一种核酸测序方法 【技术领域】
本发明属分子生物学领域，尤其涉及一种核酸测序方法。
背景技术
在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础，被广泛应用于人类基因组测序、人类遗传病、传染病和癌证的临床诊断、生物工程药物的筛选、动植物杂交育种、动物亲子鉴定和性别鉴定、植物疾病诊断、法医鉴定等方面。美国ABI公司生产的系列核酸序列分析仪(DNA测序仪)由于实现了全部操作自动化，包括自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等，以及结果的高准确性，目前是市场上最受客户欢迎并被广泛应用的用于核酸序列分析的仪器。该仪器采用的是sanger双脱氧链终止法原理、采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddntp(标记终止物法)，通过单引物PCR(聚合酶链式反应)测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3′末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。该测序方法目前已经被标准化，主要由以下几步组成：①目的片段PCR扩增②PCR扩增产物的纯化③利用纯化的PCR产物进行测序PCR扩增④测序PCR产物纯化⑤上机读取序列分析结果。由于操作全部自动化、DNA产物需被荧光物质标示等特点，目前，测序成本相对来说较昂贵，虽然随着高通量DNA测序仪的被开发和使用，测序成本有所降低，但市场上客户的实际要求主要还是中、低通量样本的序列分析(比如对受检者的DNA样本进行基因检测，在较短的时间内就得出具序列分析报告，因此，很难在短时间内收集到大量样本进行测序)，因此，降低中、低通量检测样本的测序成本是生物技术产业面临的主要问题之一。
【发明内容】
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种可大幅降低成本、测序结果稳定、质量高、所需基因组DNA量少的核酸测序方法。
本发明的技术解决方案是：本发明提供了一种核酸测序方法，其特殊之处在于：所述核酸测序方法包括以下步骤：
1)目的核酸片段进行PCR扩增；
2)对步骤1)所得到的PCR扩增产物进行纯化；
3)对步骤2)所得到的纯化后的PCR扩增产物进行测序PCR扩增；
4)对步骤3)所得到的测序PCR扩增产物进行纯化，其具体实现方式是：
4.1)将测序PCR扩增产物全量、磁珠8～12ul、85％酒精40～50ul充分混匀后置于空磁力架上2～10分钟；
4.2)弃掉上清液；
4.3)加入80～200ul85％酒精进行清洗，并弃掉上清液；
4.4)空气中干燥1～10分钟；
5)上机读取序列分析结果，其具体实现方式是：加入15～25ul 0.1mM EDTA后导入测序读板中，上机读取结果。
上述步骤4.1)中测序PCR扩增产物全量、磁珠9～11ul、85％酒精40～45ul充分混匀后置于空磁力架上2～5分钟。
上述步骤4.1)中测序PCR扩增产物全量、磁珠10ul、85％酒精42ul充分混匀后置于空磁力架上3分钟。
上述磁珠是CleanSEQ磁珠；所述磁力架是SPRI96磁力架。
上述步骤2)的具体实现方式是：对步骤1)所得到的PCR扩增产物以虾碱酶加碱性磷酸酶进行纯化，其具体实现方式是：
取PCR扩增产物全量、虾碱酶加碱性磷酸酶0.125-0.5ul、ddH2O 1.5ul充分混匀后离心，虾碱酶加碱性磷酸酶作用反应条件：37℃30分钟；80℃15分钟；15℃储存。
上述步骤2)中虾碱酶与碱性磷酸酶的比例为1∶3。
上述步骤1)的具体实现方式是：
1.1)取DNA1-20ng、正向扩增引物2.5pmol、反向扩增引物2.5pmol、HotStartTaq MasterMix 5ul、ddH2O 3.9ul充分混匀后离心；
1.2)将步骤1.1)所得到的混合液进行PCR反应，PCR反应条件：95℃15分钟；95℃30秒、50-60℃30秒、72℃1分钟，35循环；72℃3分钟；15℃储存。
