分泌抗CYSTATINS单克隆抗体杂交瘤细胞及其单克隆抗体和应用.pdf

本发明公开了分泌抗Cystatin S单克隆抗体杂交瘤细胞及其单克隆抗体和应用，其中杂交瘤细胞株包括5D2F2和5E4G5，于2014年6月17日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201416和CCTCC NO：C201415，该杂交瘤细胞能够分泌Cystatin S单克隆抗体，能与Cystatin S重组蛋白特异结合，且效价高，亲和力好，能够用于特异检测Cystatin S，并用于肠癌的诊断。

权利要求书
1.  Cystatin S的抗原表位，其特征在于：所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

2.  分泌抗Cystatin S单克隆抗体杂交瘤细胞，其特征在于：所述杂交瘤细胞为5D2F2或5E4G5，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号分别为CCTCC NO：C201416和CCTCC NO：C201415。

3.  由权利要求2所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

4.  根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的抗原决定簇氨基酸序列为如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

5.  含有权利要求3或4所述单克隆抗体的试剂盒。

6.  根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包被有权利要求3或4所述单克隆抗体的固相载体、酶标抗Cystatin S多克隆抗体、显色底物和终止液。

7.  根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述固相载体为酶标板，所述显色底物为TMB，所述终止液为2M的硫酸，所述酶标抗Cystatin S多克隆抗体为HRP标记的抗Cystatin S多克隆抗体。

