一种离子液体中酶促选择性水解制备帕罗西汀中间体的方法.pdf

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1、10申请公布号CN101974579A43申请公布日20110216CN101974579ACN101974579A21申请号201010540343922申请日20101111C12P17/1220060171申请人浙江九洲药业股份有限公司地址318000浙江省台州市椒江区外沙路99号72发明人沈文和黄和刘维明车大庆胡燚邹彬74专利代理机构南京天华专利代理有限责任公司32218代理人徐冬涛54发明名称一种离子液体中酶促选择性水解制备帕罗西汀中间体的方法57摘要本发明一种离子液体中酶促选择性水解制备帕罗西汀中间体的方法，涉及一种基于生物酶催化制备手性药物中间体的方法，尤其是一种生物催化法制备4。

2、R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸I的方法。所述的方法以44氟苯基1R2，6二氧哌啶3，5二甲酸二乙酯II为原料，在含有助溶剂的缓冲液体系中以生物酶为催化剂，1560，摇床转速100250RPM条件下制备4R，5S5甲酰乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸I。本发明提供的制备方法反应条件温和，转化率最高可达98，纯度最高可达96，并且原子利用度高，符合绿色化学的要求，生产成本大大下降。式I化合物可通过脱羧、还原等步骤得到帕罗西汀重要中间体3R，4S44氟苯基3羟甲基1R哌啶III。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页CN10。

3、1974584A1/2页21一种离子液体中酶促选择性水解制备帕罗西汀中间体的方法，其特征在于所述的方法是以式II所示的44氟苯基1R2，6二氧哌啶3，5二甲酸二乙酯为原料，在离子液体和缓冲液的混合体系中以生物酶为催化剂，1560，摇床转速100250RPM条件下选择性水解制备式I所示的4R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸，其反应方程式为其中，R为H、C1C6的烷烃基、C2C6烯烃基、C2C6炔烃基或叔丁氧羰基、苄氧羰基、烯丙氧羰基、芴甲氧羰基或三甲基硅乙氧羰基。2如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述生物酶选自南极假丝酵母脂肪酶A，南极假丝酵母脂肪酶B，猪胰脂肪酶，皱褶假。

4、丝酵母脂肪酶，洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶，黑曲霉脂肪酶，嗜热真菌脂肪酶，米黑毛霉脂肪酶，猪肝酯酶，兔肝酯酶，优选南极假丝酵母脂肪酶A，南极假丝酵母脂肪酶B，猪肝酯酶或兔肝酯酶。3如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述的式II化合物浓度为10MMOL/L150MMOL/L，所述的式II化合物与生物酶的质量之比为100101，优选1002003。4如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的缓冲液为PH6080，00505M的磷酸盐缓冲液或PH7085，00505M的TRISHCL缓冲液。5如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的离子液体选自BMIMPF6、BMPYPF6、NMIMPF6、。

5、BMIMBF4、HMIMBF4、EMIMBF4、PMIMBF4或BMIMNTF2，优选BMIMPF6、BMPYPF6或BMIMBF4。6如权利要求1、4或5所述的制备方法，其特征在于所述的离子液体与缓冲液之比为115W/V，G/ML。7如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的反应条件为温度1560，优选30；转速100250RPM；反应时间1272H，优选1830H。8如权利要求1所述的制备方法，其特征在于该制备方法可以通过TLC监测反应进度，展开剂为乙酸乙酯与石油醚体积比为121的混合溶剂，显色剂为溴甲酚绿溶液。9如权利要求1所述的制备方法，其特征在于该制备方法可以通过气相色谱检测反应转。

