一种水溶性斑蝥素和/或去甲斑蝥素壳聚糖衍生物及其制备方法 【技术领域】
本发明属于医药技术领域，涉及一种水溶性斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)壳聚糖衍生物及其制备方法。
背景技术
甲壳素存在于甲壳类生物的外壳，据估计地球上每年由生物产生的甲壳素约有100亿吨。甲壳素以其稳定性、韧性、金属离子络合性、黏度可调节性、生物可降解性、生物安全性等特点而闻名。壳聚糖是甲壳素的N-脱乙酰基产物，是自然界中唯一存在的碱性多糖。壳聚糖的分子量从几百到上百万道尔顿不等，脱乙酰化度为70-90％，并且分子量越小，脱乙酰度越高，在水中溶解性越好。壳聚糖中存在大量游离的氨基，使其成为自然界中为数不多的带正电的生物大分子，这一独特的结构赋予它独特的生物活性，使其成为一种具有广阔应用前景的生物材料。
壳聚糖的分子结构中有许多重复的活性基团，可以进行N-酰化反应、脱乙酰化反应，络合物形成反应，成盐反应，酯化反应，接枝聚合反应等。若把小分子物质接枝在壳聚糖骨架上，可能得到有较强缓控释能力的高分子药物或者避免突释的长效药物。并且，选择特殊的小分子物质对壳聚糖进行修饰，不但可以改变其理化性质，还可以得到药性互补的新型药物。
斑鳌素是斑鳌的有效成分，可以抑制细胞蛋白质的合成，影响细胞的生长分化，但因其对泌尿系有强烈刺激作用，限制了其在临床的推广应用。去甲斑蝥素是我国自行研制生产的新型抗肿瘤药物，是中药抗癌活性成分斑蝥素去除1，2位两个甲基合成而得，具有显著的抗癌活性，并且毒副作用较低，也是目前唯一具有升高白细胞作用的抗肿瘤药物。去甲斑蝥素对肝癌，食管鳞癌等细胞株的形态，增殖有破坏或抑制作用，可提高癌细胞呼吸控制率及溶酶体活性，干扰癌细胞分裂，抑制其DNA合成，并且对骨髓细胞无抑制作用。吸收后在肝、肾、脾、肠、癌组织中均有较高药物浓度，24小时内大部分经肾脏排泄，体内积蓄甚少。
本发明的目的是克服现有的制备方法的不足，提供一种水溶性，成本低的壳聚糖衍生物及其制备方法。
将壳聚糖和斑蝥素、去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)进行酰化反应，生成一种新的水溶性壳聚糖衍生物，具有抗肿瘤的药理活性。
【发明内容】
本发明的目的是克服现有的制备方法的不足，提供一种水溶性壳聚糖衍生物及其制备方法。
本发明提供的水溶性壳聚糖衍生物的化学结构式如下所示：
其中R，R’分别独立的选自于斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)，n为0.5-3000(壳聚糖的分子量为179-1,000,000)。
其中R1，R2分别独立的选自于氢、钠、钾、氨、锌、硒、锗。
本发明所述的水溶性壳聚糖衍生物的制备方法如下，(以下均以质量分数表示)：
方法1：将1-5份壳聚糖加入50-200份的纯净水/或稀酸溶液中，加热搅拌至完全溶解，0.1％-1.0％活性炭脱色，再加入催化剂0.1-1.0mL调pH值至中性或者弱碱性，然后加入1-15份的斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)，20-100℃下，搅拌反应1-10小时。反应完毕，将混合物溶液超滤除去小分子物质，冻干，也可以加入有机溶剂沉淀，抽虑收集沉淀，沉淀用有机溶剂清洗，离心，干燥，或者将沉淀分散于水中，透析1-5天，冻干，得到一种水溶性壳聚糖衍生物。其中壳聚糖分子量为179-1,000,000，稀酸为冰醋酸或者盐酸，有机溶剂为甲醇或者乙醇，催化剂为吡啶。
方法2：将1-5份壳聚糖加入50-200份的纯净水/稀酸溶液中，加热搅拌至完全溶解，0.1％-1.0％活性炭脱色，再加入1-15份的斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)，20-100℃下，搅拌反应10-48小时。反应完毕，将混合物溶液超滤除去小分子物质，冻干，也可以加入有机溶剂沉淀，抽虑收集沉淀，沉淀用有机溶剂清洗，离心，干燥，或者将沉定分散于水中，透析1-5天，冻干，得到一种水溶性壳聚糖衍生物。其中壳聚糖分子量为300-1,000,000，稀酸为冰醋酸或者盐酸，有机溶剂为甲醇、乙醇或者丙酮。
方法3：将1-5份壳聚糖加入5-20份的稀酸中，加热搅拌至完全溶解，0.1％-1.0％活性炭脱色，再加入5-200份的有机溶剂，然后加入1-15份的斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)，20-100℃下，搅拌反应10-48小时。反应完毕，加入碱性溶液调pH至进中性，产生沉淀，过滤收集沉淀，将沉淀分散于纯净水中，用碱性溶液调pH至碱性，透析1-5天，冻干，得到一种水溶性壳聚糖衍生物。其中壳聚糖分子量为10,000-1,000,000，稀酸为乳酸或者冰醋酸，有机溶剂为甲醇或者乙醇，碱性溶液为氢氧化钠，氢氧化钾水溶液(1-10％，w/v)，或者氨水。
本发明的一种水溶性壳聚糖衍生物的反应方程式如下所示
本发明一种水溶性壳聚糖衍生物的制备过程中采用水、稀酸和有机溶剂为反应介质，成本低，易于工业化。
【附图说明】
图1是壳聚糖(分子量2,000)的IR图谱
图2是壳聚糖(分子量3,000)的IR图谱
图3是壳聚糖(分子量10,000)的IR图谱
