二聚桔霉素类化合物及其制备方法和用途 技术领域：
本发明涉及用桔青霉HGY1-5(Penicillium citrinum HGY1-5)(保藏编号是：CCTCC M208170，保藏日期：2008年10月27日)生产二聚桔霉素类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂、细胞凋亡诱导剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术：
桔霉素是由桔青霉(Penicillium citrinum)或一些曲霉(Aspergillus sp.)生产的一种活性聚酮化合物，其二聚体目前报道了5个，但是这种5个六元环相互稠合形成的新颖的桔霉素二聚体未见报道。本发明人研究得知，桔青霉HGY1-5(Penicillium citrinum HGY1-5)(保藏编号是：CCTCC M 208170)液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的细胞增殖抑制和细胞凋亡诱导活性，遂对其活性成分进行了研究。研究发现所示二聚桔霉素类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见该化合物的化学结构及细胞增殖抑制和细胞凋亡诱导活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。
发明内容：
本发明旨在提供两种结构独特的具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡作用，具有抗肿瘤活性的新化合物。其结构式分别是
式I
式II
其结构特征是：式I和式II是由5个六元环相互稠合形成的新颖的桔霉素二聚体，其中R-R3为氢、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。
本发明优选的式I和式II化合物其中R、R1为羟基、R2为甲氧基、R3为氢。
本发明的式I和式II化合物可通过微生物发酵培养来获取含有二聚桔霉素类化合物的发酵物，然后从发酵物中采用硅胶柱层析、Sephadex LH20凝胶柱层析制备HPLC等方法分离纯化得到。
本发明的下述实施例中列举了利用桔青霉HGY1-5(Penicillium citrinum HGY1-5)(保藏编号是：CCTCC M 208170)制备本发明式I和式II化合物的实例。
具体实施方式：
在如下的实施例中所指的化合物I和II的化学结构(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)分别是：
化合物I 化合物II
实施例1化合物I和II的发酵生产及分离精制
1发酵生产
生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取桔青霉HGY1-5(Penicillium citrinumHGY1-5)(保藏编号是：CCTCC M 208170)适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。
取斜面培养4天的桔青霉HGY1-5(Penicillium citrinum)适量，接种到装有200mL培养液[培养基组成(克/升)：麦芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0，KH2PO4 0.5，MgSO4 0.3，酵母膏3.0，pH自然]的500mL锥型瓶中，在28℃、160转/分钟条件下摇床培养15天，获得菌丝体和发酵液。
2浸膏的获得
用棉布将菌丝体和发酵液分离。将发酵液等体积乙酸乙酯萃取三次，再用正丁醇萃取三次，将正丁醇萃取液减压浓缩，得粗浸膏，共100.0克。
3化合物的分离精制
浸膏(100.0克)用氯仿-甲醇混合溶剂溶解后，加300克200-300目硅胶(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-丙酮，氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为12个流份。Fr-7(12.0g，氯仿-甲醇20∶1洗脱物)，先后以氯仿-甲醇(1∶1)为溶剂进行LH20柱层析，再经加压硅胶柱层析以石油醚∶丙酮(5∶5)为溶剂，最后经半制备反相高效液相色谱(甲醇∶水＝80∶20)得化合物I(100mg)和化合物II(80mg)。
化合物I淡黄色无定形固体，是一对不可分离的非对应异构体[10S异构体(1)和10R异构体(2)]的混合物，[a]25D-34.3°(c 0.53，MeOH)，分子式C25H30O6，HR-ESI-MS m/z：425.1954[M-H]-，计算值425.1964.UV λmax nm(logε)in MeOH：211(4.65)，221(4.66)，294(3.69)。IR vmax cm-1(KBr)：3485，3419，3333，2970，2929，2891，1640，1611，1590，1510，1472，1387，1334，1270，1178，1135，1088，1038，1012，950，837.1H和13C-NMR数据见表1。
表1 化合物I的1H和13C NMR数据(600和150MHz，in DMSO-d6)a
a)本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。
b)此栏中的数字和代号分别代表在1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。
c)此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的13C核。
化合物II淡黄色无定形固体，是一对不可分离的非对应异构体[10S异构体(1)和10R异构体(2)]的混合物，[a]25D-104.4°(c 0.59，MeOH)，分子式C25H30O6，HR-ESI-MS m/z：425.1980[M-H]-，计算值425.1964.UVλmax nm(logε)in MeOH：221(4.69)，295(4.04)。IR vmaxcm-1(KBr)：3335，2970，2929，2876，2826，1638，1610，1586，1495，1380，1344，1261，1128，1073，1044，959，905，840.1H和13C-NMR数据见表2。
表2 化合物II的1H和13C NMR数据(600和150MHz，in DMSO-d6)a
