组织工程自体复合皮肤及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种组织工程自体复合皮肤及其制备方法，属于组织工程领域。
背景技术
组织工程技术是国际上于一九八零年后建立起来的一种用于制备可移植的、具备形态特征和功能的组织与器官的高新技术，目前国际上正在研发的产品有：皮肤、真皮、粘膜、肌腱、骨、软骨、血管、神经、角膜、心脏瓣膜、肾脏、腺体和消化器官等，而最先获得成功的是皮肤组织、真皮组织和软组织。皮肤和真皮组织是最先于1999年获得美国FDA认证的产品，其中包括Apligraf、Integraf和Dermagraf三种产品。由于组织工程技术制备的组织器管中包含有活的细胞以及可能的生物可降解材料，产品可用于体表或移植于体内，鉴于此类产品不同于以往的生物制品、化学药品、器械等，美国FDA在认证过程中成立了新的专门审批小组，由器械审批处牵头，以器械类审批。美国FDA批准的同种异体细胞生产的组织工程皮肤在临床使用，短期内具有较好的临床效果，但仍然存在三个方面的问题：第一，由于异体的排异反应使其存活周期短；第二，其支架吸收慢不利于创面愈合；第三，由于是单独的上皮细胞，愈合后的皮肤很薄，易破碎，导致新的创伤。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种组织工程自体复合皮肤。
本发明的另一个目地是提供组织工程自体复合皮肤的制备方法。
本发明的第三个目的是提供这种组织工程自体复合皮肤的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种组织工程自体复合皮肤，该复合皮肤由附着于纤维蛋白生物支架上的自体真皮细胞层和自体表皮细胞层构成。
所述的自体真皮细胞层是将来源于患者自体的真皮成纤维细胞经体外扩增、培养得到的。
所述的自体表皮细胞层是将来源于患者自体的表皮干细胞经体外扩增、培养得到的。表皮干细胞在培养过程中分裂形成表皮干细胞和TA细胞(transientamplifying cell)，其中表皮干细胞具有增殖能力，TA细胞具有分化能力，分化成为上皮细胞，构成表皮层。
所述纤维蛋白为人的纤维蛋白。这种支架的优点在于：第一、能支持表皮细胞和真皮细胞的扩增；第二，该支架能较快的被吸收；第三，其支架柔软，可折皱，容易操作，第四，有较强的粘附性，易于附着于创伤面。
一种组织工程自体复合皮肤的制备方法，是将来源于患者自体的表皮干细胞和真皮成纤维细胞在体外扩增和分化，再将表皮细胞后种植于含有患者自体真皮成纤维细胞的纤维蛋白生物支架上，进行培养，在体外构建组织工程自体复合皮肤。
所述含有患者自体真皮成纤维细胞的纤维蛋白生物支架的构建方法是：采用人的纤维蛋白原为材料，按照浓度为1-8mg/ml，加入人的凝血因子1-5unit/ml和CaCl2 1-5μmol/ml，同时加入真皮成纤维细胞，室温下混合，立刻构建于培养皿上；加DMEM和10％FBS培养基培养。
所述种植是指将来源于患者自体的表皮细胞以10倍于已使用的成纤维细胞的量加入构建有生物支架的培养皿中。
所述加入真皮成纤维细胞的数量为40000-60000细胞/ml。
所述的组织工程自体复合皮肤，用于制备皮肤移植用的生物材料。
组织工程自体复合皮肤采用自体上皮细胞和真皮细胞在体外扩增后，接种到可降解的皮肤支架上进行培养，在体外构建组织工程皮肤，其和天然皮肤具有类似的结构和功能。然后在移植到病人自体，用于大面积烧伤患者和皮肤溃疡患者的皮肤移植和修复。该制品组织结构近似于或等同于人的皮肤组织，采用患者自体细胞，不存在免疫排斥反应和传染性疾病的交叉传染问题，是目前治疗皮肤烧伤病人非常有效的方法。可以广泛应用于治疗皮肤烧伤、溃疡、创伤等多种原因造成的皮肤缺损，尤其是能用于大面积皮肤烧伤的急救。
