一种耐高温木聚糖酶的表达方法及其专用表达载体 【技术领域】
本发明涉及一种耐高温木聚糖酶的表达方法及其专用表达载体。
背景技术
木聚糖酶主要由腐生真菌和细菌产生，它能降解植物细胞壁中的木聚糖成分，并被证实在农业和工业各方面都具有重要的应用价值。木聚糖是仅次于纤维素含量第二丰富的生物聚合物，并且是植物细胞壁中主要的半纤维素多糖，这种异源多糖是由D-吡喃木糖残基通过β-1，4糖苷键连接而成，而这一残基在不同的植物中可被乙酰基、阿糖醛酸基或葡糖醛酸基所替代。木聚糖的这种异源性使得完全降解木聚糖需要多种酶的共同作用，其中β-1，4-D-木聚糖酶是其中一种关键酶，它能打开主链上D-木糖残基之间的β-1，4糖苷键，从而把多糖的骨架降解成短链的木寡糖。因此β-1，4-D-木聚糖酶在食品，饲料，和造纸工业中有着非常广泛的应用。木聚糖酶的热稳定性在实际生产应用中是一个制约因素。但是耐热的微生物往往培养困难，有的还需要在高温厌氧条件下培养，产酶量低而且酶系复杂，很难得到纯酶。
目前已发现的木聚糖酶基因有xynA、xynB、xynC、xynZ等。研究较多的是xynA，但主要局限于细菌的xynA地克隆和表达，xynA在大肠杆菌中表达但不分泌到细胞外。Donald等首次将嗜热细菌的xynA克隆并在酿酒酵母菌表达，分泌至培养液中的具有活性的木聚糖酶达10mg/l。Bergquist等研究利用乳酸克鲁维酵母表达系统表达Thermotoga strain FjSS3B.1的木聚糖酶XynA，在摇瓶培养水平上表达量为120mg/l。Berrin等研究利用毕赤酵母表达系统表达黑曲霉木聚糖酶基因XylA，酶活性为350U/mg(蛋白)。
1999年Karen E.Nelson和Claire M.Fraser等人完成了海栖热袍菌MSB8(Thermotoga maritima MSB8)的基因全序列测定，开放阅读框TM0061(xynA)和TM0070(xynB)分别控制合成两个独立的木聚糖酶XynA和XynB。海栖热袍菌的xynA基因已克隆并在大肠杆菌中表达。该酶具有热稳定性，最适温度为90℃，最适反应pH值为6.2。
毕赤酵母异源基因表达系统是近年来应用得较多的酵母表达系统，该系统被认为是表达外源蛋白的理想系统，具有很高的商业应用价值。这个系统的优点有以下几个方面：它具有AOX1强启动子，能有效的调节外源基因的表达；对该系统的分类特征及其分子生物学的研究已经比较透彻，有利于基因工程的操作；该表达系统还可以进行菌体高密度培养，有利于发酵生产。这些优点都有利于毕赤酵母表达系统成为被广泛利用的外源基因表达系统，用于表达各种外源蛋白。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种耐高温木聚糖酶的表达载体。其表达产物可分泌到胞外，利于木聚糖酶的提取，适合工业化生产。
本发明所提供的耐高温木聚糖酶的表达载体是含有耐高温木聚糖酶基因xynB(64)的重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-xynB(64)。
其中，mxynB(64)已在GenBank注册，检索编号为：AY340789。
重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-xynB(64)是通过下述步骤得到的：
(1)以海栖热袍菌MSB8基因组DNA为模板，PCR扩增出木聚糖酶基因mxynB(64)；
(2)将步骤(1)中的扩增产物回收连接到载体pGEM-T Easy上，挑选出阳性克隆pGEM-T-mxynB(64)；
(3)将阳性克隆pGEM-T-mxynB(64)与毕赤酵母表达载体pPIC9K重组，得到重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-xynB(64)。
其中，步骤(1)中的PCR扩增引物可为序列表中的SEQ ID №：1和SEQ ID №：2，其中，SEQ ID №：1和SEQ ID №：2的自5’端第4位至第11位碱基为NotI的酶切位点。
本发明的第二个目的是提供一种表达耐高温木聚糖酶的方法。
一种表达耐高温木聚糖酶的方法，是将重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-xynB(64)转化到毕赤酵母中，得到阳性克隆，诱导培养所述阳性克隆，表达耐高温木聚糖酶。
为了获得更好的效果，毕赤酵母优选为GS115菌株并用终浓度为0.25-1％的甲醇诱导培养阳性克隆，其中甲醇的终浓度优选为0.5％。
所述阳性克隆可为含有外源基因xynB(64)，能在含有6.0mg/ml G418的YPD平板上生长的转化子：GS115-9k-mxynB(64)I、GS115-9k-mxynB(64)II、GS115-9k-mxynB(64)III和GS115-9k-mxynB(64)IV，其中优选为GS115-9k-mxynB(64)II。
