳糖，直链淀粉或支链淀粉，糖如甘露糖，蔗糖或其它糖，葡萄糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，以及它们的组合。如果需要，药物制剂能够与助剂混合(例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、芳香和/或香味物质等)，助剂不会有害地与活性化合物反应或者干扰其活性。在一个优选的实施方式中，采用了适用于静脉内给药的水溶性载体。
如果需要，组合物或药剂也可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末。组合物也可以用传统的粘结剂和载体如甘油三酸酯配制成栓剂。口服制剂可以包含标准载体如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、糖精酸钠、纤维素、碳酸镁等。
组合物或药剂可以根据常规程序配制成适用于向人类给药的药物组合物。例如，在一个优选实施方式，用于静脉内给药的组合物通常是在无菌等渗含水缓冲液中的溶液。如果需要，组合物也可以包含增溶剂和局部麻醉剂，以缓解注射部位的疼痛。一般而言，各个组分可以以单位剂型单独提供或混合在一起，例如，作为在气密性密封容器如指示活性剂的量的安瓿瓶或sachette中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。如果需要通过灌注给药组合物，其可以用含有无菌药物级水、盐水或葡萄糖/水的灌注瓶加以分散。如果需要通过注射给药组合物，可以提供用于注射的无菌水或盐水的安瓿瓶，以使各个组分可以在给药之前进行混合。
GILT-标记的GAA可以配制成中性或盐形式。药用盐包括那些与游离氨基形成的盐，例如衍生于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等，和那些与游离羧基形成的盐，例如衍生于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁，异丙胺，三乙胺，2-乙基氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等。
GILT-标记的GAA(或者含有GILT-标记的GAA的组合物或药剂)通过任何合适的路径给药。在一个优选的实施方式中，GILT-标记的GAA经由静脉内给药。在其他实施方式中，GILT-标记的GAA直接给药至靶组织，例如心脏或肌肉(例如肌内)或者神经系统(例如直接注入大脑；心室内；鞘内)。可替代地，GILT-标记的GAA(或含有GILT-标记的GAA的组合物或药剂)可以经由非肠胃给药、经皮给药或跨粘膜给药(例如，口服或者鼻道)。如果需要，可以同时采用多种路径。
GILT-标记的GAA(或含有GILT-标记的GAA的组合物或药剂)可以单独给药，或者联合其它试剂，如抗组胺剂(例如苯海拉明(diphenhydramine))或免疫抑制剂或其它对抗抗-GILT-标记的GAA抗体的免疫治疗剂。术语“联合”是指试剂在GILT-标记的GAA(或含有GILT-标记的GAA的组合物或药剂)给药之前、给药的同时或给药之后进行给药。例如，试剂可以混合到含有GILT-标记的GAA的组合物中，由此与GILT-标记GAA同时给药；可替代地，试剂可以不进行混合而同时给药(例如，通过在静脉内路线上的试剂的“借道”递送，通过这种方式也给药GILT-标记的GAA，或者反之亦然)。在另一实施方式中，试剂可以分开给药(例如，不用掺混)，但是是在GILT-标记的GAA给药的短时限内(例如24h内)。在一个优选的实施方式中，如果个体对内源GAA呈CRIM-阴性，则GILT-标记的GAA(或含有GILT-标记的GAA的组合物或药剂)与设计用于降低抗-GILT-标记的GAA抗体数量、或阻止其产生的免疫抑制方案或免疫治疗方案联合而进行给药。例如，类似于用于血友病患者的方案(Nilsson et al(1988)N.Engl.J.Med.，318：947-50)可以用于降低抗-GILT-标记的GAA抗体。这种方案也可以用于对内源GAA呈阳性但是具有抗-GILT-标记的GAA抗体或存在具有抗-GILT-标记的GAA抗体危险的个体。在一个特别优选的实施方式中，免疫抑制方案或免疫治疗方案在GILT-标记的GAA首次给药之前开始，以便最小化产生抗-GILT-标记的GAA抗体的可能性。
GILT-标记的GAA(或含有GILT-标记的GAA的组合物或药剂)以治疗有效剂量(即当以规律时间间隔给药时，足以治疗该疾病的剂量，例如通过改善与该疾病相关的症状，预防或延迟该疾病的发作，和/或也降低该疾病的严重度或频率，如上所述)进行给药。用于治疗该疾病的治疗有效的剂量将取决于该疾病影响的性质和程度，并且可以通过标准临床技术确定。另外，体内或体外测定可以可选地采用以有助于确定最佳的剂量范围，例如以下所给的示例性剂量。要采用的精确剂量也取决于给药路径，和疾病的严重性，并且应该根据医师判断和每个患者的病况进行确定。有效剂量可以由体外或动物模型试验系统衍生的剂量响应曲线推断出。治疗有效剂量可以例如为约0.1～1mg/kg，约1～5mg/kg，约5～20mg/kg，约20-50mg/kg或20～100mg/kg。对于特定个体的有效剂量可以随时间进行变化(例如，增加或降低)，这根据个体的需要而定。例如，在身体疾病或应激的时间内，或者如果抗-GILT-标记的GAA抗体开始出现或增加，或者如果疾病症状恶化，则剂量可以增加。
GILT-标记的GAA(或含有GILT-标记的GAA的组合物或药剂)的治疗有效量以规律时间间隔给药，这取决于疾病影响的性质和程度，以及取决于正在发生的基础。如本文中所用的，以一定“时间间隔”给药是指周期性地给予治疗有效量(这有别于一次性剂量给药)。时间间隔可以通过标准临床技术确定。在优选的实施方式中，GILT-标记的GAA可以每两月给药、每月给药、每月两次给药、每三周给药、每两周给药、每周给药、每周两次给药、每周三次给药或每天给药。对于单个个体的给药时间间隔不必是固定的时间间隔，而是可以随时间进行变化，这取决于个体所需。例如，在身体疾病或应激的时间内，如果抗-GILT-标记的GAA抗体开始产生或增加，或者如果疾病症状恶化，则剂量之间的时间间隔就可能减少。
如本文中所用的，术语“每两月给药”是指每两个月给药一次(即每两月1次)；术语“每月给药”是指每月给药一次；术语“每三周给药”是指每三个星期给药一次(即每三个周1次)；术语“每两周给药”是指每两个星期给药一次(即每两个周1次)；术语“每周给药”是指每一个星期给药一次；而术语“每天给药”是指每天给药一次。
本发明另外涉及一种在带有标签的容器(例如药水瓶，玻璃瓶，用于静脉内给药的袋，注射器等)中的如本文所述的药物组合物，容器装有用于该组合物的给药(例如通过本文所述的方法)以治疗庞贝氏症的说明书。
本发明将通过以下实施例进一步且更具体地进行描述。然而，实施例只是出于举例说明的目的，而非对本发明的限制。
实施例
实施例1：重组野生型GAA和GILT-标记的GAA的生产
质粒
分离编码全长的野生型人GAA的DNA并插入到用于生产重组人GAA的表达载体中。编码完全人GAA氨基酸1-952的DNA盒(下文称为“盒635”)来源于IMAGE克隆体4374238(OpenBiosystems)，其中利用以下PCR引物衍生：
GAA13：5’-GGAATTCCAACCATGGGAGTGAGGCACCCGCCC(SEQ ID NO：1)和
GAA27：5’-GCTCTAGACTAACACCAGCTGACGAGAAACTGC(SEQ ID NO：2)。
盒635利用EcoRI和XbaI消化，通过用克伦诺(Klenow)DNA聚合酶处理而钝化，然后绑扎到表达媒介物pCEP4(Invitrogen)的克伦诺处理后的HindIII位点，从而产生质粒p635。下文中，ZC-635是指野生型未标记的GAA蛋白。
用于生产重组GILT-标记的GAA ZC-701的DNA盒(下文称为“盒701”)类似于盒635进行制备，只是以下N-端序列，其接合对应于氨基酸A70的GAA序列的上游：
GAATTCACACCAATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGCCGTCGCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCG(SEQ ID NO：3)。
盒701利用EcoRI和XbaI消化，通过用克伦诺DNA聚合酶处理而钝化，然后绑扎到表达载体pCEP4的克伦诺处理后的HindIII位点，从而产生质粒p701。下文中，ZC-701是指由p701质粒编码的GILT标记的GAA蛋白。图1示出了GILT-标记的GAA ZC-701的图示，包括在分泌时丧失的IGF-II信号肽。因此，以分泌的形式(即，由于其将会被给药到主体)，ZC-701包含人IGF-II的氨基酸1和8-67(即成熟人IGF-II的Δ2-7)、间隔序列Gly-Ala-Pro和人GAA的氨基酸70-952。以下示出了全长的氨基酸序列。间隔序列加有下划线。间隔序列的序列N-末端反映人IGF-II的氨基酸1和8-67(箭头指向氨基酸1)而间隔序列的序列C-末端反映人GAA的氨基酸70-952。
