《一种疫苗组合物及其制备方法和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种疫苗组合物及其制备方法和应用.pdf（17页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104043117A43申请公布日20140917CN104043117A21申请号201310076689122申请日20130311CCTCCNOV20111920110609CCTCCNOV20111820110609A61K39/23200601A61P31/14200601A61P31/20200601A61P15/08200601A61K39/1220060171申请人普莱柯生物工程股份有限公司地址471000河南省洛阳市高新区凌波路5号72发明人张许科孙进忠白朝勇74专利代理机构北京华夏正合知识产权代理事务所普通合伙11017代理人韩登营54发明名称一种疫苗组合。
2、物及其制备方法和应用57摘要本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的猪圆环病毒2型抗原、免疫量的猪乙型脑炎病毒抗原、免疫量的猪细小病毒抗原以及佐剂。该疫苗能有效的防治由猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒和猪细小病毒引起的断奶仔猪多系统综合征和母猪繁殖障碍性疾病，免疫效果优于单苗的效果，副反应小，血清抗体效价高，免疫期持续长，耗时少，费力少，对猪的应激反应小，简化了免疫程序，降低生产成本和预防成本。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书15页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书15页10申请公布号CN104043117ACN104043117A。
3、1/1页21一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪圆环病毒2型抗原、免疫量的猪乙型脑炎病毒抗原、免疫量的猪细小病毒抗原以及佐剂。2根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型全病毒抗原，含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分；所述猪乙型脑炎病毒抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪乙型脑炎全病毒抗原，含有猪乙型脑炎免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，含有猪乙型脑炎免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分；所述猪细小病毒抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形。
4、式的猪细小全病毒抗原，含有猪细小免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，含有猪细小免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分。3根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述的猪圆环病毒2型抗原为PCV2SH株灭活株，所述猪乙型脑炎病毒抗原为猪乙型脑炎病毒SD2011株灭活株，所述猪细小病毒抗原为猪细小病毒HN2011株灭活株。4根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述的猪圆环病毒2型抗原为10601070TCID50/ML，所述猪乙型脑炎病毒抗原为10601080TCID50/ML，所述猪细小病毒抗原为10601080TCID50/ML。5根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述的猪圆环病毒2型抗原为106。
5、5TCID50/ML，所述猪乙型脑炎病毒抗原为1070TCID50/ML，所述猪细小病毒抗原为1070TCID50/ML。6根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、GEL01、蜂胶、ISA206、ISA760VG，优选卡波姆、GEL01、ISA206、ISA760VG，更优选GEL01、ISA206，更优选为ISA206。7根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物进一步包含赋形剂。8一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括1分别培养增殖猪圆环病毒2型，猪乙型脑炎病毒，猪细小病毒；2分别灭活猪圆环病毒2型，猪乙型脑炎病毒，猪细小病毒；3按比。