本发明能在短时间内为患者提供大面积的表皮和真皮细胞，供移植使用，其优点在于：
1、为自体皮肤细胞构建，因而无排异反应，细胞再形成的组织成活时间长。
2、采用的生物支架粘附性好，在上皮细胞和真皮细胞移植后成活率高，创伤面修复快。
3、该生物工程复合皮肤既有上皮细胞，又有构成其真皮组织的成纤维细胞，因而其皮肤创伤愈合皮肤结实，不易破碎，愈合效果好，外观更正常。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
【附图说明】
图1为本发明的成品外观图
图2为患者进行皮肤移植前的局部皮肤状况图
图3为皮肤移植后的局部皮肤状况图
【具体实施方式】
在确定取皮肤组织之前，由具有执业医师资格的医务人员向患者或患者家属解释原因，争得患者或家属同意，皮肤的取材部位由具有执业医师资格的医务人员确定，并按照医院规定的手术原则取材。患者进行体检和化验，包括常规检验、传染病病原(如HIV、肝炎病毒等)的检查。所取的皮肤立即由专业人员放入无菌容器内，并立即冷藏(10℃以下)，然后按规定的标准操作程序处理。
实施例1、组织工程复合皮肤的制备
一.患者自体健康细胞的提取和细胞培养传代
(一)患者自体健康细胞的提取
1.手术室取材
1)用医用碘酊清理患者取皮面；
2)用生理盐水冲洗取皮面，除去残留的碘酊；
3)取1cm×2.5cm的窄长皮肤；
4)取下的皮肤放贮存液中送细胞培养室。
2.取材后皮肤组织的保存：用5ml含有100单位/ml青霉素和100mg/ml的链霉素的DMEM(购于美国Hyclone公司)培养液于保存管中保存组织(4℃)。
3.在超净工作台中消毒、清洗，组织大块分离：用含100单位/ml青霉素和100mg/ml的链霉素的0.1M PBS冲洗组织，修剪多余的脂肪和皮下结绨组织。将组织剪成1cm×1cm的组织块。
4.组织消化(Sony CO2培养箱)：将3～4块1cm×1cm表皮组织块和真皮组织块分别放置于60mm培养皿中加入10ml浓度为0.25％的胰酶/EDTA液，37℃，120分钟；DMEM+10％FBS培养液终止。
5.细胞分离：将消化后的组织块剪碎并用吸管打散。
6.离心：吹散后的细胞收集至离心管中，Backman公司控温离心机，25℃，1000转/min，离心5分钟，弃去上清液。
7.细胞鉴定
1)形态学：采用倒置光学显微镜观察。上皮细胞多呈多角型，角为钝角，细胞呈圆性；细胞外观透明，细胞紧密联结成单层，也可呈管状生长。真皮成纤维细胞质向外伸出2-3个长短不同的突起，呈多角形或长棱形。
2)细胞表型：采用角质蛋白抗体和胶原蛋白抗体(美国ICN公司)进行免疫抗原鉴定，结果显示分离得到的细胞为正常表皮细胞和正常真皮成纤维细胞。
3)致癌性：采用裸鼠试验，见《美国FDA关于生物制品生产用细胞株鉴定和指控的考虑要点》，结果显示无致癌性。
4)无菌检测：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。
5)细胞存活率：采用台盼蓝(Trypan blue)染色法检查，核染色的细胞为死亡细胞，不着色的细胞为活细胞，计数总细胞数和死细胞数，计算细胞存活率。
细胞存活率＝[(总细胞数-死细胞数)/总细胞数]×100％
经测定，存活率超过80％。
(二)表皮细胞的原代培养与传代
1.原代细胞培养：在离心管中加入加10ml无血清上皮细胞培养液(Sigma公司，美国)吹悬，接种入4×60mm培养皿；Sony CO2培养箱，37℃，5％CO2，进行培养。
2.传代细胞培养：每隔2～3天换液1次，上皮细胞达到50-70％汇集细胞后传代。