↓
MGIPMGKSMLVLLTFLAFASCCIAALCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSEGAPAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGAQMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLHFTIKDPANRRYEVPLETPRVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVHRQLDGRVLLNTTVAPLFFADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLALEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLDVVGYPFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELENPPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISRSTFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVRWTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAGETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPIEALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQPMALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQLQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC(SEQ ID NO：4)
第二GILT-标记的GAA盒(ZC-1026)类似地进行构建。ZC-1026包含人IGF-II的氨基酸1和8-67、间隔序列Thr-Gly和人GAA的氨基酸70-952。
这些质粒用于瞬时转染用于生产重组蛋白的悬浮HEK293细胞。按照制造商(Invitrogen)的描述将质粒转染到悬浮FreeStyleTM293-F细胞中。简而言之，细胞在聚碳酸酯振荡瓶中的Opti-I介质(Invitrogen)中放置于定轨摇床于37℃和8％的CO2下进行生长。细胞浓度调节到1×106个细胞/mL，然后按照制造商(Invitrogen)的描述用比率为1∶1∶1的ml细胞∶μg DNA∶μl 293fectinTM进行转染。培养物在转染5～10天后进行收获，并通过离心和0.2μm瓶顶过滤器过滤而除去细胞。上清液于-80℃下储存。
可替代地，盒701引入(整合)到逆转录病毒载体(retrovector)表达系统(Cardinal Health)。该方法描述于美国专利No.6,852,510中，其公开内容结合于此作为参考。含有盒701的逆转录病毒载体表达系统用来形成用于生产重组GILT-标记的GAA的稳定CHO细胞系。盒701也可以引入到逆转录病毒载体表达系统并用来形成用于生产重组GILT-标记的GAA的稳定HEK293细胞系。
GILT-标记的GAA的纯化
起始原料是哺乳动物细胞培养物上清液，如上所描述的，从-80℃的储存下进行解冻。加入乙酸钠(pH 4.6)以使最终浓度达到100mM，并加入硫酸铵以使最终浓度达到0.75M。物料离心以除去沉淀并用0.8/0.2μm AcroPakTM 500荚膜(Pall，目录号#12991)进行过滤。
过滤后的物料加载到用HIC加载缓冲液(50mM NaAc pH 4.6，0.75M AmSO4)制备的Phenyl-SepharoseTM 6 Low-Sub Fast-Flow(GEHealthcare)柱。用10柱体积的HIC冲洗缓冲液(50mM NaAc pH5.3，0.75M AmSO4)冲洗柱子，并用5柱体积的HIC洗脱缓冲液(50mM NaAc pH 5.3，20mM AmSO4)洗脱。
合并的馏分广泛透析到QXL加载缓冲液(20mM组氨酸pH 6.5，50mM NaCl)中，然后加载到Q SepharoseTM XL柱(GE Healthcare)上。用10柱体积的QXL平衡缓冲液冲洗，并用10柱体积的QXL洗脱缓冲液(20mM组氨酸pH 6.5，150mM NaCl)洗脱。在某些情况下，来自QXL柱的合并馏分浓缩至蛋白浓度为30～40mg/mL，然后加载到在PBS pH 6.2中平衡的2.6×90cm Ultrogel AcA 44柱上。加载体积为5～7.5mL(柱体积的1％～1.5％)。在PBS pH 6.2中以0.4mL/min的速度走柱，并收集4mL馏分。
纯化的未标记GAA和GILT-标记的GAA在图2A～C示出。图2A示出了银染色之前的SDS-PAGE。图2B示出了利用抗-GAA抗体的蛋白质印迹。图2C示出了利用抗-IGF-II抗体的蛋白质印迹。
实施例2：GILT-标记的GAA对CI-MPR的亲和力
GILT-标记的GAA ZC-701对CI-MPR的结合亲和力利用表面等离子体谐振测定(surface plasmon resonance assay)加以确定。根据标准分子技术，分别形成两个生物素化和His-标记的重组蛋白(含有野生型CI-MPR结构域10-13和一个点突变变体)。两个重组蛋白的示意图如图3A所示。质粒p1288含有的IGF-II信号肽，紧接着有：多聚His(poly-His)标签；生物素AS结构域；以及编码野生型CI-MPR结构域10-13的序列。质粒p1355含有IGF-II信号肽，紧接着有：多聚His(poly-His)标签；生物素AS结构域；以及编码具有有效降低受体对IGF-II的亲和力的点突变I1572T的CI-MPR结构域10-13的序列。以下示出了与这两个重组蛋白相关的特异性DNA和氨基酸序列。
HIS-生物素-CI-MPR结构域10-13
ATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTGGCGCGCCGACCGGTCACCATCACCATCACCACGCGCCGGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCACGAACCTTTCGATCTGACTGAATGTTCATTCAAAGATGGGGCTGGCAACTCCTTCGACCTCTCGTCCCTGTCAAGGTACAGTGACAACTGGGAAGCCATCACTGGGACGGGGGACCCGGAGCACTACCTCATCAATGTCTGCAAGTCTCTGGCCCCGCAGGCTGGCACTGAGCCGTGCCCTCCAGAAGCAGCCGCGTGTCTGCTGGGTGGCTCCAAGCCCGTGAACCTCGGCAGGGTAAGGGACGGACCTCAGTGGAGAGATGGCATAATTGTCCTGAAATACGTTGATGGCGACTTATGTCCAGATGGGATTCGGAAAAAGTCAACCACCATCCGATTCACCTGCAGCGAGAGCCAAGTGAACTCCAGGCCCATGTTCATCAGCGCCGTGGAGGACTGTGAGTACACCTTTGCCTGGCCCACAGCCACAGCCTGTCCCATGAAGAGCAACGAGCATGATGACTGCCAGGTCACCAACCCAAGCACAGGACACCTGTTTGATCTGAGCTCCTTAAGTGGCAGGGCGGGATTCACAGCTGCTTACAGCGAGAAGGGGTTGGTTTACATGAGCATCTGTGGGGAGAATGAAAACTGCCCTCCTGGCGTGGGGGCCTGCTTTGGACAGACCAGGATTAGCGTGGGCAAGGCCAACAAGAGGCTGAGATACGTGGACCAGGTCCTGCAGCTGGTGTACAAGGATGGGTCCCCTTGTCCCTCCAAATCCGGCCTGAGCTATAAGAGTGTGATCAGTTTCGTGTGCAGGCCTGAGGCCGGGCCAACCAATAGGCCCATGCTCATCTCCCTGGACAAGCAGACATGCACTCTCTTCTTCTCCTGGCACACGCCGCTGGCCTGCGAGCAAGCGACCGAATGTTCCGTGAGGAATGGAAGCTCTATTGTTGACTTGTCTCCCCTTATTCATCGCACTGGTGGTTATGAGGCTTATGATGAGAGTGAGGATGATGCCTCCGATACCAACCCTGATTTCTACATCAATATTTGTCAGCCACTAAATCCCATGCACGGAGTGCCCTGTCCTGCCGGAGCCGCTGTGTGCAAAGTTCCTATTGATGGTCCCCCCATAGATATCGGCCGGGTAGCAGGACCACCAATACTCAATCCAATAGCAAATGAGATTTACTTGAATTTTGAAAGCAGTACTCCTTGCTTAGCGGACAAGCATTTCAACTACACCTCGCTCATCGCGTTTCACTGTAAGAGAGGTGTGAGCATGGGAACGCCTAAGCTGTTAAGGACCAGCGAGTGCGACTTTGTGTTCGAATGGGAGACTCCTGTCGTCTGTCCTGATGAAGTGAGGATGGATGGCTGTACCCTGACAGATGAGCAGCTCCTCTACAGCTTCAACTTGTCCAGCCTTTCCACGAGCACCTTTAAGGTGACTCGCGACTCGCGCACCTACAGCGTTGGGGTGTGCACCTTTGCAGTCGGGCCAGAACAAGGAGGCTGTAAGGACGGAGGAGTCTGTCTGCTCTCAGGCACCAAGGGGGCATCCTTTGGACGGCTGCAATCAATGAAACTGGATTACAGGCACCAGGATGAAGCGGTCGTTTTAAGTTACGTGAATGGTGATCGTTGCCCTCCAGAAACCGATGACGGCGTCCCCTGTGTCTTCCCCTTCATATTCAATGGGAAGAGCTACGAGGAGTGCATCATAGAGAGCAGGGCGAAGCTGTGGTGTAGCACAACTGCGGACTACGACAGAGACCACGAGTGGGGCTTCTGCAGACACTCAAACAGCTACCGGACATCCAGCATCATATTTAAGTGTGATGAAGATGAGGACATTGGGAGGCCACAAGTCTTCAGTGAAGTGCGTGGGTGTGATGTGACATTTGAGTGGAAAACAAAAGTTGTCTGCCCTTGA(SEQ ID NO：5)
HIS-生物素-CI-MPR结构域10-13蛋白质序列
MGIPMGKSMLVLLTFLAFASCCIAAGAPTGHHHHHHAPGLNDIFEAQKIEWHEPFDLTECSFKDGAGNSFDLSSLSRYSDNWEAITGTGDPEHYLINVCKSLAPQAGTEPCPPEAAACLLGGSKPVNLGRVRDGPQWRDGIIVLKYVDGDLCPDGIRKKSTTIRFTCSESQVNSRPMFISAVEDCEYTFAWPTATACPMKSNEHDDCQVTNPSTGHLFDLSSLSGRAGFTAAYSEKGLVYMSICGENENCPPGVGACFGQTRISVGKANKRLRYVDQVLQLVYKDGSPCPSKSGLSYKSVISFVCRPEAGPTNRPMLISLDKQTCTLFFSWHTPLACEQATECSVRNGSSIVDLSPLIHRTGGYEAYDESEDDASDTNPDFYINICQPLNPMHGVPCPAGAAVCKVPIDGPPIDIGRVAGPPILNPIANEIYLNFESSTPCLADKHFNYTSLIAFHCKRGVSMGTPKLLRTSECDFVFEWETPVVCPDEVRMDGCTLTDEQLLYSFNLSSLSTSTFKVTRDSRTYSVGVCTFAVGPEQGGCKDGGVCLLSGTKGASFGRLQSMKLDYRHQDEAVVLSYVNGDRCPPETDDGVPCVFPFIFNGKSYEECIIESRAKLWCSTTADYDRDHEWGFCRHSNSYRTSSIIEKCDEDEDIGRPQVFSEVRGCDVTFEWKTKVVCP(SEQ ID NO：6)。
HIS-生物素-CI-MPR结构域10-13 I1572T(下划线的序列变化导致点突变I1572T和形成诊断SpeI位点的沉默突变)
ATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTGGCGCGCCGACCGGTCACCATCACCATCACCACGCGCCGGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCACGAACCTTTCGATCTGACTGAATGTTCATTCAAAGATGGGGCTGGCAACTCCTTCGACCTCTCGTCCCTGTCAAGGTACAGTGACAACTGGGAAGCCATCACTGGGACGGGGGACCCGGAGCACTACCTCATCAATGTCTGCAAGTCTCTGGCCCCGCAGGCTGGCACTGAGCCGTGCCCTCCAGAAGCAGCCGCGTGTCTGCTGGGTGGCTCCAAGCCCGTGAACCTCGGCAGGGTAAGGGACGGACCTCAGTGGAGAGATGGCATAATTGTCCTGAAATACGTTGATGGCGACTTATGTCCAGATGGGATTCGGAAAAAGTCAACCACCATCCGATTCACCTGCAGCGAGAGCCAAGTGAACTCCAGGCCCATGTTCATCAGCGCCGTGGAGGACTGTGAGTACACCTTTGCCTGGCCCACAGCCACAGCCTGTCCCATGAAGAGCAACGAGCATGATGACTGCCAGGTCACCAACCCAAGCACAGGACACCTGTTTGATCTGAGCTCCTTAAGTGGCAGGGCGGGATTCACAGCTGCTTACAGCGAGAAGGGGTTGGTTTACATGAGCATCTGTGGGGAGAATGAAAACTGCCCTCCTGGCGTGGGGGCCTGCTTTGGACAGACCAGGACTAGTGTGGGCAAGGCCAACAAGAGGCTGAGATACGTGGACCAGGTCCTGCAGCTGGTGTACAAGGATGGGTCCCCTTGTCCCTCCAAATCCGGCCTGAGCTATAAGAGTGTGATCAGTTTCGTGTGCAGGCCTGAGGCCGGGCCAACCAATAGGCCCATGCTCATCTCCCTGGACAAGCAGACATGCACTCTCTTCTTCTCCTGGCACACGCCGCTGGCCTGCGAGCAAGCGACCGAATGTTCCGTGAGGAATGGAAGCTCTATTGTTGACTTGTCTCCCCTTATTCATCGCACTGGTGGTTATGAGGCTTATGATGAGAGTGAGGATGATGCCTCCGATACCAACCCTGATTTCTACATCAATATTTGTCAGCCACTAAATCCCATGCACGGAGTGCCCTGTCCTGCCGGAGCCGCTGTGTGCAAAGTTCCTATTGATGGTCCCCCCATAGATATCGGCCGGGTAGCAGGACCACCAATACTCAATCCAATAGCAAATGAGATTTACTTGAATTTTGAAAGCAGTACTCCTTGCTTAGCGGACAAGCATTTCAACTACACCTCGCTCATCGCGTTTCACTGTAAGAGAGGTGTGAGCATGGGAACGCCTAAGCTGTTAAGGACCAGCGAGTGCGACTTTGTGTTCGAATGGGAGACTCCTGTCGTCTGTCCTGATGAAGTGAGGATGGATGGCTGTACCCTGACAGATGAGCAGCTCCTCTACAGCTTCAACTTGTCCAGCCTTTCCACGAGCACCTTTAAGGTGACTCGCGACTCGCGCACCTACAGCGTTGGGGTGTGCACCTTTGCAGTCGGGCCAGAACAAGGAGGCTGTAAGGACGGAGGAGTCTGTCTGCTCTCAGGCACCAAGGGGGCATCCTTTGGACGGCTGCAATCAATGAAACTGGATTACAGGCACCAGGATGAAGCGGTCGTTTTAAGTTACGTGAATGGTGATCGTTGCCCTCCAGAAACCGATGACGGCGTCCCCTGTGTCTTCCCCTTCATATTCAATGGGAAGAGCTACGAGGAGTGCATCATAGAGAGCAGGGCGAAGCTGTGGTGTAGCACAACTGCGGACTACGACAGAGACCACGAGTGGGGCTTCTGCAGACACTCAAACAGCTACCGGACATCCAGCATCATATTTAAGTGTGATGAAGATGAGGACATTGGGAGGCCACAAGTCTTCAGTGAAGTGCGTGGGTGTGATGTGACATTTGAGTGGAAAACAAAAGTTGTCTGCCCTTGA(SEQ ID NO：7)