6、例混合所述灭活猪圆环病毒2型全病毒抗原，灭活猪乙型脑炎病毒全病毒抗原，灭活猪细小病毒全病毒抗原，加入佐剂，乳化。9根据权利要求8所述的制备方法，其中，所述灭活猪圆环病毒2型全病毒抗原，所述灭活猪乙型脑炎病毒全病毒抗原，和所述灭活猪细小病毒全病毒抗原比例为体积比111。10根据权利要求17任一项所述的疫苗组合物在预防和治疗断奶仔猪多系统综合征和/或母猪的繁殖障碍性疾病中的应用。权利要求书CN104043117A1/15页3一种疫苗组合物及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及一种能够预防和治疗断奶仔猪多系统综合征和母猪繁殖障碍性疾病的疫苗组合物。背景技术0002猪圆环病毒病或称猪圆环病毒相关。
7、性疾病是主要由猪圆环病毒2型PORCINECIRCOVIRU2，PCV2引起的免疫抑制性疾病，表现为断奶后仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍、仔猪心肌炎、增生性和坏死性肺炎和中枢神经系统疾病等。猪圆环病毒主要侵害512周龄仔猪，主要临床表现为体重下降、呼吸困难、黄疸、间质性肺炎、淋巴结肿大、肝炎和肾炎等；组织病理学损伤表现主要是以凋亡为特征的全身性淋巴细胞缺失以及组织细胞和多核巨噬细胞的浸润为主。猪圆环病毒是近几年新出现的一种危害养猪业较为严重的病原，对外界环境的抵抗力较强，猪群一旦感染猪圆环病毒就很难根除。很多研究表明，PCV2单独感染并不会引起典型的断奶仔。
8、猪多系统衰竭综合征症状，而免疫系统的活化及其他病原体的混合感染能促进该症状的发生。最常见的混合感染有PRV，PPV，PRRSV等，有的呈现二重感染或三重感染，其感染猪的病死率也大大提高。0003日本乙型脑炎JAPANESEENCEPHATILIS，简称JE，简称乙脑，是一种由乙型脑炎病毒引起的人畜共患的蚊媒病毒性传染病，主要引起人和动物中枢神经系统症状。该病最早于1935年在日本发现，在1940年我国学者在患者脑组织中分离到该病毒。乙型脑炎病毒属于黄病毒属，在病毒膜蛋白囊膜表面有血凝素刺突，可以凝集鹅、鸡、羊等动物红细胞。该病毒对外界环境抵抗力不强，56维持30MIN或者100维持2MIN即可。
9、将其灭活。病毒的稀释度越高，病毒死亡越快，病毒对酸和胰酶较敏感，但对低温和干燥的抵抗力很强。10脑组织生理盐水悬液在70可保存1年，毒力不降低，在20可保存1年，但毒力有所降低。乙型脑炎为自然疫源性疾病，蚊虫为主要传播媒介。该病的发生与气候环境有密切的关系，具有明显的季节特征。猪是该病最主要的传染源和贮存宿主，感染后可长期带毒，血液中病毒滴度较高，呈隐形感染。乙型脑炎病毒对不同年龄、性别和品种的猪都可感染。成年猪感染乙脑时，无明显的脑炎症状，怀孕母猪感染后导致流产和死胎，公猪感染后睾丸有急性炎症。0004乙型脑炎是危害养猪业的重要疾病之一，常给养猪业造成巨大的经济损失。目前乙脑没有特效的治疗方。
10、法，所谓的治疗主要是支持性的对症治疗，皮质类固醇和抗炎症的药物曾被用于治疗乙脑，但是效果不显著。对于乙型脑炎预防控制的方法是灭蚊和疫苗接种。在蚊虫控制措施难以全面落实的情况下，疫苗接种成了控制疾病最为有效的方法。传统的灭活苗和弱毒疫苗在控制和预防乙脑的过程中发挥重要的作用。世界范围内常见的兽用乙脑疫苗在日本有两种活疫苗，ML17株和JAOH0566株，我国目前猪用的主要是鼠脑灭活疫苗，VERO细胞灭活疫苗和乙脑SA14142株、28、53株减毒活疫苗。0005猪细小病毒病由猪细小病毒PPV引起的母猪繁殖障碍疾病，特征是孕猪在怀孕说明书CN104043117A2/15页4早期受到猪细小病毒感染经。
11、胎盘或胎儿引起母猪流产，不孕，产死胎、畸形胎及木乃伊胎等。猪细小病毒病在世界范围内普遍存在，在大多数感染猪场呈地方性流行。该病广泛分布、在美、亚及大洋洲的很多国家都有报道；在我国的各省市中也相继分离到猪细小病毒，血清检测阳性率很高。该病对养猪业造成长期重大的经济损失，严重阻碍了世界养猪业的健康发展。目前PPV尚无有效的药物治疗方法，因此对该病的预防免疫就显的至关重要了。目前PPV疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亚单位疫苗、以及基因工程活病毒载体疫苗等。0006猪圆环病毒2型，猪乙型脑炎病毒和猪细小病毒均能引起母猪的繁殖障碍，在临床上可见混合感染的情况，常常会造成严重的临床症状。猪圆环病。