6、化率和产物纯度。10如权利要求1所述的制备方法，其特征在于反应是按照以下步骤进行的A配制00505M的缓冲液，依次加入离子液体、生物酶和式II化合物，所述的式II化合物浓度为10MMOL/L150MMOL/L，所述的式II化合物与生物酶的质量之比为100101，所述的离子液体与缓冲液之比为115W/V，G/ML；B控制反应条件为温度1560，转速100250RPM，反应时间1272H，TLC跟踪监测反权利要求书CN101974579ACN101974584A2/2页3应进程，直至反应不再进行为止；C离心去除生物酶得上清液，上清液旋转蒸发去除水和生成的乙醇，加入乙酸乙酯萃取，萃余液回收离子液体，。

7、萃取液加入无水NA2SO4干燥，气相色谱分析反应转化率和产物纯度。权利要求书CN101974579ACN101974584A1/6页4一种离子液体中酶促选择性水解制备帕罗西汀中间体的方法技术领域0001一种离子液体中酶促选择性水解制备帕罗西汀中间体的新方法，尤其是一种离子液体中酶促选择性水解制备4R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸的方法，属于生物催化技术领域。背景技术0002随着社会的进步和经济的发展，抑郁症这种新型病症正困扰着现代人的生活，严重影响人们的健康水平。目前抑郁症患者全球已达34亿人之多，为世界第四大疾病，预测到2020年其将上升为全球第二大疾病仅次于心脑血管疾病。

8、。世界卫生组织、世界银行和哈佛大学的一项联合研究表明，抑郁症已经成为中国疾病负担的第二大病，但仅有约10的患者得到了有效的治疗。帕罗西汀最早由美国SMITHKLINEBEECHAM公司开发，并于1992年作为抗抑郁药推出，其是第一个同时治疗抑郁和焦虑的5羟色胺再摄取抑制剂SSRIS药物，也是目前全球应用最为普遍的抗抑郁药之一。帕罗西汀作为一种强5羟色胺再摄取抑制剂，在抑郁药治疗方面具有疗效肯定，副反应少等有优点，且近年来其国内医院用药金额逐年增加，排在各类抗抑郁药之首，因此开发帕罗西汀及其中间体将会带来良好的经济和社会效益。00034R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸I是合成。

9、3S，4R44氟苯基3羟甲基1R哌啶III的重要中间体，3S，4R44氟苯基3羟甲基1R哌啶III又称为左旋帕罗醇，是合成抗抑郁药帕罗西汀的重要中间体。中国专利CN2009101010419报道了手性4取代2，6二氧哌啶3，5二甲酸单酰胺类化合物的制备方法，如下式所示00040005该方法以4取代2，6二氧哌啶3，5二甲酸类化合物为原料，在生物酶的作用下与有机胺或氨气反应，在有机溶剂中于1560制备手性4取代2，6二氧哌啶3，5二甲酸单酰胺类化合物，收率85，纯度97。0006核心专利WO9322284A1、WO9403428A1、WO9802556A2报道了利用羧基酯酶特异性水解式IV化合物。

10、制备帕罗西汀中间体式IVA化合物，该化合物经一步还原可以得到帕罗西汀重要中间体左旋帕罗醇，如下式所示0007说明书CN101974579ACN101974584A2/6页50008WO9322284A1在TRIS缓冲液和DMSO的混合体系91，V/V中采用猪肝酯酶特异性水解式IV化合物制备帕罗西汀中间体式IVA化合物，IVA与IVB异构体之比为9010。WO9403428A1针对该路线对超过300种微生物进行筛选获得一株名为ACHROMOBACTERSP的产酶菌株，使用分离纯化得到的酶催化该反应，最适PH介于78，最终产物EE值仅为30。WO9802556A2采用分子生物学手段构建产酶基因工程。

11、菌用于该反应的催化，收率高达9095。该路线使用的式IV化合物为外消旋体，水解后仍有50的异构体不能用于最终帕罗西汀的制备，因此该路线存在原料利用率低，生产成本高的不足。0009核心专利WO2009005647A2报道了生物酶选择性水解式V化合物经式VI化合物制备帕罗西汀中间体式VII化合物，该化合物经一步还原可以得到帕罗西汀重要中间体左旋帕罗醇，如下式所示00100011该方法首先制备得到式V化合物，然后选择酯酶、脂肪酶或蛋白酶等水解酶作为催化剂在缓冲液体系中选择性催化水解后脱羧最终得到式VII化合物，该路线理论转化率为100，相对于拆分法理论转化率为50而言，该路线原料利用率高、生产成本低。