HIS-生物素-CI-MPR结构域10-13 I1572T蛋白质序列(I1572T突变加了下划线)
MGIPMGKSMLVLLTFLAFASCCIAAGAPTGHHHHHHAPGLNDIFEAQKIEWHEPFDLTECSFKDGAGNSFDLSSLSRYSDNWEAITGTGDPEHYLINVCKSLAPQAGTEPCPPEAAACLLGGSKPVNLGRVRDGPQWRDGIIVLKYVDGDLCPDGIRKKSTTIRFTCSESQVNSRPMFISAVEDCEYTFAWPTATACPMKSNEHDDCQVTNPSTGHLFDLSSLSGRAGFTAAYSEKGLVYMSICGENENCPPGVGACFGQTRTSVGKANKRLRYVDQVLQLVYKDGSPCPSKSGLSYKSVISFVCRPEAGPTNRPMLISLDKQTCTLFFSWHTPLACEQATECSVRNGSSIVDLSPLIHRTGGYEAYDESEDDASDTNPDFYINICQPLNPMHGVPCPAGAAVCKVPIDGPPIDIGRVAGPPILNPIANEIYLNFESSTPCLADKHFNYTSLIAFHCKRGVSMGTPKLLRTSECDFVFEWETPVVCPDEVRMDGCTLTDEQLLYSFNLSSLSTSTFKVTRDSRTYSVGVCTFAVGPEQGGCKDGGVCLLSGTKGASFGRLQSMKLDYRHQDEAVVLSYVNGDRCPPETDDGVPCVFPFIFNGKSYEECIIESRAKLWCSTTADYDRDHEWGFCRHSNSYRTSSIIFKCDEDEDIGRPQVFSEVRGCDVTFEWKTKVVCP(SEQ ID NO：8)
重组蛋白在悬浮HEK293细胞中瞬时表达(参见图3B)。蛋白质从培养物上清液中收集，并通过镍琼脂糖纯化，然后进行生物素化。具体而言，来自用质粒p1288和p1355转染的细胞的上清液按照制造商指导施加到1mL His GravitrapTM柱(GE Healthcare)中，用于纯化His6-标记的受体结构域蛋白。浓缩洗脱液并交换到10mMTris pH8和25mM NaCl缓冲液中，然后按照制造商(Avidity)的描述，在含有70μg在具有25μL BiomixA、25μL BiomixB和4μLBirA酶的总体积为205μL的溶液中的受体的反应体系中，用BirA酶生物素化该蛋白。BirA酶处理在30℃下进行1.5h。然后反应体系稀释20倍到His GravitrapTM结合缓冲液(GE Healthcare)，并在施加至His GravitrapTM柱，以除去BirA酶和游离生物素。洗脱液在4℃下储存。
表面等离子体谐振分析
所有表面等离子体谐振检测都在25℃下采用3000仪器进行。SA传感器芯片和表面活性剂P20从Biacore(Piscataway，NJ)获得。所有的缓冲剂利用过滤单元(0.2μm)过滤，平衡至室温，并在使用之前立即脱气。蛋白样品在13,000×g下离心15min以除去任何可能在样品中存在的粒子。
纯化后的生物素化的野生型(1288FS)或突变型(1355FS)重组CI-MPR结构域10-13(Dom 10-13)蛋白固定到抗生蛋白链菌素(SA)芯片上，其含有抗生蛋白链菌素共价连接至其的葡聚糖基质。在SA传感器芯片进行对接后，用去离子水对SA芯片冲洗两次。通过以20mL/min的流速注入60mL含有50mM NaOH/1M NaCl的缓冲液调节待偶联的流动细胞。如上所述用水冲洗芯片。然后芯片如上所述用偶联缓冲液(10mM HEPES pH 7.4/100mM NaCl)冲洗。生物素化的Dom 10-13蛋白1355FS和1288FS在偶联缓冲液中稀释至20ng/mL和4ng/mL。流动细胞(FC)1和2以高于FC 3和4的密度偶联。FC 1和FC 3用突变Dom 10-13构建体固定，并用作参照表面(即，从FC 2减去由FC 1获得的响应；从FC 4减去由FC 3获得的响应)。FC 2和FC 4用野生型Dom 10-13构建体固定。FC 1通过以10mL/min的流速注入50mL的1355FS(20ng/ml)进行偶联，而FC 2通过以10mL/min的流速注入50mL的1288FS(20ng/ml)进行偶联，以达到最终约5,000谐振单位(RU)的偶联水平。FC 3通过以10mL/min的流速注入50mL的1355FS(4ng/ml)进行偶联，而FC 2通过以10mL/min的流速注入50mL的1288FS(4ng/ml)进行偶联，以达到最终约1,000RU的偶联水平。这些偶联水平给出了对于IGF-II的800RU(FC2-1)或160RU(FC4-3)的理论Rmax和对于GAA-GILT的10,000RU(FC2-1)或2,000RU(FC4-3)的理论Rmax。在注入50ml含Dom 10-13构建体的偶联缓冲液之后，芯片单独用偶联缓冲液冲洗(以10mL/min的流速注入10mL)。剩余未结合的抗生蛋白链菌素结合位点用生物素通过以10μL/min的流速连续注入两个10mL生物素(10mM)进行饱和。
偶联之后，流动细胞在电泳缓冲液(10mM HEPES pH 7.0，150mM NaCl和0.005％(v/v)表面活性剂P20)中平衡。固定的Dom10-13构建体的活性通过单独检测受体对IGF-II的亲和力加以确定。IGF-II(134mM)首先在电泳缓冲液中稀释成1、5、10、25、50、75、100、250和500nM的最终浓度。将每个浓度的IGF-II以40mL/min的流速在2min内注入到芯片上(即，缔合相)，接着单独进行2min的电泳缓冲液的的注入(流速＝40mL/min)(即，解离相)。表面用10mM HCl以10mL/min的流速注入10mL进行再生。再生之后，流速增加到40mL/min，而芯片在开始下一注入之前容许平衡1min。
类似地，GILT-标记的GAA构建体701对其与Dom 10-13重组受体的结合亲和力进行分析。该结构在电泳缓冲液中稀释成1、5、10、25、50、75、100、250和500nM的最终浓度，并按照以上对IGF-II的描述进行注入。在GILT-标记的GAA构建体之后运行IGF-II浓度曲线以测试固定的Dom 10-13表面的完整性。
对于每一个分析物浓度，确定处于平衡的响应平均值，所得的平衡谐振单元对浓度描点作图。利用BIAevaluationTM软件(版本4.1)将数据拟合到稳态亲和力模型。解离常数也利用1∶1的结合等温模型确定。所有的响应数据按照Myszka(2000)Methods Enzymo.323：325-3401中的描述进行双重基准化(double-referenced)，其中用于对本体折射率贡献变化的对照(即单独注射电泳缓冲液)与利用突变Dom 10-13固定化的流动细胞平行进行并从所有结合传感谱(sensorgram)减去。图4A-B是显示结合到CI-MPR的IGF-II和GILT-标记的GAA ZC-701的分析的示例性浓度曲线。图4A示出了IGF-II的结合曲线。图4B示出了GILT-标记的GAAZC-701的结合曲线。两种流动细胞对(即，FC2-1和FC4-3)的结果进行比较(图4B)。
这些实验结果表明，GILT-标记的GAA ZC-701对于CI-MPR具有亲和力，是IGF-II的约0.8(表1)。这些数据表明，与IGF-II对CI-MPR的亲和力相比，GILT-标记的GAA对于CI-MPR具有高亲和力。尽管所测得的IGF-II对CI-MPR亲和力的绝对值为27nM，但是据先前的文献中报道，IGF-II结合到受体的结构域10-13的亲和力比结合到天然受体的亲和力低约10倍。Linnell et al.(2001)JBiol Chem.Jun 29；276(26)：23986-91。因此，GILT-标记的GAA对天然受体的结合亲和力也预期高10倍。
表1
蛋白质 Kd 相对亲和力 IGF-II 27nM 1 ZC-701 33nM 0.8 ZC-1026 43nM 0.6
实施例3：N-连接的寡糖分析表明ZC-701缺乏M6P
利用PNG酶脱糖基化，接着用具有荧光检测的HPLC分析的组合(Blue Stream Laboratories)，实施N-连接的寡糖分析以确定ZC-701的寡糖分布外形。
利用每个样品的约100μg蛋白，通过N-聚糖酶以1∶100(酶对底物)的比率实施从糖蛋白样品切割N-连接的糖(碳水化合物)。一旦释放，就利用冷乙醇提取聚糖并通过离心实现干燥。回收的寡糖在酸性条件下于氰基硼氢化钠存在下用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记。在衍生化步骤之后，通过S样品过滤导管(Prozyme)除去样品中剩余的过量染料和其他反应试剂。