12、毒2型单独感染并不能引发明显的临床症状，以隐性感染的状态存在，而在混合感染的情况下，常常会加重其临床症状，并且会造成免疫抑制，在客观上会降低单苗的免疫效果。0007此外，在临床上可见的猪圆环病毒和猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒的混合感染，对于这三种疾病的防治主要是用猪圆环病毒2型和猪细小病毒及猪乙型脑炎病毒的单价疫苗分别进行注射，需要多次免疫，免疫程序繁琐，工作量大，成本也较高。0008目前，预防PCV2，JEV和PPV的感染主要依赖于疫苗免疫，目前市售有PCV2灭活疫苗、PPV灭活苗，JEV灭活以及活疫苗，PPVJEV二联灭活疫苗，并无“猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎和猪细小病毒病三联疫苗”产品生产。
13、和销售。现有疫苗的缺点在于需要分次免疫，至少需要免疫两针才能防止断奶仔猪多系统综合征和母猪的繁殖障碍性疾病，成本高，操作程序繁琐，使感染的风险加大，引起猪群的应激反应加大，可能会导致部分猪群免疫失败等问题。0009为了有效解决三种病原混合感染的问题，本领域需要一种疫苗组合物，该组合物含有三种病原抗原成分来同时预防三种疾病。组合疫苗可提供许多单价疫苗所不具备的明显益处，能最大限度的控制疾病的发生。然而，对于组合疫苗未曾想到的问题是近期确认的在组合疫苗中一种疫苗可能会对另一种疫苗具不利影响，所谓“抗原干扰效应”。已经发现，当简单地将两种现有疫苗混合时，一种或两种皆可能会失去其效力参见专利申请CN1。
14、01035559A。发明内容0010为解决现有技术的不足，本发明提供了一种含猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒及猪细小病毒三种抗原的疫苗，使用后可达到同时预防由猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒和猪细小病毒引起的断奶仔猪多系统综合征和母猪繁殖障碍性疾病，并降低临床应激反应。0011该疫苗能有效的防治由猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒和猪细小病毒引起的断奶仔猪多系统综合征和母猪繁殖障碍性疾病。该产品的免疫效果优于单苗的效果，副反应小，血清抗体效价高，免疫期持续长，耗时少，费力少，对猪的影响也小。这样既简化了免疫程序，由降低生产成本和预防成本，实用性强。0012联合疫苗不仅方便、多效、低成本，与单一疫苗相比。
15、，还可以减少疫苗接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、存贮、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，说明书CN104043117A3/15页5使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。0013本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪圆环病毒2型抗原、免疫量的猪乙型脑炎病毒抗原、免疫量的猪细小病毒抗原以及佐剂。0014所述猪圆环病毒2型抗原是指包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪圆环病毒2型感染的免疫应答的抗原的组合。
16、物。所述猪圆环病毒2型抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。0015所述猪乙型脑炎病毒抗原是指包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪乙型脑炎病毒感染的免疫应答的抗原的组合物。所述猪乙型脑炎病毒抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪乙型脑炎病毒感染的免疫应答。0016所述“猪细小病毒抗原”、“PPV抗原”是指当所述抗原对免疫动物，特别地，所述免疫动物为猪，给药时，可诱导、刺激或增强免疫动物抵抗PPV感染的免疫应答。所述猪细小病毒抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪细小病毒感染的免疫应答。0017优选地，所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型。