本发明的优点是：本发明所提供的核酸测序方法经过对现有技术的不断优化，采用磁珠法纯化测序PCR产物，操作简便，操作时间短，纯化后产物可直接上机，读取测序结果，测序信号比采用醋酸钠/乙醇法纯化法强，测序结果质量好；同时以虾碱酶加碱性磷酸酶替代Centri-SepTM Columns纯化PCR扩增产物，操作简单，不需换管操作，对于中低通量测序，可大大降低实验成本，所需基因组DNA量少，测序结果稳定、质量高，特别适合中、低通量样本的序列分析，操作简便。
【附图说明】
图1为利用本发明所提供的测序方法进行核酸测序的测序图谱。
【具体实施方式】
本发明提供了一种核酸测序方法，该方法包括以下步骤：
1)目的核酸片段进行PCR扩增，其具体实现方式是：
1.1)取基因组DNA1-20ng(1ul)、正向扩增引物2.5pmol(0.05ul)、反向扩增引物2.5pmol(0.05ul)、HotStart Taq MasterMix 5ul、ddH2O 3.9ul充分混匀后离心；
1.2)将步骤1.1)所得到的混合液进行PCR反应，PCR反应条件：95℃15分钟；95℃30秒、50-60℃30秒、72℃1分钟，35循环；72℃3分钟；15℃储存。
与现有技术不同的是，本发明在步骤一中做了改进，传统的测序方法目的片段PCR扩增步骤一般使用基因组DNA100-500ng进行反应，使用HotStart试剂盒进行PCR扩增，通过优化实验条件，所用基因组DNA的量可在1-20ng之间，大大降低了遗传资源DNA的用量。
2)对步骤1)所得到的PCR扩增产物进行纯化，对步骤1)所得到的PCR扩增产物以虾碱酶加碱性磷酸酶进行纯化，其具体实现方式是：
取PCR扩增产物全量、虾碱酶加碱性磷酸酶0.125-0.5ul、ddH2O 1.5ul充分混匀后离心，虾碱酶加碱性磷酸酶作用反应条件：37℃30分钟；80℃15分钟；15℃储存。
这里，本发明也进行了改进，传统的测序方法在PCR扩增产物的纯化时，采用的是Centri-SepTM Columns进行纯化，需要换管操作并离心，容易损失PCR产物；以虾碱酶加碱性磷酸酶替代Centri-SepTM Columns纯化PCR扩增产物，操作简单，不需换管操作方便操作。
3)对步骤2)所得到的纯化后的PCR扩增产物进行测序PCR扩增；
4)对步骤3)所得到的测序PCR扩增产物进行纯化，其具体实现方式是：
4.1)将测序PCR扩增产物全量、CleanSEQ磁珠8～12ul、85％酒精40～50ul充分混匀后置于SPRI96空磁力架上2～10分钟；(CleanSEQ磁珠及SPRI96空磁力架为Beckman公司产品)还可以是测序PCR扩增产物全量、CleanSEQ磁珠9～11ul、85％酒精40～45ul充分混匀后置于SPRI96空磁力架上2～5分钟；最好是测序PCR扩增产物全量、CleanSEQ磁珠10ul、85％酒精42ul充分混匀后置于SPRI96空磁力架上3分钟。原则上说，各种磁珠及相配套的磁力架应该各公司的产品都行，只不过用Beckman公司产品摸的实验条件。
4.2)弃掉上清液；
4.3)加入80～200ul85％酒精进行清洗，并弃掉上清液；
4.4)空气中干燥1～10分钟；
传统的测序方法中，PCR产物纯化采用的是BigDye Xterminator purificationkit，成本贵，采用醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物，操作复杂，测序结果信号较弱，杂峰交易出现，本发明采用磁珠法纯化测序PCR产物，操作简便，操作时间短，纯化后产物可直接上机，读取测序结果，测序信号比采用醋酸钠/乙醇法纯化法强，测序结果质量好；测序成本比采用BigDye Xterminator purificationkit便宜，对于中低通量测序，一个反应成本降低3元人民币。
5)上机读取序列分析结果，其具体实现方式是：加入15～25ul 0.1mM EDTA后导入测序读板中，上机读取结果。
参见图1，目前，采用的方法已经对近一万个样本进行测序，测序结果稳定、质量高，特别适合中、低通量样本的序列分析。