通过HPLC-FLD进行的N-连接寡糖分析使用以下条件：流动相A：65％乙腈/35％的流动相B；流动相B：250mM甲酸铵，pH4.4；检测：荧光(Ex：330nm，Em：420nm)；和HPLC梯度。
色谱峰进行积分，并基于峰保留时间进行比较。结果报道为每个总峰面积的每个糖型的面积％。根据这些分析，确定了在ZC-701上存在的主要寡糖结构是高甘露糖结构和一些复杂的触角结构。然而，没有检测到甘露糖-6-磷酸结构。
实施例4：摄取测定证实了在ZC-701表面上缺乏功能性M6P
重组GAA摄取到哺乳动物细胞中是通过与CI-MPR的相互作用介导的，CI-MPR存在于大多数哺乳动物细胞型的表面上。摄取取决于蛋白质表面的寡糖上存在M6P。
相反，由于在蛋白的N-端存在IGF-II来源的标签，所以ZC-701对CI-MPR具有高亲和力。在许多实验中已经证实，ZC-701显示没有明显的M6P-依赖型摄取入哺乳动物细胞中，这证实了在ZC-701表面上M6P的功能性缺乏。
实施细胞基摄取测定，以证实GILT-标记的或未标记的GAA进入靶细胞的能力。大鼠L6成肌细胞在摄取之前24h在24-孔板以每孔1×105个细胞的密度铺放。在实验开始时，从细胞除去介质，并用0.5mL摄取介质代替，该摄取介质包含浓度范围为2～500nM的标记的或未标记的GAA。为了证实摄取的特异性，一些孔另外含有竞争剂M6P(5mM最终浓度)和/或IGF-II(18μg/mL的最终浓度)。18h之后，介质从细胞吸出，而细胞用PBS冲洗4次。然后，细胞用200μL CelLytic MTM细胞溶解缓冲液溶解，细胞溶解物利用4MU底物按照以下描述的分析GAA活性。蛋白采用PierceBCATM蛋白测定试剂盒进行确定。
在CHO细胞中产生的ZC-701典型摄取实验结果如图5所示。正如所观察到的，ZC-701摄取到大鼠L6成肌细胞中实际上并未受到加入大摩尔过量的M6P的影响，而摄取完全被过量的IGF-II消除。相反，wtGAA(ZC-635)的摄取完全被加入过量的M6P消除，但实际上并未受到IGF-II竞争的影响。CHO-细胞产生的ZC-701摄取到哺乳动物细胞对过量M6P的抑制的不敏感性，表明CHO细胞中产生的ZC-701表面上M6P的功能性缺乏。
实施例5：GILT-标记的GAA表明比未标记的GAA更有效的摄取
图6示出了纯化的GILT-标记的GAA(ZC-701)和野生型的未标记GAA(ZC-635)摄取进入L6成肌细胞的饱和曲线。在示例的实验中，GILT-标记的GAA具有的K摄取＝7nM，而wt GAA具有的K摄取＝354nM。这说明，GILT-标记的GAA显示出比未标记的GAA更有效的摄取，因为与未标记的GAA相比，需要显著更低水平的GILT-标记的GAA以实现经由CI-MPR的最大摄取进入成肌细胞。
这也证明，GILT标签不会干扰GAA的酶活性。
GAA PNP测定
GAA酶在50μL含100mM乙酸钠pH 4.2和10mM对硝基苯酚(PNP)α-葡糖苷底物(Sigma N1377)的反应混合物中孵育。反应在37℃孵育20min，并用300μL 100mM碳酸钠停止。在96-孔微滴定孔板上于405nm下测定吸收率，并与由对硝基苯酚(Sigma N7660)建立的标准曲线对照。1GAA PNP单位定义为水解的1nmolPNP/h。
GAA 4MU测定
GAA酶在20μL含有123mM乙酸钠pH 4.0和10mM 4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferyl)α-D-葡糖苷酶底物(Sigma，目录号#M-9766)的反应混合物中孵育。反应在37℃孵育1h，并用200μL含267mM碳酸钠、427mM甘氨酸的缓冲液pH 10.7停止。在96-孔微滴定孔板上用355nm激发和460nm滤光器测定荧光，并与由4-甲基伞形酮(Sigma，目录#M1381)建立的标准曲线对照。1GAA4MU单位定义为水解的1nmol 4-甲基伞形酮/h。
示例性GILT-标记的GAA和野生型未标记GAA的特定活性如表2所示。GILT-标记的GAA的酶活性堪与未标记的GAA相当。
表2：GILT-标记的GAA ZC-701和野生型未标记的GAA的特定活性和Km
ZC-701 WtGAA 特异性活性* 4MU(nmol/h/mg) 315,000 346,000 Km4MU(mM)** 1.47 1.41 Km PNP(mM)** 3.29 9.21
*对于3个制剂确定的平均值
**对于两个制剂确定的平均值
实施例6：GAA在大鼠L6成肌细胞中的半衰期
按照以上的描述(参见实施例4)，利用在大鼠L6成肌细胞中的GILT-标记GAA和未标记的GAA进行摄取实验。18h之后，含有酶的介质从细胞吸出，并用PBS冲洗细胞4次。此时，双重孔(duplicate well)进行细胞溶解(时间0)，并且细胞溶解物在-80℃下冷冻。此后每天，进行双重孔细胞溶解，并储存用于分析。14天后，所有的细胞溶解物进行GAA活性分析。数据根据1级衰变方程：ln Ct＝-kt+ln Co进行作图，其中C是化合物浓度，t是以小时计的时间，而k是1级速率常数。图7就是示出了GILT-标记的GAA和未标记的GAA(ZC-635)在大鼠L6成肌细胞中的半衰期的示例性图示。图7中示出的结果表明，标记和未标记的蛋白具有非常类似的半衰期，分别为6.5和6.7天。这表明，一旦在细胞内，GILT-标记的酶继续保持与未标记的GAA具有类似的动力学。
实施例7：摄取之后的GAA处理或加工
按照文献Moreland et al.(2005)J.Biol.Chem..280：6780-6791及其所包含的参考文献的描述，哺乳动物GAA通常在溶酶体中经历连续的蛋白水解处理。处理后的蛋白产生70kDa、20kDa、10kDa的肽和一些更小的肽的谱图。为了确定GILT-标记的GAA是否与未标记的GAA类似被处理，来自上述摄取实验的细胞溶解物的等分试样通过蛋白质印迹进行分析。图8A～B是显示GILT-标记的GAA摄取到大鼠L6成肌细胞之后的蛋白水解处理的蛋白质印迹。图8A是显示通过单克隆抗体(识别具有IGF-II标签的70kDa IGF-II肽和更大中间体)鉴定的肽谱图的蛋白质印迹。在图8A中所示的结果表明，摄取后就立即失去GILT标签。图8B是显示通过单克隆抗体(识别70kDa肽和更大中间体)鉴定的在摄取后进入76kDa和70kDa物种的野生型和GILT-标记的GAA处理的蛋白质印迹。在该实验中鉴定的多肽谱图实际上对于标记和未标记的酶是相同的。这表明一旦进入细胞，GILT标签就失去，而GILT-标记的GAA类似于未标记的GAA被处理。因此，有可能的是，一旦进入细胞内，GILT标签对GAA的行为具有很少或没有影响。
实施例8：药代动力学
在不同培养条件下生产的GILT-标记的GAA的药代动力学在野生型129小鼠中进行检测。GILT-标记的GAA ZC-701在三种不同培养条件下产生。三组三只129小鼠用单剂量的10mg/kg ZC-701注入颈静脉，该ZC-701从在3种替换介质中生长的细胞的培养物上清液纯化得到。分别在注射前以及注射后15min、30min、45min、60min、90min、120min、4h和8h时进行血清取样。然后杀死该动物。血清样品通过定量蛋白质印迹进行分析。数据根据1级衰变方程：ln Ct＝-kt+ln Co进行作图，其中C是化合物浓度，t是以小时计的时间，而k是1级速率常数。半衰期从图9所示的对数曲线(log图)的线性部分获得。GILT-标记的GAA蛋白的半衰期是：红线，PF-CHO，t1/2＝43min；橙线，CDM4，t1/2＝38min；绿线，CD17，t1/2＝52min。基于这些结果，在CDl 7介质中产生的蛋白具有最为有利的半衰期。这些结果表明，GILT-标记的GAA从循环系统中并没有迅速地过度清除。
实施例9：GAA的组织半衰期
该实验的目的是确定一旦酶到达其靶组织时GILT-标记的GAA活性损失的速率。在庞贝氏症小鼠模型中，看起来在各种肌肉组织中具有约6～7天的组织半衰期(申请号125141/0，属于药物评价和研究中心以及生物学评价中心，药物学综述(the Center forDrug Evaluation and Research and Center for Biologies Evaluation andResearch，Pharmacology Reviews))。
庞贝氏症小鼠(按照Raben(1998)JBC.273：19086-19092描述的庞贝氏症鼠模型6neo/6neo，其公开内容结合于此作为参考)，用10mg/kg的未标记GAA(ZC-635)或GILT-标记的GAA ZC-701或GILT-标记的GAA ZC-1026注入颈静脉。然后在注射后1、5、10和15天杀死小鼠。组织样品均质化并根据标准程序检测GAA活性。GILT-标记的GAA ZC-701和ZC-1026以及未标记的GAA ZC-635的组织半衰期根据在不同组织中的衰变曲线进行计算(图10A，四头肌组织；图10B，心脏组织；图10C，隔膜组织；以及图10D，肝脏组织)。计算的半衰期值，总结在表3中。