8.  权利要求3-4任一项所述单克隆抗体或权利要求5～7任一项所述试剂盒在制备诊断和预示大肠癌的试剂中的应用。

说明书分泌抗Cystatin S单克隆抗体杂交瘤细胞及其单克隆抗体和应用
技术领域
本发明属于化学领域，具体涉及分泌抗Cystatin S单克隆抗体杂交瘤细胞，还涉及由该杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体和应用。
背景技术
全国第17个肿瘤防治宣传周，北京市卫生局通过媒体报道北京、上海等大城市的大肠癌年发病率已高达30/10万-40/10万，达到或超过了西方发达国家的平均水平，大肠癌成为仅次于肺癌的第二位高发恶性肿瘤。我国大肠癌上升有3个特点——年轻化、直肠癌较多、低位直肠癌较多，大肠癌高发年龄普遍在50岁-60岁，比西方国家平均提早10岁。
目前，大便隐血实验、血液CEA指标、肠镜筛查技术是医院很常规的检测项目。在上海，大便隐血筛选检查率低于5％，而发现问题进一步进行肠镜检查者比例更不足3％。虽然通过大便隐血实验、血液CEA指标和肠镜筛查可早期发现肠癌，且通过早期干预大肠癌预后五年生存率高于90％，但是民众检查率低。其原因就在准确度不高，如CEA指标；不易被民众接受，如大便隐血实验；检查是侵入性的，检查痛苦，有出血、穿孔等风险性。
综上，肠癌的防治仍存在大量亟待解决的问题，包括如何更早期发现、及时干预，如何实现疗效评估和监测，如何对术后患者做到实时准确的复发监控。Cystatin S是人类Cystatin家族成员，由CST4基因编码，含141个氨基酸，分子中有两个二硫键，分子量为16.4Kda，为典型的分泌蛋白，分布于多种体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。CST4在胃癌组织中的表达量高于正常胃粘膜组织，在胃癌细胞系中的表达部位与胃癌组织较一致，且表达率随细胞系的分化程度降低而降低；从而提示CST4可能在胃癌的发生、发展过程中发挥类似肿瘤抑制因子的作用。并且，在前期研究中发现，CST4和Cystatin S可以作为诊断和预示肠癌的标示物。但是迄今为止，Cystatin S的单克隆抗体检测肠癌的灵敏度低、特异性差，因此急需获得一种针对Cystatin S抗原决定簇的特异性抗体，以提高检测的灵敏度和特异性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供Cystatin S的抗原表位；目的之二在于提供分泌抗Cystatin S单克隆抗体杂交瘤细胞，本发明的目的之三在于提供由上述杂交瘤细胞分泌的单克 隆抗体；本发明的目的之四在于提供含有上述单克隆抗体的试剂盒；本发明的目的之五在于提供上述单克隆抗体或试剂盒的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、Cystatin S的抗原表位，所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
2、分泌抗Cystatin S单克隆抗体杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞为5D2F2或5E4G5，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号分别为CCTCC NO：C201416和CCTCC NO：C201415。
3、由所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
优选的，所述单克隆抗体的抗原决定簇氨基酸序列为如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
4、含有所述单克隆抗体的试剂盒。
优选的，所述试剂盒包括包被有所述单克隆抗体的固相载体、酶标抗Cystatin S多克隆抗体、显色底物和终止液。
优选的，所述固相载体为酶标板，所述显色底物为TMB，所述终止液为2M的硫酸，所述酶标抗Cystatin S多克隆抗体为HRP标记的抗Cystatin S多克隆抗体。
5、所述单克隆抗体或所述试剂盒在制备诊断和预示大肠癌的试剂中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明通过获得分泌抗Cystatin S单克隆抗体杂交瘤细胞，获得针对Cystatin S特异抗原决定簇的单克隆抗体、多克隆抗体，制得的单克隆抗体、多克隆抗体可用于检测大肠癌患者血清Cystatin S，其特异性高、灵敏度好，能够用于临床诊断。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为细胞表达产物经SDS-PAGE分析结果(1、2、4、5、6、7为不同细胞株的表达产物；3和8为maker)。
图2为Cystatin S重组蛋白Western Blotting分析结果(1～7分别代表不同泳道收集管中的重组蛋白western bloting图)。
图3为单克隆抗体SDS-PAGE结果(1为5D2F2单克隆抗体，2为蛋白分子maker，分子大小分别为96kd、66kd、45kd、29kd、20kd、14kd，泳道3为5E4G5单克隆抗体)。
图4为单克隆抗体Western Blotting结果(1为单抗5D2F2；2为单抗5E4G5)。
图5为SDS-PAGE及Western Blotting鉴定分离纯化的多抗结果(A：SDS-PAGE，泳道1为蛋白maker，泳道2为抗体的重链与轻链；；B：Western Blotting)。
图6为重组蛋白浓度与OD450的关系。
图7为ROC曲线统计结果。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
生物保藏
本发明中杂交瘤细胞为5D2F2和5E4G5，送武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号分别为CCTCC NO：C201416和CCTCC NO：C201415，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2014年6月17日，分类命名为杂交瘤细胞株5D2F2和杂交瘤细胞株5E4G5。
实施例1、Cystatin S的重组蛋白表达、纯化及鉴定
从胃癌组织中利用RT-PCR的方法，利用克隆引物上游引物为：F：5’-cccaagcttgccaccatggcccggcctctg-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物为：5’-cgcggatccttcttgacacctggaa-3’(SEQ ID NO.2)克隆Cystatin S基因(SEQ ID NO.3)，然后将克隆的Cystatin S基因插入含有His标签的pc DNA3.1载体上，得Cystatin S-pc DNA3.1。然后将Cystatin S-pc DNA3.1转化DH5α，挑取阳性克隆，将挑取的阳性克隆扩大培养后，提取重组质粒Cystatin S-pc DNA3.1，然后以HindⅢ、BamHI进行酶切分析，结果显示得到了与预期大小相符的酶切片段。将酶切正确的重组Cystatin S-pc DNA3.1经测序确认基因正确后利用Lipofectamine2000转染入cos-7细胞中，经过G418筛选阳性克隆，以含10％胎牛血清的DEME培养基培养(37℃，5％CO2)，收集培养上清，细胞表达产物经SDS-PAGE分析，结果如图1所示。结果显示，发现在15KD左右有特异表达带，根据基因序列预测Cystatin S重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。用anti 6x His抗体进行Western Blotting分析，结果如图2所示，仅有一条特异性条带，表明蛋白为目的蛋白。
将利用镍柱纯化细胞培养上清。具体方法为收集细胞培养液，1200rpm离心分离细胞，收集上清，并利用0.45um滤器过滤上清液。将滤液上样到5ml Ni-NTA柱上，经5倍柱体积10mM咪唑溶液清洗，然后用300mM咪唑洗脱，收集各管洗脱蛋白溶液。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度并定量，获得的蛋白纯度达到95％，浓度为5mg/ml。
实施例2、Cystatin S单抗的制备、纯化及鉴定
用实施例1纯化的Cystatin S重组蛋白利用皮下注射方法免疫BALB/c小鼠，每只小鼠每次免疫50μg抗原，免疫体积为100μl。首次免疫cystatin S与弗氏完全佐剂1：1混合每隔两周免疫一次，cystatin S与弗氏不完全完全佐剂1：1混合，共免疫3次；最后经过Cystatin S(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后取免疫小鼠的脾脏细胞，然后利用PEG-4000融合免疫小鼠脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系SP2/0，利用HAT选择培养基在96孔细胞培养板上选择杂交瘤细胞，并利用ELISA方法鉴定产生抗Cystatin S蛋白(Cystatin S单克隆抗体)的细胞；分别为杂交瘤细胞株5D2F2、杂交瘤细胞株5E4G5、杂交瘤细胞株2G7A9、杂交瘤细胞株3F4G8和杂交瘤细胞株4F1B6，然后利用转瓶培养获得的杂交瘤细胞株，收集细胞培养上清，利用0.45μm的滤器过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4°搅拌均匀后，静置1小时，12000rpm收集沉淀，并用50mM PBS溶液重溶沉淀。将得到粗纯化抗体在AKTA纯化系统上，以1ml/min流速上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mM PBS pH7.0)清洗，然后用0.1M甘氨酸-盐酸溶液pH2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1M pH 9.0Tris缓冲液中和)，得到目的抗体。然后SDS-PAGE及Western Blotting鉴定分离纯化的单抗，并分别命名为5D2F2单克隆抗体、5E4G5单克隆抗体、2G7A9单克隆抗体、3F4G8单克隆抗体和4F1B6单克隆抗体。SDS-PAGE结果如图3所示，纯化后的5D2F2与5E4G5抗体仅有50kd处的重链和25kd处的轻链，灰度分析显示，抗体纯度达到95％。重组蛋白Cystatin S 5μg每孔上样，5D2F2与5E4G5抗体1:10000稀释，Western Blotting结果如图4所示，显示抗体特异性的与重组蛋白反应。
测定单克隆抗体效价：以5μg/ml的重组蛋白的碳酸盐缓冲液(pH 9.5)，100ul体积4度过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体，(1：1000，1：2000，1：4000，1：64000)，加入羊抗鼠IgG-HRP(1:10000)，确定纯化后单克隆抗体效价(S/N>2.1)，5D2F2单克隆抗体效价为1:32000、5E4G5单克隆抗体效价为32000、2G7A9单克隆抗体效价为16000、3F4G8单克隆抗体效价为64000和4F1B6单克隆抗体效价为8000。
采用抗体叠加试验分析5D2F2单克隆抗体、5E4G5单克隆抗体、2G7A9单克隆抗体、3F4G8单克隆抗体和4F1B6单克隆抗体所识别的表位，确定不同抗体所识别表位，当叠加指数I大于50％时，认定为抗体识别不同的表位，抗体叠加实验结果如表1所示。
表1、抗体叠加试验叠加指数I