本发明采用基因克隆技术，成功构建了酵母表达载体pPIC9K-xynB(64)；利用电穿孔转化方法，得到具有外源基因拷贝数约大于20的高拷贝数酵母转化子，在5升发酵罐内经甲醇诱导培养260小时，细胞密度OD600达250，木聚糖酶分泌量达207mg/L培养液，木聚糖酶活性为522U/mg(蛋白)。该木聚糖酶的最适反应温度为90℃，在沸水浴中(100℃)处理30分钟后，酶活力仍能保持最大酶活的70％，在90℃下测定分解木聚糖活性时，其pH值稳定性在6.2-10.0范围内。本发明的方法在耐高温木聚糖酶的生产中具有广阔的工业前景。
【具体实施方式】
实施例1、重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-xynB(64)的构建
(1)木聚糖酶基因mxynB(64)的克隆
根据海栖热袍菌MSB8木聚糖酶基因xynB的全序列以及毕赤酵母表达载体pPIC9K上的多克隆位点的特征，设计合成引物：
FW：5’-ATAgcggccgcTATGAAAATATTACCTTCTGTG-3’
REV：5’-ATAgcggccgcTCATTTTCTTTCTTCTATCTTTT-3’
引物两端设计合成NotI的酶切位点，以海栖热孢菌MSB8基因组DNA作为模板，通过PCR方法扩增出木聚糖酶基因xynB，扩增条件为：预变性94℃5分钟，再进行25个循环：变性94℃，30秒、退火56℃，1分钟、延伸72℃，1分30秒，72℃，延伸10分钟。扩增产物(约1kb左右)回收连接到载体pGEM-T Easy上，经菌落PCR挑选出阳性转化子pGEM-T-mxynB(64)，并对阳性转化子进行NotI酶切检测。
通过对该基因进行序列分析并与Karen E.Nelson和Claire M.Fraser等人公布的木聚糖酶基因(xynB)进行序列同源性比较，得知该基因在第64位碱基发生了改变，由原来的腺嘌呤(A)改变为鸟嘌呤(G)，因此该基因产物木聚糖酶的第22位氨基酸也相应的由天冬酰胺(Asn)转变为天冬胺酸(Asp)。将该基因产物命名为mxynB(64)。该基因mxynB(64)已在GenBank注册，检索编号为：AY340789。
(2)阳性克隆pGEM-T-mxynB(64)经NotI酶切后与酵母表达载体pPIC9k(购自美国Invitrogen公司)重组，构建重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-xynB(64)，阳性克隆经NotI酶切检测，并通过序列测定的方法确定基因正向连接到表达质粒上。
克隆到表达载体上的mxynB(64)基因，再次经过DNA序列测定分析，结果表明序列正确。
实施例2、耐高温木聚糖酶的表达
(1)重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-xynB(64)的转化及高拷贝数转化子的筛选
重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-xynB(64)经SalI完全酶切线性化后，电击法转化毕赤酵母GS115菌株，转化在不含组氨酸(His)的基本培养基MD平板上筛选出发生同源重组的His+克隆，然后把阳性克隆分别点接在MD和MM平板上，进行Mut+/Muts表型鉴定。
利用含有不同浓度G418的YPD平板，可以快速的筛选出阳性转化子，并可估测出整合至基因组的外源基因的拷贝数。用2ml的无菌水把在MD平板上的单菌落转化子洗脱并悬浮，轻微振荡后，稀释适当倍数，以105的细胞浓度分别在含G418浓度为0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0mg/ml的YPD平板上涂布，随机挑选了能在含有4.0mg/ml G418的YPD平板上生长的40个转化子单菌落，点接在含有6.0mg/ml的G418的YPD平板上，这40个转化子都能生长。在随后的筛选过程中发现，有4个转化子GS115-9k-mxynB(64)I、II、III、IV能在含有10mg/ml的G418的YPD液体培养基中生长，表明这4个转化子起码含有40个拷贝的外源基因。其中GS115-9k-mxynB(64)II的长势最好，细胞浓度最大。因此，挑选GS115-9k-mxynB(64)II进行诱导培养，表达重组蛋白。
(2)酵母阳性转化子的诱导表达
挑选具有高拷贝数的His+/Mut+的阳性转化子GS115-9k-mxynB(64)II接种于25mlBMGY培养基[1％酵母抽提物，2％蛋白胨，100mmol/l，磷酸钾pH6.0，1.34％YNB(YeastNitrogen Base)，1％甘油，(4×10-5)％生物素]于30℃摇床培养至OD600为2.0左右，离心收集菌体，转接到100ml BMMY培养基[BMGY培养基中的1％甘油改为0.5％甲醇]，继续培养，每24小时取样1ml，并补加甲醇于培养基至终浓度为0.5％，诱导表达7天，离心收集上清。