未标记的蛋白质(ZC-635)的组织半衰期在不同组织中为9.1～3.9天，而GILT-标记的GAA ZC-701的半衰期在不同组织中为8.5～7.4天(表3)。这些范围可能由于相对小的样本量(3个动物/点)反映的是统计偏差，而不是显著差异。
为了比较，根据图9中所示的衰变曲线计算的在大鼠L6成肌细胞中ZC-701和未标记的野生型GAA(ZC-635)的半衰期分别为6.5天和6.7天。
表3在各种组织中标记和未标记的GAA的组织半衰期
组织 ZC-701 T1/2，天 ZC-635 T1/2，天 四头肌 8.5 9.1 心脏 7.4 3.9 膈 7.5 4.6 肝脏 8.2 7.9 大鼠L6成肌细胞 6.5 6.5
这些数据表明，一旦进入庞贝氏症小鼠的细胞内，GILT-标记的GAA看起来保持与未标记的GAA类似的动力学。而且，对GILT-标记的GAA衰变动力学的认知可以有助于设计合适的给药时间间隔。
实施例10：GILT-标记的GAA摄取到C2C12小鼠成肌细胞的溶酶体中
C2C12小鼠成肌细胞在聚赖氨酸涂敷的载玻片(BDBiosciences)上生长并在存在(面板A)或不存在(面板B)100nMGILT-标记的GAA下于37℃和5％CO2下孵育18h。然后将细胞在生长介质中孵育1h，接着用D-PBS冲洗4次后，于室温下用甲醇固定15min。接下来的孵育都在室温下进行，每一次孵育由三次用D-BPS冲洗分隔开。除非明确指出，孵育进行1h。载玻片用0.1％triton X-100渗透15min，接着用封闭缓冲液(10％热失活化马血清(Invitrogen)的D-PBS溶液)封闭。载玻片用初次鼠单克隆抗-GAA抗体3A6-1F2(1∶5,000，在封闭缓冲液中)进行孵育，接着用二次兔抗-鼠IgG AF594结合抗体(Invitrogen A1 1032，1∶200，在封闭缓冲液中)进行孵育。然后，孵育FITC-结合大鼠抗-小鼠LAMP-1(BDPharmingen 553793，1∶50，在封闭缓冲液中)。载玻片用含DAPI的封固溶液(mounting solution)(Invitrogen)封固，并用装配有异硫氰酸荧光素、德克萨斯红(texas red)和DAPI过滤器的NikonEclipse 80i显微镜(Chroma Technology)观察。采用通过MetaMorph软件(UniversalImaging)控制的光度计级联相机捕获图像。图像采用Photoshop软件(Adobe)合并。图11示出了通过抗-GAA抗体所检测信号的协同定位，该抗-GAA抗体具有由针对溶酶体标记物LAMP1的抗体所检测信号。因此，该结果证实了GILT-标记的GAA被递送至溶酶体。
实施例11：体内糖原的清除
本实验的目的是确定在向庞贝氏症小鼠单次IV注射GILT-标记的GAA或wt GAA之后，糖原从心脏组织清除的速率。
庞贝氏症小鼠(庞贝氏症小鼠模型6neo/6neo，在文献Raben(1998)JBC.273：19086-19092中描述，其公开内容结合于此作为参考)，用10mg/kg未标记的GAA(ZC-635)或GILT-标记的GAA(ZC-701)注入颈静脉。然后在注射后1、5、10和15天的时间杀死小鼠。每一个数据点表示来自三只鼠的平均值。根据标准程序进行心脏组织样品的均质化，并分析糖原含量。基本采用按照Zhu et al.(2005)BiochemJ.，389：619-628中描述的黑曲霉(A.niger)淀粉葡糖苷酶和Red Glucose测定试剂盒(Invitrogen)检测这些组织匀浆混合物中的糖原含量。图12中所示的结果表明，来自用ZC-701处理的小鼠心脏组织显示出糖原近乎完全清除，而用wt GAA处理的小鼠显示出糖原含量仅仅发生细小变化。
实施例12：庞贝氏症病理学的反转
已经证实，本发明的治疗用融合蛋白在体内比wt GAA在治疗上更为有效。执行了一个研究以比较ZC-701和wt GAA从庞贝氏症小鼠的骨骼肌组织清除糖原的能力，使用庞贝氏症小鼠模型6neo/6neo动物(Raben(1998)JBC 273：19086-19092)。庞贝氏症小鼠(5只/组)接受每周4次的IV注射两个剂量wt GAA或ZC-701(5mg/kg或20mg/kg)或载体中的一个。五只未处理的动物用作对照，并接受每周4次注射盐水溶液。动物在第2、3和4次注射之前1h接受口服苯海拉明(5mg/kg)。在本研究中，当动物不到48h龄时，为了使它们耐受，将庞贝氏症敲除小鼠经由皮下在颈部后颈注射25μgZC-701。在第4次注射后1周杀死这些小鼠，并收获各种组织(膈、心脏、肺、肝、比目鱼肌、四头肌、腓肠肌、TA、EDL、舌)用于组织和生化分析。在这些组织匀浆物中的糖原含量采用黑曲霉淀粉葡糖苷酶和Amplex Red Glucose测定试剂盒检测。研究设计总结在表4中。
表4
小鼠 注射 剂量 注射后存活 时间 #动物 GAA皮 肤-/- PBS 0 最后注射后 1周 N＝6 GAA皮 肤-/- Wt GAA(ZC-635) 5,20mg/kg 最后注射后 1周 N＝6/剂量 总计＝12 GAA皮 肤-/- GILT-修饰的GAA (ZC-701/ZC-1026) 5,20mg/kg 最后注射后 1周 N＝6/剂量 总计＝12
在不同组织匀浆物中的GAA酶水平采用标准程序测定，并且结果总结在表5中。
表5组织中的GAA水平
组织 GAA 单位/mg蛋白 SD 腓肠肌 635-20 15.918 9.659 701-20 7.495 1.435 701-5 7.263 0.859 635-5 4.828 0.251 PBS 4.380 0.193 四头肌 635-20 9.164 3.297 701-20 6.715 1.408 701-5 6.158 1.140 635-5 4.363 0.145 PBS 4.018 0.298 隔膜 635-20 42.178 53.517 701-20 24.945 27.799 701-5 7.795 0.387 635-5 6.364 1.058 PBS 5.254 0.281 心脏 635-20 5.121 2.082 701-20 5.363 0.683 701-5 6.330 1.310 635-5 4.354 0.652 PBS 3.911 0.311 舌 635-20 10.418 3.901 701-20 5.668 0.568 701-5 4.786 0.327 635-5 4.783 0.494 PBS 4.587 0.470 比目鱼肌 635-20 34.397 22.049 701-20 20.621 6.685
701-5 13.618 2.804 635-5 7.310 1.236 PBS 7.490 3.137 TA 635-20 19.623 13.242 701-20 7.148 1.318 701-5 7.398 0.507 635-5 4.688 0.140 PBS 4.790 0.797 EDL 635-20 23.9828 12.6501 701-20 13.0170 1.9414 701-5 9.1218 0.7590 635-5 7.2197 0.4682 PBS 6.7099 1.1557
在这些组织中的糖原含量采用黑曲霉淀粉葡糖苷酶和AmplexRed Glucose测定试剂盒(Invitrogen)基本按照Zhu et al.(2005)Biochem J.，389：619-628的描述进行检测。糖原数据描述在图13A-H中。正如图13A-H所使用的，GAA 5是指在5mg/kg剂量的未标记GAA；GAA 20是指在20mg/kg剂量的未标记GAA；701 5是指在5mg/kg剂量的GILT-标记的GAA ZC-701；701 20是指在20mg/kg剂量的GILT-标记的GAA ZC-701。PBS用作对照。这些结果表明，GILT-标记的GAA(ZC-701)与未标记的GAA(ZC-635)相比，在其从各种肌肉组织清除糖原的能力方面具有明显的优势。具体而言，ZC-701在其从多种骨骼肌组织清除糖原的能力方面显著地比wtGAA更为有效。接受两种剂量任意之一的wt GAA的庞贝氏症小鼠所具有的糖原水平不同于PBS处理的动物糖原水平。相反，接受ZC-701的动物表现出显著较低的糖原水平。
实施例13：剂量、给药时间间隔和主体年龄的优化
剂量
在之前的实验中，5mg/kg的剂量在许多组织中在清除糖原上与20mg/kg的剂量一样有效。剂量滴定实验用于确定可以足以治疗人类患者的最小有效剂量。每组5～7只耐受性庞贝氏症敲除小鼠每周注射不同剂量的GILT-标记的GAA。例如，耐受性庞贝氏症小鼠以1.0、1.5、2、2.5、5、10、20mg/kg剂量进行注射。