12、、更具有实用价值。但该路线在水解过程中为提高底物浓度采用了缓冲液和有机溶剂的混合体系，有机溶剂的使用不利于环境保护。0012离子液体作为生物催化反应介质的研究已有较多研究报道且逐渐成为研究热点。离子液体被称为“绿色液体”，具有很多有机溶剂所不可比拟的优势1对很多有机化合物具有很好的溶解性；2基本无蒸汽压，不可燃，有优异的化学和热稳定性，易分离溶解于其中的化合物，可以循环使用；3可设计性强，可以通过改变阴离子或阳离子来调节甚至彻底改变离子液体的性质，从而“设计”合成适合某种特殊反应的离子液体；4能够维持甚至提高酶以及微生物全细胞的催化活性、操作稳定性和立体选择性。因此开发一种在离子液体中酶促选择。

13、性水解制备高光学纯度的帕罗西汀中间体的新方法将会有很好的应用前景。说明书CN101974579ACN101974584A3/6页6发明内容0013本发明的目的是提供一种在离子液体中酶促选择性水解制备高光学纯度的帕罗西汀中间体的新方法，尤其是一种离子液体中酶促选择性水解制备4R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸的方法。0014本发明采用的技术方案是0015以式II所示的44氟苯基1R2，6二氧哌啶3，5二甲酸二乙酯为原料，在离子液体和缓冲液的混合体系中以生物酶为催化剂，1560，摇床转速100250RPM条件下选择性水解制备式I所示的4R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌。

14、啶3羧酸，其反应方程式为00160017其中，R为H、C1C6的烷烃基、C2C6烯烃基、C2C6炔烃基或叔丁氧羰基、苄氧羰基、烯丙氧羰基、芴甲氧羰基、三甲基硅乙氧羰基等烷氧羰基。0018所述生物酶选自南极假丝酵母脂肪酶ALIPASEAFROMCANDIDAANTARCTICA，南极假丝酵母脂肪酶BLIPASEBFROMCANDIDAANTARCTICA，猪胰脂肪酶LIPASEFROMPORCINEPANCREATIC，皱褶假丝酵母脂肪酶LIPASEFROMCANDIDARUGOSA洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶LIPASEFROMBURKHOLDERIACEPACIA，黑曲霉脂肪酶LIPASEFROM。

15、ASPERGILLUSNIGER，嗜热真菌脂肪酶LIPASEFROMTHERMOMYCESLANUGINOSUS，米黑毛霉脂肪酶LIPASEFROMMUCORMIEHEI，猪肝酯酶ESTERASEFROMPORCINELIVER，兔肝酯酶ESTERASEFROMRABBITLIVER，优选南极假丝酵母脂肪酶ALIPASEAFROMCANDIDAANTARCTICA，南极假丝酵母脂肪酶BLIPASEBFROMCANDIDAANTARCTICA，猪肝酯酶ESTERASEFROMPORCINELIVER或兔肝酯酶ESTERASEFROMRABBITLIVER。0019所述的式II化合物与生物酶的质量。

16、之比为100101，优选1002003。0020所述的缓冲液为PH6080，00505M的磷酸盐缓冲液或PH7085，00505M的TRISHCL缓冲液。0021所述的离子液体选自BMIMPF6、BMPYPF6、NMIMPF6、BMIMBF4、HMIMBF4、EMIMBF4、PMIMBF4或BMIMNTF2，优选BMIMPF6、BMPYPF6或BMIMBF4。0022所述的离子液体与缓冲液之比为115W/V，G/ML。0023所述的反应条件为温度1560，优选30；转速100250RPM；反应时间1272H，优选1830H。说明书CN101974579ACN101974584A4/6页7002。