17、全病毒抗原，含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分；所述猪乙型脑炎病毒抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪乙型脑炎全病毒抗原，含有猪乙型脑炎免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，含有猪乙型脑炎免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分；所述猪细小病毒抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪细小全病毒抗原，含有猪细小免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，含有猪细小免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分。0018本发明疫苗组合物中，所述猪圆环病毒抗原可以是江苏南农高科猪圆环病毒2型灭活疫苗的SH株、成都天邦和福州大北农猪圆环病毒2型灭活疫苗的DB。
18、NSX07株、哈尔滨维科猪圆环病毒2型灭活疫苗的LG株、武汉科前猪圆环病毒2型灭活疫苗的WH株中的一种或几种。0019本发明的PPV抗原可以包含以下组合物中的任一种抗原，如辉瑞公司生产的PPV灭活疫苗，武汉中博生物股份有限公司的PPV灭活疫苗CP99株，中牧实业股份有限公司的PPV灭活疫苗WH1株，上海科立特农科集团有限公司的猪细小病毒油乳剂灭活疫苗。0020优选地，所述的猪圆环病毒2型抗原为PCV2SH株灭活株，所述猪乙型脑炎病毒抗原为猪乙型脑炎病毒SD2011株灭活株，所述猪细小病毒抗原为猪细小病毒HN2011株灭活株。0021所述猪圆环病毒2型SH株PORCINECIRCOVIRUSTY。
19、PE2，STRAINSH，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期2008年3月4日，保藏号为CGMCCNO2389。0022所述的猪乙型脑炎病毒SD2011株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期2011年6月9日，保藏号为CCTCCNOV201119。0023所述猪细小病毒HN2011株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期2011年6月9日，保藏号为CCTCCNOV201118。0024优选地，所述的猪圆环病毒2型抗原为10601070TCID50/ML，所述猪乙型脑炎病说明书CN104043117A4/15页6毒抗原为10601080TCID50/。
20、ML，所述猪细小病毒抗原为10601080TCID50/ML。0025更优选地，所述的猪圆环病毒2型抗原为1065TCID50/ML，所述猪乙型脑炎病毒抗原为1070TCID50/ML，所述猪细小病毒抗原为1070TCID50/ML。0026优选地，所述佐剂包括氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、GEL01、蜂胶、ISA206、ISA760VG，优选卡波姆、GEL01、ISA206、ISA760VG，更优选GEL01、ISA206，更优选为ISA206。0027优选地，所述疫苗组合物进一步包含赋形剂。0028本发明的另一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括00291分别培养增殖猪。
21、圆环病毒2型，猪乙型脑炎病毒，猪细小病毒；00302分别灭活猪圆环病毒2型，猪乙型脑炎病毒，猪细小病毒；00313按比例混合所述灭活猪圆环病毒2型全病毒抗原，灭活猪乙型脑炎病毒全病毒抗原，灭活猪细小病毒全病毒抗原，加入佐剂，乳化。0032优选地，所述制备方法中灭活方法为甲醛灭活法；甲醛溶液以40体积的含量计终浓度为0102V/V。0033优选地，所述灭活猪圆环病毒2型全病毒抗原，所述灭活猪乙型脑炎病毒全病毒抗原，和所述灭活猪细小病毒全病毒抗原比例为体积比111。0034本发明的再一目的在于提供所述的疫苗组合物在预防和治疗断奶仔猪多系统综合征和/或母猪的繁殖障碍性疾病中的应用。0035本发明所述。
22、的猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒和猪细小病毒三联灭活苗，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便，与现有技术中的分次免疫相比，节约了成本，简化了繁琐的免疫程序，经济实用性较强。通过三联灭活苗与猪圆环单苗同猪乙脑、细小二联苗联用免疫仔猪和后备母猪的效力比较发现，本发明的三联苗安全性更佳，避免了多次接种带来的不良反应。具体实施方式0036下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本。