(三)真皮细胞的原代培养与传代
1.原代细胞培养：在离心管中加入加10ml无血清上皮细胞培养液(Sigma公司，美国)吹悬，接种入4×60mm培养皿；Sony CO2培养箱，37℃，5％CO2，进行培养。
2.传代细胞培养：每隔2～3天换液1次，上皮细胞达到50-70％汇集细胞后传代。
二、构建生物工程复合皮肤：
(一)生物支架的构建
1.制备人纤维蛋白原
用200ml血浆在4℃离心，3500转/min，30分钟，弃上清液，加10ml注射用水，制成悬浊液，保存备用。
2.构建附着有自体真皮成纤维细胞的生物支架
采用人的纤维蛋白原为材料，按照浓度为1-8mg/ml，加入人的凝血因子(购于Sigma公司)1-5unit/ml和钙离子1-5μmol/ml，同时加入50000细胞/ml的成纤维细胞，室内温下混合，立刻构建于60mm或100mm的培养皿上，形成附着有自体真皮成纤维细胞的生物支架。加DMEM和10％FBS培养基培养，成纤维细胞增殖形成真皮细胞层。由于支架材料具有粘附性，可有利于吸附到创面。
3.构建上皮细胞层
1)种植：将扩增培养的上皮细胞以10倍于已使用的成纤维细胞的量加入构建有生物支架的培养皿中，上皮细胞将种植于含有真皮细胞层的支架表面。
2)继续培养：用DMEM和上皮细胞培养液(Sigma公司)继续培养，形成表皮层，37℃，5％CO2，24小时后即可临床应用。
(二)生物支架和成品检测
1.生物支架的检测
1)pH值测定：取材料支架5g，加入pH7.0的蒸馏水15ml，于37℃下浸泡24小时，测pH，pH值在7.0-7.5之间。
2)体外降解试验：取材料支架，浸入37℃含蛋白酶(2mg/ml)的磷酸缓冲液中，浸泡24小时后，支架全部消失。
3)皮肤刺激和致敏试验：按GB/T16886.10-2000医疗器械生物评价第10部分：刺激与致敏试验规定进行试验，结果无致敏性。
4)细胞毒性按照GB/T16886.5-1997医疗器械生物评价第5部分：细胞毒性试验的规定进行试验，结果无细胞毒性。
5)肌肉植入试验按GB/T16886.6-1997医疗器械生物评价第6部分：植入后局部反应试验中规定的方法进行，结果无局部反应。
6)遗传毒性试验按照GB/T16886.3-1997医疗器械生物评价第3部分中规定的方法进行试验，结果无毒性。
2.成品检测
1)外观：呈半透明膜状，厚薄均匀，有光泽，见图1。
2)规格尺寸：不小于标示的大小尺寸。
3)弹性和强度要求：折叠和变形时人工皮肤应能恢复其初始和设计形状，保持完整。
4)组织学观察：将培养的组织工程全层皮肤进行常规组织学包埋处理，10％福尔马林固定、组织处理、石蜡包埋，切片后进行H-E染色，封片后光学显微镜观察。结果：光镜下，未见明显的细菌生长，无明显的上皮或成纤维细胞退变或坏死，无局域性细胞无规则生长；可见体外培养的组织工程皮肤，具有上皮层和真皮层，其中上皮层具有大量的上皮细胞，真皮层具有大量的真皮细胞。
5)无菌试验：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。
产品的使用方法：使用前，用不含血清的培养液冲洗三次。进行移植时，用无菌的手术刀或外科镊子将创面的坏死组织清除，止血，然后用生理盐水冲冼三次，将组织工程自体复合皮肤敷于创面，使四周缝合固定，用油沙覆盖于组织工程自体复合皮肤上，使用一定压力使其新贴，然后用棉纱打包固定。5-7天后打开包裹，可见新生皮肤(红、粉红)生长，一个月后伤口完全愈合。
产品的储存和运输应在2℃～10℃、阴凉、干燥、清洁、避免阳光直射、无腐蚀性气体、无重压的环境中进行。
实施例2、临床报告
一.纳入病例标准