17、4该制备方法可以通过TLC监测反应进度，展开剂为乙酸乙酯与石油醚体积比为121的混合溶剂，显色剂为溴甲酚绿溶液。0025该制备方法可以通过气相色谱检测反应转化率和产物纯度。0026所述的离子液体中酶促选择性水解制备帕罗西汀中间体的方法是按照以下步骤进行的0027A配制00505M的缓冲液，依次加入离子液体、生物酶和式II化合物，所述的式II化合物浓度为10MMOL/L150MMOL/L，所述的式II化合物与生物酶的质量之比为100101，所述的离子液体与缓冲液之比为115W/V，G/ML；0028B控制反应条件为温度1560，转速100250RPM，反应时间1248H，TLC跟踪监测反应进程，。

18、直至反应不再进行为止；0029C离心去除生物酶得上清液，上清液旋转蒸发去除水和生成的乙醇，加入乙酸乙酯萃取，萃余液回收离子液体，萃取液加入无水NA2SO4干燥，气相色谱分析反应转化率和产物纯度。0030反应转化率和产物纯度通过气相色谱法测定，VARIANCPWAX52CB极性色谱柱30025MM，025M，气相色谱分析条件为进样口250，检测器250，柱温140保留2MIN，以10/MIN升温至240维持10MIN，载气为H2，流速为20ML/MIN，分流比120，尾吹N2流速25ML/MIN，燃烧器H2流速30ML/MIN，空气流速300ML/MIN。0031反应转化率C和产物纯度P分别按下。

19、式计算00320033其中A，A0反应前后式II化合物的浓度，G/L；0034B反应生成的式I化合物的浓度，G/L；0035B0反应生成的所有产物的浓度，G/L。0036本发明的有益效果本发明实现了离子液体中酶促选择性水解制备4R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸，反应条件温和，操作简单，原料利用率高，转化率理论可达100，实际转化率达98，纯度最高可达96，并且酶与离子液体可重复利用，对环境污染小，有利于降低生产成本。0037本发明使用具有“绿色液体”之称的可设计性强的离子液体作为反应介质，离子液体对很多有机化合物有很好的溶解性，且其基本无蒸汽压，具有良好的化学和热稳定性，有。

20、利于酶催化活性、操作稳定性和立体选择性的保持，另外其可以循环使用，产物分离容易。本发明实现了帕罗西汀中间体在离子液体中的制备，为帕罗西汀的制备提供了一条可行的途径。具体实施方式0038下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，但本发明的保护并不仅限于此0039本发明所涉及的生物酶及其它试剂均为市场购买所得，其中南极假丝酵母脂肪酶A、猪胰脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶、洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶、嗜热真菌脂肪酶、米黑毛霉脂肪酶、猪肝脏酯酶、兔肝脏酯酶购自SIGMA公司，南极假丝酵母脂肪酶B购自说明书CN101974579ACN101974584A5/6页8NOVOZYMES诺维信公司，黑曲霉脂肪酶购自。

21、深圳绿维康生物工程有限公司。0040实施例中采用44氟苯基1甲基2，6二氧哌啶3，5二甲酸二乙酯为底物，简称化合物IIA。00410042实施例10043取05G化合物IIA于反应器中，加入50ML、PH70、02M的磷酸盐缓冲液、15G离子液体BMIMPF6和10MGLIPASEAFROMCANDIDAANTARCTICA，于水浴振荡器中30、200RPM条件下反应24H，期间TLC跟踪检测反应进程。反应结束后，离心去除生物酶得上清液，上清液旋转蒸发去除水和生成的乙醇，加入乙酸乙酯萃取，萃余液回收离子液体，萃取液加入少量无水NA2SO4干燥，气相色谱分析反应转化率和产物纯度。00444R，5。