上清培养液中含有酵母表达并分泌到胞外的木聚糖酶，将培养液在70℃水浴中处理10分钟，除去杂蛋白。为了检测酵母分泌表达的效率，将离心收集的细胞，经酶解(Zymolyase)破壁，并于70℃水浴10分钟后，离心收集上清即为酵母胞内表达的粗酶提取液。胞内与胞外的粗酶液都经SDS-PAGE电泳检测蛋白表达量，电泳结果表明胞外与胞内的粗酶液经过70℃水浴10分钟处理后都能得到电泳纯的木聚糖酶XynB，其相对分子量为42kDa，与理论推算的分子量(42.067 KDa)相吻合。
实施例3、发酵培养GS115-9k-mxynB(64)II生产耐高温木聚糖酶
(1)木聚糖酶活性测定
以0.25％的燕麦木聚糖(oat spelts xylan，Sigma Chemical St.Louis，MO.USA)为底物，采用对羟基苯甲酸酰肼法(p-hydroxybenzoic acid hydrazide，PHBAH法)测定耐高温木聚糖酶活力。具体操作如下：
1).按顺序分别取储存液0.5M柠檬酸钠，1M亚硫酸钠，0.2M氯化钙，5M氢氧化钠各10ml，边搅拌边加入，用蒸馏水定容到100ml，再加入1.52克PHBAH，不停的搅拌，此溶液必须现用现配；
2).称量1克木聚糖底物溶于100ml 50mM MES缓冲液(pH 6.2)中，经充分搅拌后，离心除去沉淀，上清液约为0.25％的木聚糖酶反应底物；
3).取190μl 0.25％的木聚糖底物于50℃下保温10min，加入10μl合理稀释的酶溶液，于50℃下准确反应10min，再加入400μl PHBAH溶液，混匀后于沸水浴中保持6min；
4).样品冷却后，用分光光度计测定吸光度值(OD405)。空白的操作与上述一样，以10μl水代替合理稀释的酶溶液。1个酶活力单位(unit)定义为：在上述实验条件下，每分钟产生1μmol木糖所需的酶量为1个酶活力单位，而OD405＝1时相当于0.067μmol木糖。
(2)发酵培养(5L发酵罐)
培养基：
种子培养基：BMGY(1％酵母抽提物；2％蛋白胨；100mM磷酸钾，pH6.0；1.34％YNB(Yeast Nitrogen Base)；4×10(-5)％生物素；1％甘油)；
发酵培养基：FBS基础盐[甘油4％(w/v)+3.5ml/L PTM1]；
补料培养基：50％甘油(W/V，含12mL/L PTM1)补料液；
诱导培养基：100％甲醇(含12mL/L PTM1)诱导液。
FBS基础盐：85％ H3PO4，26.7mL；CaSO4，0.93g；K2SO4，18.2g；MgSO4.7H2O，14.9g；KOH，4.13g；甘油，40.0g；水，1000ml。
PTM1 trace salts(过滤灭菌)：CuSO4.5H2O，6.0g；NaI，0.08g；MnSO4.H2O，3.0g；NaMoO4.2H2O，0.2g；硼酸，0.02g；CoCl2，0.5g；ZnCl2，20.0g；FeSO4.7H2O，65.0g；生物素，0.2g；H2SO4，5.0mL；水，1000ml。
种子培养：从平板上挑单菌落，接入到种子培养基(100ml/500ml三角瓶)中，30℃，220r/min培养18h，OD600约8.0左右。
高密度发酵：按10％接种量将种子罐菌种接入到装2.5L分批发酵培养基的5L发酵罐中，进行分批培养(用25％氨水调pH至5.0左右)。约20小时后，开始流加补料生长培养基(流加速率维持溶氧大于20％)。4小时后停止补料，甘油耗尽后补入发酵诱导培养基，进行诱导表达培养(pH用25％NH3.H2O控制为6.0)，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧大于20％，诱导培养260h左右。培养过程中定时取样测定细胞生长、分泌蛋白量及其酶活。最终木聚糖酶分泌量可达207mg/L培养液，酶活为522U/mg(蛋白)。
利用已知的蛋白质化学标准方法测定此木聚糖酶的基本特性，经测定表明该木聚糖酶的最适作用温度为90℃，分解木聚糖活性在pH值为6.2-8.0范围内稳定。
序列表
<160>2
<210>1
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
atagcggccg ctatgaaaat attaccttct gtg 33
<210>2
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
atagcggccg ctcattttct ttcttctatc tttt 34