a)本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。
b)此栏中的数字和代号分别代表在1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。
c)此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的13C核。
实施例2体外抗肿瘤活性的测试
细胞增殖抑制活性测试及细胞凋亡诱导活性测试
1实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物I和II纯品。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。
细胞系及细胞的继代培养采用人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞、人白血病HL60细胞及人白血病MOLT-4细胞等癌细胞系。各种细胞均用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在37℃于通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法
丽丝胺罗丹明B(SRB)法取对数生长期的人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，每孔加入2微升不同浓度的样品或空白溶液，37℃下培养24小时。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起地形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，继而在4℃、3000转/分钟离心3分钟，吸去上清。每孔细胞中加入20％三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4％SRB的醋酸溶液50微升并在室温静置30分钟。用1％醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150微升Tris缓冲液(10mmol/L，pH 10.5)溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRA MAX Plus型酶标仪测定每孔在520nm处的光密度(OD)值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照X100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。
四氮唑盐(MTT)法取对数生长期的人白血病HL60细胞和人白血病MPLT-4细胞，将细胞密度调至每毫升2×105个细胞，按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中，于37℃通入5％CO2的培养箱中培养4小时。每孔加样品液或空白液各2微升，培养24小时后，每孔加MTT液(MTT的每毫升5毫克生理盐水溶液)10微升，继续培养4小时，37℃、2000转/分钟离心8分钟，吸去上清。每孔加入DMSO各100微升，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶完全溶解后，利用MD公司产SPECTRA MAX Plus型酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值(OD值)。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔(如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零)。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IR％＝(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照X100％式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR％)。
细胞凋亡诱导活性测试方法
取对数生长期的人白血病HL60细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液，按每孔0.5毫升接种于24孔板中，每孔加入5微升终浓度为10μM的样品溶液，37℃下培养20小时取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，必要时进行拍照。继而将细胞分别从24孔板转移至1.5毫升Eppendorf离心管中(贴壁细胞提前用胰蛋白酶消化约一分钟)，4℃下3000转/分离心3分钟，吸去上清液，加0.5毫升磷酸缓冲溶液(PBS)震荡洗涤一次，相同条件下离心收集细胞，加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克柠檬酸纳和200毫克NP-40)，4℃下染色30分钟后，加入150微升PBS稀释，用流式细胞仪分析测定细胞中DNA的含量分布。细胞在细胞周期各时相中的分布利用计算机软件进行分析计算。
2.实验结果
细胞增殖抑制活性测试结果
在SRB法或MTT法测试中，不同浓度的化合物I和II对人肺癌A549细胞、人肝癌BEL-7402细胞、人白血病HL60细胞和人白血病MOLT-4细胞的增殖抑制结果分别见表3和表4。
表3不同浓度的化合物I对癌细胞增殖的抑制率(％)
表4不同浓度的化合物II对癌细胞增殖的抑制率(％)
细胞凋亡诱导活性测试结果
在流式细胞术测试中，浓度为10μM的化合物I和II对人白血病HL60细胞的凋亡诱导活性结果见附图说明，附图说明：图1为化合物I和II的凋亡诱导活性。
3结论
化合物I和II具有明显的肿瘤细胞增殖抑制作用和诱导肿瘤细胞凋亡，可作为细胞增殖抑制剂、细胞凋亡诱导剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。
化合物I
化合物II
图1化合物I和II的凋亡诱导活性
3结论
化合物I和II具有明显的肿瘤细胞增殖抑制作用和诱导肿瘤细胞凋亡，可作为细胞增殖抑制剂、细胞凋亡诱导剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。