结果显示，仅有5D2F2单克隆抗体与5E4G5单克隆抗体的叠加指数I大于50％，确定5D2F2与5E4G5识别不同的表位，可以作为检测Cystatin S蛋白的配对抗体。因此将杂交瘤细胞株5D2F2与5E4G5送保藏中心保藏，其保藏号分别为CCTCC NO：C201416和CCTCC NO：C201415。将5D2F2作为捕获抗体，5E4G5作为检测抗体可以建立双抗体夹心ELISA法检测Cystatin S蛋白。
将杂交瘤细胞株5D2F2与5E4G5分泌的单克隆抗体进行质谱分析，分析结果显示杂交瘤细胞株5D2F2分泌的单克隆抗体的抗原决定簇为ARQQTVGGV(SEQ ID NO.5)，杂交瘤细胞株5E4G5分泌的单克隆抗体的抗原决定簇为VPWENRRSLVKSR(SEQ ID NO.6)。也就是说，ARQQTVGGV和VPWENRRSLVKSR为Cystatin S蛋白的抗原表位，可以作为5D2F2与5E4G5单克隆抗体检测Cystatin S蛋白的靶标。
实施例3 Cystatin S多抗的制备、纯化及鉴定
用实施例1纯化的Cystatin S重组蛋白免疫家兔，500μg每只，每两周免疫一次，共三次；取兔的全血，先用硫酸铵沉淀法从兔的血清中初步纯化免疫球蛋白IgG，具体步骤为首先将兔血清4℃、12000rpm离心20分钟，收集上清液；逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液，室温搅拌30分钟，然后置于4度冰箱放置2小时。此过程中有大量蛋白沉淀析出。将此溶液4℃，12000rpm离心20分钟，弃去上清，用4倍血清原体积的磷酸盐缓冲液重新溶解沉淀，4℃、12000rpm离心2分钟。弃沉淀，收集上清液。再用Protein A-Sepharose亲和层析柱1ml/min流速上样，用5个柱体积的结合缓冲液(50mM PBS，pH7.0)清洗，然后用0.1M甘氨酸-盐酸溶液pH2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1M Tris缓冲液，pH 9.0中和)，得到目的抗体。然后用SDS-PAGE及Western Blotting(单抗1:1000稀释)鉴定分离纯化的多抗，结果分别如图5所示。纯化后的抗体纯度大于95％，且保持了原有活性，多抗经1:12000倍稀释后，可以特异性的检测到重组蛋白，没有其他交叉反应。
实施例4、构建Cystatin S的ELISA诊断试剂盒
采用商品化的活化辣根过氧化物酶标记5D2F2单克隆抗体和5E4G5单克隆抗体，按说明书进行标记。然后分别设计棋盘试验，将以重组蛋白Cystatin S浓度为0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、8μg/mL的碳酸盐缓冲液包被酶标板，4℃放置14小时后用不同的酶标单克隆抗体按照1:1000，1:2000，1:5000，1:10000，1:20000比例稀释，确定酶标抗体的最优稀释比例。结果显示，酶标抗体最佳稀释比例为1:5000。
首先在96孔酶标板上包被捕获抗体5D2F2(浓度为2.5μg/mL)，每孔100μL，4℃过夜弃掉孔内液体，随后将重组人Cystatin S蛋白用含质量分数为5％FBS的PBS溶液稀释为0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL的浓度梯度，每孔100μL，37℃孵育1小时，然后用PBST洗涤酶标板5次。将辣根过氧化物标记的单克隆抗体5E4G5，按照1:5000的比例用PBS溶液稀释，每孔100μL，37℃孵育1小时。排干溶液，用PBST清洗酶标板5次，拍干。将TMB溶液与过氧化氢溶液按照1:1的比例配制显色缓冲液，混匀。每孔加入100μL显色底物溶液。37℃显色反应15min，加入2M的硫酸溶液100μL，终止显色反应，酶标仪进行OD450读数。EXCEl分析重组蛋白浓度与OD450的关系，进行线性回归分析，见图6所示。
固相载体的确定：对美国Corning、德国Greiner、美国Thermo和丹麦Nunc 4个不同厂家生产的酶标板进行了比较，结果显示，美国corning公司(货号为：9018)和thermo(货号为：468667)公司的酶标板符合背景OD值＜0.1，且信噪比较高。
包被液的选择：根据抗体包被于固相载体所需要的缓冲体系，ELISA常用包被液为缓冲盐溶液，分别用磷酸盐缓冲液(pH7.5)和碳酸盐缓冲液(pH9.6)检测包被环境对反应体系的影响，结果显示碳酸盐缓冲液(pH9.6)可满足空白组OD值＜0.1，有效区分空白组、阴性组和阳性组，信噪比较高。
稀释剂的选择：通过实验对比了2种商品化稀释剂(分别购自天津博美科生物技术有限公司(货号BMKF017-1)；上海西唐生物科技有限公司(货号C0901))和自制稀释剂的稀释效果，主要从保护蛋白能力，自身稳定性两方面评价稀释剂的稀释效果。结果显示自制稀释剂的效果最佳，自制稀释剂各组分的终浓度如下：3mM EDTA、质量分数为5％的FBS、1×PBS、质量分数为0.05％的Tween-20和质量分数为0.02％的硫柳汞(pH6.0)。
稳定剂的选择：使用3种稳定剂(具体如下：稳定剂Ⅰ：质量分数为3％的蔗糖，体积分数为8％的甘油和质量分数为1.3％的NaCl；稳定剂Ⅱ：质量分数为3％的蔗糖，体积分数为8％的甘油，质量分数为0.1％的EDTA和质量分数为1.3％的NaCl，稳定剂Ⅲ：体积分数 为68.8％的PBS，体积分数为30％的胎牛血清和质量分数为0.2％的硫柳汞)分别稀释单克隆抗体、蛋白标准品和多克隆抗体至浓度为0.5mg/mL、0.16ng/mL和50μg/mL，使用时按体积比为1：100稀释。并于第0天、第7天和第14天进行检测OD值。结果显示，稳定剂Ⅲ效果最佳，具体组分为：体积分数为68.8％的PBS、体积分数为30％胎牛血清和质量分数为0.2％硫柳汞。
通过以上筛选确定ELISA诊断试剂盒的主要组分，然后按照表1建立成熟的Cystatin S的ELISA诊断试剂盒。
表1、Cystatin S的ELISA诊断试剂盒