庞贝氏症敲除小鼠注射8周，然后杀死。从不同组织取样，并按照实施例11和12的描述确定糖原水平。糖原和酶分布的组织化学也根据标准程序进行测定。另外，生理学检测如肌肉力量检测和响应高碳酸血症的通气可以按照文献Mah et al.(2007)MolecularTherapy(在线公开)的描述在小鼠中使用气压计的全身体积描记法确定。
时间间隔
另外，评估了治疗时间间隔并且对于给定剂量确定了产生临床作用的最大时间间隔。，剂量滴定如上所述采用不同治疗时间间隔例如每2、3或4周进行注射而进行。在骨骼肌组织例如比目鱼肌或四头肌中的糖原清除一般用作用于确定小鼠模型中剂量和治疗时间间隔之间的最佳平衡的指示。如上所述的其他临床相关检测也可以使用。
例如，一个实验设计用于考察GILT-标记的GAA给药时间间隔在庞贝氏症小鼠模型中对其效能的影响。2～3月龄的庞贝氏症小鼠(Raben JBC 1998 273：19086-19092)分成多个8只动物的组。一组接受每周PBS注射(对照组)，一组接受每周5mg/kg GILT-标记的GAA注射，一组接受每隔一周的10mg/kg GILT-标记的GAA注射，一组接受每三周15mg/kg GILT-标记的GAA注射，而一组接受每四周20mg/kg GILT-标记的GAA注射。经过12周注射后的一周，所有动物都被宰杀。取样进行分析的组织样品包括：心脏、比目鱼肌、腓肠肌、EDL、TA、四头肌、腰肌、膈、脑、舌。
分析包括：生化糖原分析、糖原的组织化学染色、所选组织上的EM、所选组织上的免疫染色、通过ELISA的抗体血清样品分析、在比目鱼肌上的体外力-频检测(force-frequency measurement)、在有生命的研究部分期间尿中的葡萄四糖分析、治疗方案之前和之后糖原含量的13C NMR谱确定。
其中剂量和时间间隔变化的条件的矩阵可以生成以形成对这些参数之间的关系的理解。
可以预测，以较高剂量用药之间的更长时间间隔可以证实是有效的，由此为患有庞贝氏症的人提供较低负担治疗方案的解释。例如，基于图13A-H中所示的糖原数据，可以预测，5mg/kg的剂量每周给药将会产生与每两周10mg/kg或每三周20mg/kg的剂量给药类似的效果。因此，预期每三或四周一次代替每两周一次的GILT-标记的GAA灌注，在人庞贝氏症患者中将会足以实现疗效。治疗时间间隔越长是高度有利的，因为至少这将会降低患者的负担和不便。
主体的年龄
确定了治疗方法开始之时鼠龄对治疗结果的影响。据报道，在庞贝氏症小鼠II型肌纤维中，自体吞噬液泡将随时间而生成，这会干涉正常的运输途径，包括外源酶向溶酶体的递送。参见Fukuda etal(2006)Mol.Therapy，14(6)：831-839；Fukuda et al.(2006)Ann.Neurol.，59(4)：700-708；Fukuda et al.(2006)Autophagy.2(4)：318-320。科学家已经证实，neo-rhGAA，其是具有高达6个化学偶联合成的每个含2个M6P的寡糖的重组GAA，可以完全从13个月龄的庞贝氏症敲除鼠中清除糖原。Zhu et al，(2005)Biochem J.，389：619-628。这表明如果采用对CI-MPR具有高亲和力的酶，则Fukuda等报道的细胞病理学可以是可逆的。假定GILT-标记的GAA对于CI-MPR具有高亲和力并且其向肌肉细胞的递送比未标记的GAA更有效，则可以设想，足够的GILT-标记的GAA酶可以递送至溶酶体，从而清除糖原并随后逆转自体吞噬作用的建立。这在12～13月龄的庞贝氏症小鼠中直接进行试验。这些小鼠接受每周20或40mg/kg GILT-标记的GAA的4次注射，并在最后的注射之后1周进行宰杀。基本按照Zhu et al.(2005)的描述，采用黑曲霉淀粉葡糖苷酶和AmplexRed Glucose测定试剂盒(Invitrogen)来评估糖原含量。按照Lynch etal，(2005)J.Histochem.Cytochem.，53：63-73的描述通过组织化学染色也对糖原进行评价。
另外，实施测定以分析GILT-标记的GAA摄取进入具有从体吞噬作用的动物的独立完整肌纤维中，，以如Fukuda等描述的与未标记的GAA相比，直接比较在这些条件下GILT-标记的GAA靶向溶酶体的能力。预期GILT-标记GAA靶向具有自体吞噬作用的肌纤维比未标记的酶更有效。
实验14：人类临床研究
基于成功的动物治疗，设计了GILT-标记的GAA在儿科庞贝氏症患者中的6个月I/II期剂量范围研究。该临床试验是开放标签概念验证性人研究，实施以评价GILT-标记的GAA在患有幼发性庞贝氏症的患者中的安全性、耐受性、效能和药代动力学。在该研究中，总体治疗时间间隔是每两周一次(每两周地)。另外一方面期望增加的是其中以特定剂量进行治疗的时间间隔是每3或4周1次。
该临床试验的主要目的包括确定在患有幼发性庞贝氏症的患者治疗中，GILT-标记的GAA通过每两周静脉内灌注的4个剂量水平，即2.5、5、10和20mg/kg的效能。次要目的包括(1)评价在患有幼发性庞贝氏症的患者中通过每两周静脉内灌注给药的4个不同剂量水平的GILT-标记的GAA的安全性和药代动力学；(2)确定在患有幼发性庞贝氏症的患者中通过每两周静脉内灌注给药的4个剂量水平的GILT-GAA的药代动力学；以及(3)确定通过每两周静脉内灌注给药的4个剂量水平的GILT-GAA的每一个对患有幼发性庞贝氏症的患者中的肌肉糖原存在的影响。该临床试验的详细方案概要如表6所示。
表6人临床试验
图14示出了临床研究程序的详细流程图。
另外，期望包括一个使患者耐受或者免疫抑制患者的步骤。在其它溶酶体酶替代疗法的临床试验中，观察到许多患者产生针对GAA的高效价抗体。例如，这个现象在采用的高雪氏病(Gaucher)患者中已经观察到。在那种情况下，大多数患者自然地变成耐受性的并停止产生响应于治疗方案的抗体。不期望受到理论的束缚，认为抗-GAA抗体将干扰酶靶向CI-MPR，由此改变了酶的生物分布。一种耐受化策略是在GILT-标记的GAA治疗之前或期间，用(一种抗CD20的单克隆抗体)治疗庞贝氏症患者。在庞贝氏症患者上所用的剂量类似于在Sperr et al.(2007)Haematologica.Jan；92(1)：66-71中教导的治疗一些自身免疫性疾病中所用的剂量，该文献的教导内容结合于此作为参考。这种化合物也联合其他免疫抑制剂如类固醇一起使用。
基于活组织检查材料的组织化学染色，用GILT-标记的GAA治疗的庞贝氏症患者预期将证实在10～12周之后显著清除糖原。Thurberg等设计了基于超微结构损伤的连续性将庞贝氏症分类成5阶段细胞病理学。Thurberg et al.(2006)Lab.Invest.，86：1208-1220。例如，早期疾病阶段1细胞含有在完整肌原纤维之间的少量糖原填充的溶酶体。阶段3细胞含有许多糖原填充的溶酶体，其中由于溶酶体膜破裂所以许多糖原泄漏到细胞质中。这些阶段看起来与Fukada等描述的自体吞噬累积相关。在治疗开始之初对本研究中的患者进行细胞病理学分析，预期将会指示出临床结果。响应的患者一般具有低百分数的存在更严重形式的细胞病理学的肌细胞。尤其是，具有超过50％阶段2肌细胞的患者具有更好的临床结果。这也可以设想，更小的患者一般会具有更佳的临床结果，而具有更高百分比的I型肌肉纤维的患者也具有更好的临床结果。
调节细胞病理学严重度的因素包括：由于患者GAA等位基因的性质在患者中的残余GAA活性的存在；在治疗开始之时患者的年龄；以及患者的免疫响应。例如，对GILT-标记的GAA的抗体响应在CRIM-阴性患者中更严重。
基于来自初始动物试验的结果，GILT-标记的GAA预期将比未标记的GAA在人类患者治疗中更为有效。可以预测，给予类似的剂量，具有给定细胞病理学水平的更高比例的患者，在酶替代疗法开始时将会有利地响应于GILT-标记的GAA疗法。例如，在对于的关键临床试验中，18位患者中的12位在52周时肌肉中糖原降低超过20％。然而，仅仅18位中仅仅3位患者出现糖原含量降低50％或更高。Kishnani et al.(2007)Neurology，68：99-109。基于动物试验数据和Zhu等的工作，预期GILT-标记的GAA将会导致在大多数患者中糖原含量下降80％。用GILT-标记的GAA治疗的更大比例的患者预期将会显示在生理参数如运动功能、呼吸作用方面得到改进和提高，并且更多的患者预期将会在疗法开始后存活1、2和5年。
具有更晚期的肌细胞细胞病理学开始酶替代疗法的患者，例如大于6个月龄才开始疗法的患者，在GILT-标记的GAA酶替代疗法上也预期会在肌肉糖原上发生显著降低，在呼吸容量、运动功能和更好的长期疗效方面得以改进和提高。
参考文献的并入
在本申请中引述的所有出版物和专利文献都以其全文结合，如同将其每一单个出版物或专利文献的内容结合到本文中的程度一样。
【序列表】
<110>齐斯特治疗公司(ZYSTOR THERAPEUTICS，INC.)