22、S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸，转化率87，纯度79。0045实施例20046取05G化合物IIA于反应器中，加入50ML、PH70、02M的磷酸盐缓冲液、15G离子液体BMIMPF6和10MGLIPASEBFROMCANDIDAANTARCTICA，于水浴振荡器中30、200RPM条件下反应18H，期间TLC跟踪检测反应进程。反应结束后，离心去除生物酶得上清液，上清液旋转蒸发去除水和生成的乙醇，加入乙酸乙酯萃取，萃余液回收离子液体，萃取液加入少量无水NA2SO4干燥，气相色谱分析反应转化率和产物纯度。00474R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸，转化率97，。

23、纯度91。0048实施例30049取05G化合物IIA于反应器中，加入50ML、PH70、02M的磷酸盐缓冲液、15G离子液体BMIMPF6和15MGESTERASEFROMPORCINELIVER，于水浴振荡器中30、200RPM条件下反应24H，期间TLC跟踪检测反应进程。反应结束后，离心去除生物酶得上清液，上清液旋转蒸发去除水和生成的乙醇，加入乙酸乙酯萃取，萃余液回收离子液体，萃取液加入少量无水NA2SO4干燥，气相色谱分析反应转化率和产物纯度。00504R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸，转化率98，纯度88。0051实施例40052取05G化合物IIA于反应器中，加。

24、入50ML、PH70、02M的磷酸盐缓冲液、15G离子液体BMIMPF6和15MGESTERASEFROMRABBITLIVER，于水浴振荡器中30、200RPM条件下反应24H，期间TLC跟踪检测反应进程。反应结束后，离心去除生物酶得上清说明书CN101974579ACN101974584A6/6页9液，上清液旋转蒸发去除水和生成的乙醇，加入乙酸乙酯萃取，萃余液回收离子液体，萃取液加入少量无水NA2SO4干燥，气相色谱分析反应转化率和产物纯度。00534R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸，转化率94，纯度96。0054实施例50055取05G化合物IIA于反应器中，加入50。

25、ML、PH75、02M的TRISHCL缓冲液、20G离子液体BMPYPF6和10MGLIPASEBFROMCANDIDAANTARCTICA，于水浴振荡器中30、200RPM条件下反应30H，期间TLC跟踪检测反应进程。反应结束后，离心去除生物酶得上清液，上清液旋转蒸发去除水和生成的乙醇，加入乙酸乙酯萃取，萃余液回收离子液体，萃取液加入少量无水NA2SO4干燥，气相色谱分析反应转化率和产物纯度。00564R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸，转化率79，纯度93。0057实施例60058取05G化合物IIA于反应器中，加入50ML、PH75、02M的TRISHCL缓冲液、15G。

26、离子液体BMIMBF4和15MGESTERASEFROMRABBITLIVER，于水浴振荡器中30、200RPM条件下反应24H，期间TLC跟踪检测反应进程。反应结束后，离心去除生物酶得上清液，上清液旋转蒸发去除水和生成的乙醇，加入乙酸乙酯萃取，萃余液回收离子液体，萃取液加入少量无水NA2SO4干燥，气相色谱分析反应转化率和产物纯度。00594R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸，转化率85，纯度89。实施例70060取05G化合物IIA于反应器中，加入50ML、PH75、02M的TRISHCL缓冲液、15G离子液体BMIMBF4和15MGESTERASEFROMPORCINELIVER，于水浴振荡器中30、200RPM条件下反应24H，期间TLC跟踪检测反应进程。反应结束后，离心去除生物酶得上清液，上清液旋转蒸发去除水和生成的乙醇，加入乙酸乙酯萃取，萃余液回收离子液体，萃取液加入少量无水NA2SO4干燥，气相色谱分析反应转化率和产物纯度。00614R，5S5甲酸乙酯44氟苯基1R2，6二氧哌啶3羧酸，转化率75，纯度86。说明书CN101974579A。