评价Cystatin S的ELISA诊断试剂盒：使用Cystatin S的ELISA诊断检测Cystatin S阳性质控品，确定试剂盒线性范围为50pg/ml-1600pg/ml，在线性范围内标准品线性相关系数r≥0.990；回收率在90％～110％范围内；用高低2个浓度水平(高浓度为160pg/ml，低浓度为80pg/ml)的样本使用试剂盒各重复检测10次，变异系数CV≤10％；用3个批号试剂盒检测同一样本，则3个批号试剂盒的批间变异系数CV≤15％。并对试剂盒稳定性进行了研究，长 期稳定性(4℃8个月)开封稳定性(4℃2个月)运输稳定性(0-4℃7天)的相关实验结果显示，ELISA诊断试剂盒可达到以上产品要求，符合产品预期效果。
实施例5、Cystatin S的ELISA诊断试剂盒用于肠癌诊断
从上海肿瘤医院收集100例肠癌患者术前血清；同时从血站收集245例健康献血人员血清，每例血1mL。使用Cystatin S的ELISA诊断试剂盒肠癌、正常人血清中Cystatin S浓度。结果：健康献血人员血清Cystatin S范围是14.39-267.8pg/ml，均值为75.43pg/ml；肠癌患者血清Cystatin S范围是49.5-732.54pg/ml，均值为145.23pg/ml。ROC曲线统计结果如图7所示，然后根据ROC曲线统计Cystatin S的曲线下面积，结果如表3所示。结果显示给出用于区分肠癌与正常人的cutoff值101pg/ml，曲线下面积0.879，诊断灵敏度78％，特异性94.8％。
表3、Cystatin S的曲线下面积
检验结果变量:VAR00002