1.深度烧伤病人切、削痂后创面。
2.各种原因引起的长期不愈合的溃疡创面及肉芽创面(III度烧伤后晚期肉芽创面、糖尿病足等难治性溃疡创面等)。
3.全身广泛瘢痕增生、挛缩畸形，或瘢痕疙瘩、增生性瘢痕，瘢痕硬、痒、痛，需切除瘢痕植皮者。
属于上述情况患者，且年龄不超过60岁为纳入对象。
二.排除病例标准
1.休克期、化学中毒等复合损伤。
2.合并心血管、脑血管、肝、肾、造血系统等严重原发疾病。
3.过敏体质者或自身免疫疾病者。
三.取材
1.术前检查血、尿常规，肝、肾功能。
2.取材术：视创面大小，在局麻下取正常皮肤1.5cm×0.5cm大小的一处或几处全层皮肤，供皮区用3-0丝线直接缝合。皮肤组织置于保存液中。
四.实验室体外培养
皮肤组织取材后立即置于保存液中，放在2℃-10℃的保温箱中运输及保存，于6小时内进行培养，以生物工程组织为载体培养自体皮肤干细胞，并符合其组织工程自体复合皮肤注册产品标准。
五.剔除病例标准
皮肤干细胞培养失败，培养所得的组织工程自体复合皮肤不符合产品标准者。
六.移植手术
复合皮移植术：2～3周后，将培养好的自体皮肤干细胞、真皮细胞及生物支架的复合皮肤移植到深度烧伤切、削痂后创面、肉芽创面、溃疡创面以及瘢痕切除、松解后的创面。
1.创面应新鲜，有血运，无坏死组织，无感染，创面清除彻底，大量抗菌素生理盐水冲洗，止血彻底。
2.将贴在凡士林纱布上的复合皮肤移植于创面上，真皮面向下，表皮面向上，用3-0丝线将复合皮肤连同凡士林纱布边缘缝合，固定于创面，留长线，放置盐水大网眼纱布于凡士林纱布上，打包稍加压包扎。
3.如植皮位于关节部位，术毕用石膏托固定两周。
七.术后处理
术后用敏感抗菌素5-7天。
肉芽创面复合皮移植术后4-5天，切、削痂后创面或瘢痕切除后创面5-7天，打开外敷料剪开打包缝线，用生理盐水浸湿内层敷料，轻轻去除后，检视移植复合皮与受区成活情况，观察皮的颜色、分泌物、创缘情况。用油纱布、盐水纱布及纱布继续稍加压包装，术后一个月内每周2次换药，术后7-10天拆线。
八.疗效评定标准
显效：移植复合皮肤一个月创面愈合75％以上。
有效：移植复合皮肤一个月创面愈合在30％-75％。
无效：移植复合皮肤一个月创面愈合未及30％。
九.数据管理和统计
1.数据收集：
所有入选病例均必须完成病例观察表，研究者将观察、检查结果及时、准确、完整、规范、真实地记录于病历及病例观察表中。
全部数据录入数据库并校对后，将数据库交统计分析人员进行统计分析，并提供统计报告，交临床试验的主要研究者写出临床总结报告。
2.统计分析
根据数据性质，对基础资料数据、疗效分析(各指标分析)及安全性分析、分别进行统计描述。
计量数据统计方法：观察组内前后变化情况采用配对样本t检验。
计数数据统计方法：采用确切概率法。
等级型数据统计方法：观察组内前后变化情况采用符号秩和检验。
3、统计软件：所有的统计均利用SAS JMP5.0软件进行统计学分析，采用双侧检验，以P≤0.05作为有统计学意义。
十.结论
本产品在北京市两家三甲医院进行了临床研究，共入选20例患者，经术后一个月观察，评价其对于组织工程复合皮肤移植修复深度烧伤和瘢痕的改善情况，各主要观察指标的疗效如下：
(1)创面分泌物：均无创面分泌物渗出。
(2)创面肿胀：均无创面肿胀。
(3)创缘反应：均为阴性反应(即无创缘反应)
(4)创面愈合百分率：75％以上(即显效)15例；30％-75％(有效)1例，30％以下(无效)4例。
术后一个月：总有效病例16例，总有效率80％。
本说明书附图例举患者术前和术后的情况图以作说明，分别见图2和图3，可以看出在手术移植本发明的组织工程自体皮肤的部位，新生皮肤易愈合效果好，外观正常，患者的症状得到了改善。