图4是去甲斑蝥素壳聚糖(分子量2,000)的IR图谱
图5是去甲斑蝥素壳聚糖(分子量3,000)的IR图谱
图6是去甲斑蝥素壳聚糖(分子量10,000)的IR图谱
图7是去甲斑蝥素壳聚糖(分子量2,000)的1HNMR图谱
图8是去甲斑蝥素壳聚糖(分子量2,000)的13CNMR图谱
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明做进一步的说明
本发明实施例采用的壳聚糖的分子量为179(n＝0.5)-1,000,000。
实施例1
将0.5g氨基葡萄糖(分子量179，n＝0.5)溶解于30mL纯净水中，室温搅拌溶解，加入0.15g活性炭40℃水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜。然后加入0.5g去甲斑蝥素，室温磁力搅拌反应10小时。加入丙酮30mL产生沉淀。抽虑收集沉淀，用丙酮清洗3次，45℃烘干。
实施例2
将0.5g壳聚糖(分子量2,000)溶解于30mL纯净水中，40℃水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40℃水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜。加入0.2mL吡啶调pH值至7，搅拌成均相。然后加入0.5g去甲斑蝥素，室温磁力搅拌反应3小时。将产物分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜，用截留分子量为1,000的超滤膜除去未参加反应小分子物质，冻干。图1为壳聚糖的红外光谱图，3439cm-1为羟基，氨基的OH，NH振动，1634cm-1，1524cm-1为壳聚糖与金属离子络合的显著特征峰。图2为去甲斑蝥素壳聚糖的红外光谱图，3426cm-1为羟基，氨基地OH，NH振动，1701cm-1为去甲斑蝥素壳聚糖中羧基的C＝O振动，1642cm-1为酰胺键的C＝O振动(I谱带)，1551cm-1为酰胺键的NH弯曲振动(II谱带)。图7为去甲斑蝥素壳聚糖的1HNMR图谱，δ4.7002ppm为溶剂重水的特征峰，δ4.8096ppm为H1，δ3.5-4.0ppm为H3-H6。图8为去甲斑蝥素壳聚糖的13CNMR图谱，δ182.718ppm为羧酸的羰基碳，δ177.240ppm和δ177.75ppm为酰胺键的羰基碳，δ100.556ppm为C1，δ79.012ppm为C4，δ77.490ppm为C5，δ72.844ppm为C3，δ60.080ppm为C6，δ58.601ppm为C2，δ24.783ppm为乙酰基中的甲基碳，说明壳聚糖没有完全脱乙酰化。δ82.119ppm和δ70.248ppm为C3’和C6’，δ62.691ppm和δ57.024ppm为C4’和C5’，δ21.749ppm和δ17.648ppm为C1’和C2’。红外和核磁都证明了去甲斑蝥素壳聚糖的结构。
实施例3
将0.5g壳聚糖(分子量3,000)溶解于30mL纯净水中，40℃水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40℃水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜。加入0.3mL吡啶调pH值至8，搅拌成均相。然后加入1.0g去甲斑蝥酸，40℃磁力搅拌反应3.5小时。将产物分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜，再加入50mL乙醇产生沉淀，抽虑收集沉淀，用乙醇清洗3次，45℃烘干。
实施例4
将1.0g壳聚糖(分子量5,000)溶解于60mL纯净水中，40℃水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40℃水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜。加入0.3mL吡啶调pH值至7，搅拌成均相。然后加入0.5g去甲斑蝥素酸钠，50℃磁力搅拌反应4小时。将产物分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜，再加入60mL乙醇产生沉淀，抽虑收集沉淀，用乙醇清洗3次，45℃烘干。
实施例5
将0.5g壳聚糖(分子量10,000)溶解于30mL 2％(质量分数)的醋酸水溶液中，40℃水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40℃水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜。加入0.6mL吡啶调pH值至7，搅拌成均相。然后加入0.5g去甲斑蝥素，0.5g斑蝥素，60℃磁力搅拌反应5小时。将产物分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜，用截留分子量为10,000的超滤膜除去未参加反应小分子物质，冻干。
实施例6