检验结果变量:VAR00002在正的和负的实际状态组之间至少有一个结。统计量可能会出现偏差。
a.在非参数假设下
b.零假设：实面积＝0.5
实施例6、Cystatin S的ELISA诊断试剂盒用于肠癌疗效评估
对上海肿瘤医院肠癌患10例，治疗前检测Cystatin S浓度，疗程结束后再检测Cystatin S浓度。如果Cystatin S浓度与治疗前相比下降小于50％，判断为治疗无效；Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于50％，判断为病情改善；Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于90％，判断为有效；Cystatin S浓度下降至101pg/ml以下，判断为治疗效果显著。同时，医生根据临床症状评估大肠癌的疗效，结果如表4所示。
表4、Cystatin S的ELISA诊断试剂盒评估肠癌疗效结果
患者编号治疗前后浓度变化百分比临床评价01降低17％无效02升高27％无效03降低43％无效04升高6％无效05降低92％有效06降低73％改善07降低96％有效
08降低56％改善09降低42％无效10降低34％无效
由表4可知，Cystatin S的ELISA诊断试剂盒的疗效评估结果是10例患者中，其中2例患者治疗有效，2例患者治疗后病情得到改善，其余6例患者无治疗效果，与临床判断结果一致。
实施例7、Cystatin S的ELISA诊断试剂盒用于肠癌转移复发监控
对上海肿瘤医院6例疗程结束后的早期肠癌患者进行跟踪随访，治疗后6周首次采集血清，并检测血清中Cystatin S浓度，以后每隔三个月检测一次，跟踪九个月，共检测四次，结果如表5所示。在疗程结束后9个月，医生根据临床症状判断大肠癌患者是否发生转移复发，结果如表5所示。
表5、Cystatin S的ELISA诊断试剂盒监控肠癌转移复发结果
患者编号6周pg/ml3个月pg/ml6个月pg/ml9个月pg/ml临床评价01147.86150.32175.17177.41转移复发02121.45125.68118.72122.16无进展生存03116.24120.54124.42119.29无进展生存04112.15104.34119.53129.16无进展生存05107.86112.54160.96173.59转移复发06138.58130.65129.77139.56无进展生存
由表5可知，结果显示，通过Cystatin S的ELISA诊断试剂盒检测血清Cystatin S浓度变化，可早于临床症状和体征发现肠癌患者是否复发转移，为医生可提前进行干预提供指导。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。