<120>用于治疗庞贝氏症的方法
<130>P25884BAY
<140>PCT/US2007/023881
<141>2007-11-13
<160>8
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>1
ggaattccaa ccatgggagt gaggcacccg ccc 33
<210>2
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>2
gctctagact aacaccagct gacgagaaac tgc 33
<210>3
<211>276
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于生产重组GILT标记的GAA ZC-701的DNA盒
<400>3
gaattcacac caatgggaat cccaatgggg aagtcgatgc tggtgcttct caccttcttg 60
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tactgtgcta cccccgccaa gtccgagggc gcgccg 276
<210>4
<211>971
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>盒701用EcoRI和XbaI消化，通过用克伦诺DNA聚合酶处理钝化
<400>4
Met Gly Ile Pro Met Gly Lys Ser Met Leu Val Leu Leu Thr Phe Leu
1 5 10 15
Ala Phe Ala Ser Cys Cys Ile Ala Ala Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val
20 25 30
Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg
35 40 45
Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys
50 55 60
Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr
65 70 75 80
Pro Ala Lys Ser Glu Gly Ala Pro Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala
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100 105 110
Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys
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Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu
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Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile
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Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala
245 250 255
Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro
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Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu
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Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro
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Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu
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Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile
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Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe
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Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro
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Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile
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Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys
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Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro
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Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu
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Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His
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Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu
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Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro
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Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val
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Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys
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<220>
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atgggaatcc caatggggaa gtcgatgctg gtgcttctca ccttcttggc cttcgcctcg 60
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aacgacatct tcgaggccca gaagatcgag tggcacgaac ctttcgatct gactgaatgt 180
tcattcaaag atggggctgg caactccttc gacctctcgt ccctgtcaag gtacagtgac 240
aactgggaag ccatcactgg gacgggggac ccggagcact acctcatcaa tgtctgcaag 300
tctctggccc cgcaggctgg cactgagccg tgccctccag aagcagccgc gtgtctgctg 360
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actggtggtt atgaggctta tgatgagagt gaggatgatg cctccgatac caaccctgat 1140
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gccgctgtgt gcaaagttcc tattgatggt ccccccatag atatcggccg ggtagcagga 1260
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gagactcctg tcgtctgtcc tgatgaagtg aggatggatg gctgtaccct gacagatgag 1500
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caatcaatga aactggatta caggcaccag gatgaagcgg tcgttttaag ttacgtgaat 1740
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<210>6
<211>679
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<220>
<223>His-生物素-Ci-Mpr结构域10-13蛋白质序列
<400>6
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<210>7
<21l>2040
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>His-生物素-Ci-Mpr结构域10-13 I1572T。下划线序列变化导致点突变I1572T和生成诊断SpeI位点的沉默突变S1573。
<400>7
atgggaatcc caatggggaa gtcgatgctg gtgcttctca ccttcttggc cttcgcctcg 60
tgctgcattg ctgctggcgc gccgaccggt caccatcacc atcaccacgc gccgggcctg 120
aacgacatct tcgaggccca gaagatcgag tggcacgaac ctttcgatct gactgaatgt 180
tcattcaaag atggggctgg caactccttc gacctctcgt ccctgtcaag gtacagtgac 240
aactgggaag ccatcactgg gacgggggac ccggagcact acctcatcaa tgtctgcaag 300
tctctggccc cgcaggctgg cactgagccg tgccctccag aagcagccgc gtgtctgctg 360
ggtggctcca agcccgtgaa cctcggcagg gtaagggacg gacctcagtg gagagatggc 420
ataattgtcc tgaaatacgt tgatggcgac ttatgtccag atgggattcg gaaaaagtca 480
accaccatcc gattcacctg cagcgagagc caagtgaact ccaggcccat gttcatcagc 540
gccgtggagg actgtgagta cacctttgcc tggcccacag ccacagcctg tcccatgaag 600
agcaacgagc atgatgactg ccaggtcacc aacccaagca caggacacct gtttgatctg 660
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accaggacta gtgtgggcaa ggccaacaag aggctgagat acgtggacca ggtcctgcag 840
ctggtgtaca aggatgggtc cccttgtccc tccaaatccg gcctgagcta taagagtgtg 900
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actggtggtt atgaggctta tgatgagagt gaggatgatg cctccgatac caaccctgat 1140
ttctacatca atatttgtca gccactaaat cccatgcacg gagtgccctg tcctgccgga 1200
gccgctgtgt gcaaagttcc tattgatggt ccccccatag atatcggccg ggtagcagga 1260
ccaccaatac tcaatccaat agcaaatgag atttacttga attttgaaag cagtactcct 1320
tgcttagcgg acaagcattt caactacacc tcgctcatcg cgtttcactg taagagaggt 1380
gtgagcatgg gaacgcctaa gctgttaagg accagcgagt gcgactttgt gttcgaatgg 1440
gagactcctg tcgtctgtcc tgatgaagtg aggatggatg gctgtaccct gacagatgag 1500
cagctcctct acagcttcaa cttgtccagc ctttccacga gcacctttaa ggtgactcgc 1560
gactcgcgca cctacagcgt tggggtgtgc acctttgcag tcgggccaga acaaggaggc 1620
tgtaaggacg gaggagtctg tctgctctca ggcaccaagg gggcatcctt tggacggctg 1680
caatcaatga aactggatta caggcaccag gatgaagcgg tcgttttaag ttacgtgaat 1740
ggtgatcgtt gccctccaga aaccgatgac ggcgtcccct gtgtcttccc cttcatattc 1800
aatgggaaga gctacgagga gtgcatcata gagagcaggg cgaagctgtg gtgtagcaca 1860
actgcggact acgacagaga ccacgagtgg ggcttctgca gacactcaaa cagctaccgg 1920
acatccagca tcatatttaa gtgtgatgaa gatgaggaca ttgggaggcc acaagtcttc 1980
agtgaagtgc gtgggtgtga tgtgacattt gagtggaaaa caaaagttgt ctgcccttga 2040
<210>8
<211>679
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>His-生物素-Ci-Mpr结构域10-13 I1572T蛋白质序列。I1572T突变加了下划线。
<400>8
Met Gly Ile Pro Met Gly Lys Ser Met Leu Val Leu Leu Thr Phe Leu
1 5 10 15
Ala Phe Ala Ser Cys Cys Ile Ala Ala Gly Ala Pro Thr Gly His His
20 25 30
His His His His Ala Pro Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Ile Glu Trp His Glu Pro Phe Asp Leu Thr Glu Cys Ser Phe Lys Asp
50 55 60
Gly Ala Gly Asn Ser Phe Asp Leu Ser Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Asp
65 70 75 80
Asn Trp Glu Ala Ile Thr Gly Thr Gly Asp Pro Glu His Tyr Leu Ile
85 90 95
Asn Val Cys Lys Ser Leu Ala Pro Gln Ala Gly Thr Glu Pro Cys Pro
100 105 110
Pro Glu Ala Ala Ala Cys Leu Leu Gly Gly Ser Lys Pro Val Asn Leu
115 120 125
Gly Arg Val Arg Asp Gly Pro Gln Trp Arg Asp Gly Ile Ile Val Leu
130 135 140
Lys Tyr Val Asp Gly Asp Leu Cys Pro Asp Gly Ile Arg Lys Lys Ser
145 150 155 160
Thr Thr Ile Arg Phe Thr Cys Ser Glu Ser Gln Val Asn Ser Arg Pro
165 170 175
Met Phe Ile Ser Ala Val Glu Asp Cys Glu Tyr Thr Phe Ala Trp Pro
180 185 190
Thr Ala Thr Ala Cys Pro Met Lys Ser Asn Glu His Asp Asp Cys Gln
195 200 205
Val Thr Asn Pro Ser Thr Gly His Leu Phe Asp Leu Ser Ser Leu Ser
210 215 220
Gly Arg Ala Gly Phe Thr Ala Ala Tyr Ser Glu Lys Gly Leu Val Tyr
225 230 235 240
Met Ser Ile Cys Gly Glu Asn Glu Asn Cys Pro Pro Gly Val Gly Ala
245 250 255
Cys Phe Gly Gln Thr Arg Thr Ser Val Gly Lys Ala Asn Lys Arg Leu
260 265 270
Arg Tyr Val Asp Gln Val Leu Gln Leu Val Tyr Lys Asp Gly Ser Pro
275 280 285
Cys Pro Ser Lys Ser Gly Leu Ser Tyr Lys Ser Val Ile Ser Phe Val
290 295 300
Cys Arg Pro Glu Ala Gly Pro Thr Asn Arg Pro Met Leu Ile Ser Leu
305 310 315 320
Asp Lys Gln Thr Cys Thr Leu Phe Phe Ser Trp His Thr Pro Leu Ala
325 330 335
Cys Glu Gln Ala Thr Glu Cys Ser Val Arg Asn Gly Ser Ser Ile Val
340 345 350
Asp Leu Ser Pro Leu Ile His Arg Thr Gly Gly Tyr Glu Ala Tyr Asp
355 360 365
Glu Ser Glu Asp Asp Ala Ser Asp Thr Asn Pro Asp Phe Tyr Ile Asn
370 375 380
Ile Cys Gln Pro Leu Asn Pro Met His Gly Val Pro Cys Pro Ala Gly
385 390 395 400
Ala Ala Val Cys Lys Val Pro Ile Asp Gly Pro Pro Ile Asp Ile Gly
405 410 415
Arg Val Ala Gly Pro Pro Ile Leu Asn Pro Ile Ala Asn Glu Ile Tyr
420 425 430
Leu Asn Phe Glu Ser Ser Thr Pro Cys Leu Ala Asp Lys His Phe Asn
435 440 445
Tyr Thr Ser Leu Ile Ala Phe His Cys Lys Arg Gly Val Ser Met Gly
450 455 460
Thr Pro Lys Leu Leu Arg Thr Ser Glu Cys Asp Phe Val Phe Glu Trp
465 470 475 480
Glu Thr Pro Val Val Cys Pro Asp Glu Val Arg Met Asp Gly Cys Thr
485 490 495
Leu Thr Asp Glu Gln Leu Leu Tyr Ser Phe Asn Leu Ser Ser Leu Ser
500 505 510
Thr Ser Thr Phe Lys Val Thr Arg Asp Ser Arg Thr Tyr Ser Val Gly
515 520 525
Val Cys Thr Phe Ala Val Gly Pro Glu Gln Gly Gly Cys Lys Asp Gly
530 535 540
Gly Val Cys Leu Leu Ser Gly Thr Lys Gly Ala Ser Phe Gly Arg Leu
545 550 555 560
Gln Ser Met Lys Leu Asp Tyr Arg His Gln Asp Glu Ala Val Val Leu
565 570 575
Ser Tyr Val Asn Gly Asp Arg Cys Pro Pro Glu Thr Asp Asp Gly Val
580 585 590
Pro Cys Val Phe Pro Phe Ile Phe Asn Gly Lys Ser Tyr Glu Glu Cys
595 600 605
Ile Ile Glu Ser Arg Ala Lys Leu Trp Cys Ser Thr Thr Ala Asp Tyr
610 615 620
Asp Arg Asp His Glu Trp Gly Phe Cys Arg His Ser Asn Ser Tyr Arg
625 630 635 640
Thr Ser Ser Ile Ile Phe Lys Cys Asp Glu Asp Glu Asp Ile Gly Arg
645 650 655
Pro Gln Val Phe Ser Glu Val Arg Gly Cys Asp Val Thr Phe Glu Trp
660 665 670
Lys Thr Lys Val Val Cys Pro
675