将1.0g壳聚糖(分子量20,000)溶解于60mL 2％(质量分数)的醋酸溶液中，40℃水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40℃水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜。加入0.8mL吡啶调pH值至9，搅拌成均相。然后加入0.5g去甲斑蝥酸，0.5g斑蝥素，60℃磁力搅拌反应5小时。将产物分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜，再加入70mL乙醇产生沉淀，抽虑收集沉淀，用乙醇清洗3次，45℃烘干。
实施例7
将0.5g壳聚糖(分子量50,000)溶解于30mL 2％(质量分数)的醋酸溶液中，40℃水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40℃水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜。加入0.6mL吡啶调pH值至7，搅拌成均相。然后加入1.5g去甲斑蝥素，70℃磁力搅拌反应6小时。将产物分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜，用截留分子量为50,000的超滤膜除去未参加反应小分子物质，冻干。
实施例8
称取2g壳聚糖(分子量100,000)置于反应器，加入2％(质量分数)的醋酸溶液120mL，加热搅拌下溶解形成均相溶液，加入0.15g活性炭40℃水浴加热脱色30m i n，抽滤，分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜。称取2g去甲斑蝥素，使之溶于5mL丙酮，搅拌下加入反应器，在室温下反应15小时。将产物分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜，再用丙酮提纯，烘干。
实施例9
1.0g壳聚糖(分子量400,000)溶解于4.8％(v/v)乳酸水溶液中(21mL)，加入0.15g活性炭40℃水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜。然后加入80mL甲醇稀释，混合均匀。再加入3.0g去甲斑蝥素，室温搅拌反应24小时。用5％w/v NaOH水溶液调pH值至5，产生沉淀。过滤收集沉淀，再将沉淀分散于50mL水中，用5％w/v NaOH水溶液调pH值至12，用透析袋(截留分子量12000-14000)透析3天，然后冻干得产物。
实施例10
将1.0g壳聚糖(分子量3,000)溶于30mL水中，40℃水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40℃水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜。加入30mL无水乙醇，再加0.5mL吡啶调pH值至6并搅拌成均相；加入1.0g NCTD，室温反应2小时。产物用250mL无水乙醇沉淀、离心、再用无水乙醇清洗3次，然后分散于30mL纯净水中，透析3天，冻干。
实施例11
称取0.1g壳聚糖(分子量3,000)溶于10mL水中，40℃水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40℃水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8μm，0.45μm微孔滤膜。加入40mL无水乙醇，再加0.2mL吡啶调pH值至6并搅拌成均相；加入0.2g NCTD，室温搅拌反应2小时。过滤收集沉淀，烘干。
实施例12抗肿瘤、升白与注射部位刺激性实验
实验组：“实施例2”产物，用生理盐水配成所用浓度。
阳性对照：5-FU(5-氟尿嘧啶)；去甲斑蝥素(NCTD)；壳聚糖(分子量2,000)。试验动物和瘤株：18-22g昆明小鼠，来源：沈阳药科大学实验动物室。肉瘤(S 180)由中国医科大学提供。
实验方法：取70只小鼠，体重18～22g，每只小鼠皮下注射S180肉瘤细胞混悬液0.2ml(约2×106个瘤细胞)。动物移植瘤株后，随机分组、编号、称体重，随机均分7组：对照组(生理盐水，NS)、实验组高、中、低剂量、阳性对照组，给药途径，尾静脉注射，NS对照组(10m l·kg-1)、实验高剂量(20mg·kg-1)，中剂量(10mg·kg-1)、低剂量(5mg·kg-1)和5-FU(20mg·kg-1)、NCTD(20mg·kg-1)、壳聚糖(分子量2,000)(20mg·kg-1)，每天1次，连续10天(注：5-FU隔3天给药一次，供给药4次)，末次给药后24h，称动物体重后脱颈椎处死，剥取瘤体组织称重，并计算抑瘤率。
结果：实验组的抑瘤率分别为60.8％、40.6％、32.9％，阳性对照组(5-FU)的抑瘤率为59.4％。
实验组的白细胞数(×109·L-1)依次分别为：9.82、15.4、15.0；阳性对照组(5-FU)的白细胞数(×109·L-1)为2.28；生理盐水组的白细胞数(×109·L-1)为8.36；NCTD组的白细胞数(×109·L-1)为10.2。即所合成的衍生物具有升白作用。数据见表1。
表1、对小鼠S180的抑瘤作用与升白作用
备注：实验过程中发现，在第二次给药时，NCTD组小鼠尾部已经有轻微的糜烂，第四次给药时，部分小鼠的尾部已经断裂；余下其它各组的小鼠尾部正常。