23、发明的保护范围内。0037以下以PCV2SH株、JEVSD2011株和PPVHN2011株为例说明本发明0038实施例1、猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒和猪细小病毒三联灭活疫苗组合物，猪乙型脑炎病毒和猪细小病毒二联苗的制备和检验00391毒株的来源0040本发明实施例中的PCV2PPVJEV三联疫苗中使用的PCV2病毒为PCV2SH株，本发明实施例中的PCV2PPVJEV三联苗以及PPVJEV二联苗中使用的JEV毒株为SD2011株，本发明实施例中的PCV2PPVJEV三联疫苗以及PPVJEV二联苗中使用的PPV毒株为HN2011株。00412疫苗半成品的制备及检验004221生产用毒种的制备说明。
24、书CN104043117A5/15页70043211猪圆环病毒2型SH株的制备0044将PCV2SH株毒种用病毒稀释液即无血清MEM培养基适当稀释，以001MOI感染复数接种于长满单层的PK15细胞CCTCC，编号GDC0060培养，37吸附30MIN，加入含4V/V犊牛血清和2MMOL/L的D氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37培养4日，冻融23次，收获病毒。0045212猪乙型脑炎病毒的制备0046将JEVSD2011株毒种用病毒稀释液即无血清MEM培养基适当稀释，以001MOI感染复数接种于长满单层的BHK细胞CCTCC，编号GDC0060培养，37吸附1H，加入含4V/V犊牛血清和2。
25、MMOL/L的D氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37培养4日，冻融23次，收获病毒。0047213猪细小病毒HN2011株的制备0048将PPVHN2011株毒种用病毒稀释液即无血清的MEM培养基适当稀释，以001MOI感染复数接种于长满单层的ST细胞CCTCC，编号GDC0060培养，37吸附30MIN，加入含1V/V犊牛血清和2MMOL/L的D氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37培养4日，冻融23次，收获病毒。004922病毒液的培养制备0050221猪圆环病毒2型SH株的制备0051采用转瓶细胞培养法，将长满单层的PK15细胞，倒去细胞培养液，将毒种液按001MOI的接种量接种于PK。
26、15细胞上，37吸附30MIN，加入细胞维持液，置37旋转1012转/小时培养。每日观察12次，细胞生长良好，37培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置20以下保存，应不超过2个月。0052222猪乙型脑炎病毒SD2011株病毒液的制备0053用转瓶细胞培养法。将长满单层的BHK细胞，倒去细胞培养液，将毒种液按001MOI的接种量接种于BHK细胞上，37吸附30MIN，加入细胞维持液，置37旋转1012转/小时培养。每日观察12次，细胞生长良好，37培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置20以下保存，应不超过2个月。0054223猪细小病毒HN2011株病毒液的制备0055用转瓶细胞培养法。将。
27、长满单层的ST细胞，倒去细胞培养液，将毒种液按001MOI的接种量接种于ST细胞上，37吸附30MIN，加入细胞维持液，置37旋转1012转/小时培养。每日观察12次，细胞生长良好，37培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置20以下保存，应不超过2个月。005623病毒液的处理0057231猪圆环病毒2型SH株病毒液的处理0058将病毒液用中空纤维滤柱孔径10M与045M过滤，除去细胞碎片。0059232猪乙型脑炎病毒SD2011株病毒液的处理0060将病毒液用中空纤维滤柱孔径10M与045M过滤，除去细胞碎片。0061233猪细小病毒HN2011株病毒液的处理0062将病毒液用中空纤维滤柱孔。
28、径10M与045M过滤，除去细胞碎片。006324病毒液浓缩说明书CN104043117A6/15页80064将除去细胞碎片后的PCV2SH株、JEVSD2011株和PPVHN2011株病毒液分别用超滤浓缩系统进行浓缩。006525病毒含量测定0066251猪圆环病毒2型SH株病毒含量的测定0067将病毒液用MEM维持液做10倍系列稀释，取105、106、1073个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔01ML，同时设正常细胞对照，在37、5CO2的温箱中继续培养24小时，换含2MM的D氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试。
29、验IFA测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞呈绿色的孔数，根据KARBER氏法计算病毒TCID50。0068252猪乙型脑炎病毒SD2011株病毒含量的测定0069将收获的病毒液做10倍系列稀释，取105、106、107、108、1095个稀释度，分别接种于BHK细胞单层的96孔细胞培养板上，每个稀释度做4孔，每孔100L。同时设正常细胞对照，置37、5CO2培养箱中培养5日，观察细胞病变CPE，根据KARBER氏法计算病毒TCID50。0070253猪细小病毒HN2011株病毒含量的测定0071将收获的病毒液做10倍系列稀释，取105、106、107、108、1095个稀释度，分别接种ST细胞。
30、单层的96孔细胞培养板上，每个稀释度做4孔，每孔100L。同时设正常细胞对照，置37、5CO2培养箱中培养5日，观察细胞病变CPE，根据KARBER氏法计算病毒TCID50。0072254三种抗原浓缩后含量的测定结果0073按上述的方法分别生产了PCV2SH株、JEVSD2011株和PPVHN2011株病毒抗原，PCV2SH病毒液含量为1080TCID50/ML，JEVSD2011株病毒液的含量为1090TCID50/ML，PPVHN2011株病毒液含量为1090TCID50/ML，结果见表1。0074表1各抗原浓缩后含量0075抗原灭活前含量猪圆环病毒2型SH株1080TCID50/ML猪乙。
31、型脑炎SD2011株1090TCID50/ML猪细小病毒HN2011株1090TCID50/ML007626病毒液的灭活0077261猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活0078病毒液加入甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为02V/V，随即充分摇匀升温，当温度升至37时开始计时，保持18小时灭活完毕，期间每6小时振荡混匀一次，置28保存，应不超过1个月。0079262猪乙型脑炎病毒SD2011株病毒液的灭活0080病毒液加入甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为015V/V，随即充分摇匀升温，当温度升至37时开始计时，保持24小时灭活完毕，期间每6小时振荡混匀一次，置说明书CN104043117A7/1。
32、5页928保存，应不超过1个月。0081263猪细小病毒HN2011株病毒液的灭活0082病毒液加入甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为01V/V，随即充分摇匀升温，当温度升至37时开始计时，保持24小时灭活完毕，期间每6小时振荡混匀一次，置28保存，应不超过1个月。008327病毒液灭活效果检验0084271猪圆环病毒2型SH株病毒液灭活检验0085取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15细胞，37吸附1小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37培养2日，应无CPE，连续盲传3次，长成细胞单层后换成细胞维持液，37培养2日，用IFA法检测，应无绿色PCV2阳性细胞产生。0086272猪乙型脑炎病。
33、毒SD2011株病毒液灭活检验0087取少量灭活病毒液接种已长成单层的BHK细胞，37吸附1小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37培养2日，连续盲传3次，应无CPE。0088273猪细小病毒SH2011株病毒液灭活检验0089取少量灭活病毒液接种已长成单层的ST细胞，37吸附1小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37培养2日，连续盲传3次，应无CPE。0090274灭活结果0091PCV2SH株无绿色PCV2阳性细胞，JEVSD2011株无CPE，PPVHN2011株无CPE。009228灭活苗L、M、H、13的配制0093281防腐剂的配制1W/V的硫柳汞水溶液。0094282稀释剂的配制。
34、无菌的PBS缓冲液，PH为74。0095283通过无菌操作各成分按表27的比例混合，以300转/分钟搅拌30MIN即可。0096表2疫苗L的配方及含量0097说明书CN104043117A8/15页100098表3疫苗M的配方及含量00990100表4疫苗H的配方及含量0101说明书CN104043117A109/15页110102表5疫苗1的配方及含量01030104表6疫苗2的配方及含量0105说明书CN104043117A1110/15页120106表7疫苗3的配方及含量01070108010928性状检验和无菌检验0110疫苗应为白色乳状，长时间静置底部有少量沉淀，振荡后呈均匀混悬液，。
35、检测结果性状为灰白色乳剂；按中华人民共和国兽药典2005年版附录169171页进行，疫苗应无菌生长。无菌检验结果显示无菌生长，符合要求。011129安全检验0112用2835日龄PCV2抗体、JEV抗体及PPV抗体均为阴性仔猪，颈部注射各种疫苗进行安全检验。各颈部肌肉注射三联灭活疫苗4ML，观察14，注苗局部无严重反应，且全部健活为合格。结果表明各疫苗均合格，注射部位、全身、脏器均未见异常。0113实施例2、本研究是为了评价不同抗原含量PCV2PPVJEV组合三联疫苗以及说明书CN104043117A1211/15页13PPVJEV二联苗与PCV2单苗的免疫效力01141试验材料0115按照实。
36、施例1中的方法制备PCV2PPVJEV三联苗PCV2抗原含量为1060TCID50/ML，PPV为1060TCID50/ML，JEV为1060TCID50/ML，记为疫苗L；PCV2PPVJEV三联苗PCV2抗原含量为1065TCID50/ML，PPV抗原含量为1070TCID50/ML，JEV抗原含量为1070TCID50/ML，记为疫苗M；PCV2PPVJEV三联苗PCV2抗原含量为1070TCID50/ML，PPV抗原含量为1080TCID50/ML，JEV抗原含量为1080TCID50/ML，记为疫苗H；低剂量的PCV2PPVJEV三联苗PCV2抗原含量为51055TCID50/ML，。
37、PPV抗原含量为1070TCID50/ML，JEV抗原含量为1070TCID50/ML，记为疫苗1；PCV2灭活疫苗PCV2抗原含量为1065TCID50/ML记为疫苗2；PPVJEV二联苗PPV抗原含量为1070TCID50/ML，JEV抗原含量为1070TCID50/ML记为疫苗3。01162动物试验设计011721疫苗免疫0118选用28日龄健康易感仔猪65头，分成13组，每组5头，第1，2组每头颈部肌肉注射疫苗L各2ML，第3，4组注射疫苗M各2ML，第5，6组注射疫苗H各2ML，第7，8组注射疫苗1各2ML，第9组注射疫苗2各2ML，第10组注射疫苗3各2ML，两周后按相同途径和剂量。
38、进行第2次接种；第11组非免疫PCV2SH株攻毒对照，第12组作空白对照非免疫、非攻毒，均隔离饲养观察。011922PCV2SH攻毒0120首免后第120天，对第1，3，5，7，9和11组仔猪采血，并用PCV2SH株含1065TCID50/ML滴鼻1ML、肌肉注射2ML，隔离饲养。攻毒第4、7日，第16组分别在每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白KLH/ICFA，05MG/ML，每个点接种1ML4ML/头，同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ML/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ML/头。攻毒后连续观察25日，于第25日称重后，。
39、采血，扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。攻毒对照组应至少4头发病，免疫组应至少4头保护。012123JEV和PPV效力检验0122在首免后14D，35D，120D，155D对其余未攻毒的仔猪采血，以检测血清JEV和PPV的HI抗体效价。01233效力检验结果012431PCV2SH株效力检验结果0125表8PCV2SH株免疫保护结果0126说明书CN104043117A1312/15页140127注病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等。0128体重变化分别在攻毒前及宰杀时对7组仔猪进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS170。
40、进行统计分析，结果表明疫苗免疫组猪相对日增重与空白对照组相似P05005，但明显高于非免疫攻毒对照组P0015005。0129由病变观察和体重变化结果证明实施例1中试制的疫苗M、疫苗H和疫苗1在免疫120D后对PCV2的攻击保护率达到100，而疫苗L和疫苗2对PCV2的攻毒保护率为80。三种不同抗原剂量的疫苗，即疫苗L，疫苗M和疫苗H均能对仔猪产生较好的免疫保护，抗原含量越大，保护效果越好。当PCV2抗原含量减半，疫苗1的免疫保护仍为100，这可能是JEV和PPV抗原对PCV2抗原的免疫效应产生了协同作用；疫苗M和疫苗H的免疫保护率高于疫苗2，证明含有相同或更高抗原含量的PCV2抗原的三联疫苗。
41、免疫保护效果优于单苗。0130表9PCV2免疫持续期抗体水平比较结果01310132说明书CN104043117A1413/15页150133ELISA抗体检测和血清中和抗体检测结果显示，试制疫苗M和疫苗H在免疫后14D即检测到较高的PCV2抗体，免疫后35D，抗体水平达到峰值，在免疫后120D后抗体仍能维持较高的保护水平，中和抗体水平与ELISA抗体水平趋势一致；而试制疫苗L和疫苗1在免疫后120DELISA抗体水平下降到12880，中和抗体水平效价降至1288，较疫苗M和H水平低，但高于疫苗2。表明实施例1中试制的疫苗M和疫苗H免疫动物120D后仍能刺激机体产生较高保护水平的PCV2抗体，。
42、疫苗L和疫苗1效果次之，而疫苗2效果较差。013432JEV效力检验结果0135表10JEV免疫持续期抗体水平比较结果01360137表10结果显示各组疫苗在免疫14D检测到抗体水平，在免疫后35D抗体水平达到峰值，而在免疫后120D，各组抗体水平均有所下降，而疫苗M和疫苗H的抗体水平仍维持在较高水平，而其他疫苗组抗体水平明显降低。由此证明，含有一定抗原含量的三联疫苗JEV抗体水平在免疫后120D仍能维持较高水平，而1/2全PCV2含量的疫苗1，较全含量PCV2疫苗M抗体水平较低，尤其在免疫后120D抗体水平下降较明显，这可能是因为PCV2抗原含量减少，对JEV的协同作用减弱，使其抗体水平有所。
43、降低，但抗体水平始终高于疫苗3。013833PPV的效力检验结果0139表11PPV免疫持续期抗体水平比较结果0140说明书CN104043117A1514/15页160141表11结果与JEV的HI抗体水平变化趋势相似，同样各组疫苗在免疫14D检测到抗体水平，在免疫后35D抗体水平达到峰值，而在免疫后120D，各组抗体水平均有所下降，而疫苗M和疫苗H的抗体水平仍维持在较高水平，而其他疫苗组抗体水平明显降低。由此证明，含有一定抗原含量的三联疫苗PPV抗体水平在免疫后120D仍能维持较高水平，而1/2全PCV2抗原含量51055TCID50/ML的疫苗1，较全含量PCV2抗原1065TCID50。
44、/ML的疫苗M抗体水平较低，尤其在免疫后120D抗体水平下降较明显，这可能同样是因为PCV2抗原含量减少，对PPV得协同作用减弱，使其抗体水平有所降低，但在各时间点的抗体水平仍高于疫苗3。01424小结与讨论0143三联灭活疫苗中抗原含量在一定范围内，各抗原抗体水平会随着抗原量的增加而升高，当抗原增加到一定量，抗体的上升趋势不明显甚至停止；JEV和PPV抗原对PCV2抗原抗体水平的协同作用最为明显，即在1/2全PCV2含量时，PCV2抗体水平仍能达到全PCV2含量时的水平，并维持较长的免疫持续期。0144实施例3、本研究是为了评价PCV2PPVJEV三联组合疫苗以及PPVJEV二联苗与PCV2。
45、单苗联用免疫母猪后的繁殖性能以及仔猪生长性能01451、试验材料0146按照实施例1中的方法制备PCV2PPVJEV三联苗PCV2抗原含量为1065TCID50/ML，PPV抗原含量为1070TCID50/ML，JEV抗原含量为1070TCID50/ML，记为疫苗M；PCV2灭活疫苗PCV2抗原含量为1065TCID50/ML记为疫苗2；PPVJEV二联苗PPV抗原含量为1070TCID50/ML，JEV抗原含量为1070TCID50/ML记为疫苗3。01472、动物试验设计014821攻毒试验设计选后备母猪30头，分为3组，每组10头。在免疫之前对各组母猪采血检测，检测血液中病毒血症情况。检。
46、测完毕后，对第1组每头母猪配种前1月颈部肌肉注射疫苗M，14天后第二次免疫，在产前一个月第三次免疫，每次2ML/头；第2组每头母猪在配种前一个月分别颈部肌肉注射猪疫苗2和疫苗3，14天后第二次免疫，在产前一个月第三次免疫，每次各2ML，每头4ML；第3组不进行疫苗免疫，作为空白对照组。在试验过说明书CN104043117A1615/15页17程中，其他的疫苗免疫均按正常程序进行。待生产时观察母猪的流产、产死胎、木乃伊胎情况。在仔猪出生后，称量仔猪的出生重，观察仔猪的生长情况，直至断奶，再称量断奶后的体重。01493结果与讨论0150表12母猪繁殖性能及仔猪生长情况统计01510152由表12结。
47、果可以看出，当后备母猪携带猪圆环，乙脑和细小三种病原时，使用疫苗M免疫母猪未出现死胎，疫苗2和疫苗3免疫组出现5头死胎，而对照组则出现20头死胎；疫苗M免疫后备母猪所产的仔猪，健康状况良好，出生时平均体重高于疫苗2和疫苗3免疫组和空白对照组；而在哺乳期仔猪的死亡率疫苗M免疫后死亡率明显降低，由未免疫的36降到56，断奶后仔猪生长体重也以疫苗M免疫组的效果最佳。综上所述，猪圆环乙脑细小三联灭活苗免疫母猪，能够降低死胎数，明显降低仔猪死亡率，改善仔猪的生长和健康状况。0153以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104043117A17。