一种大肠杆菌包涵体复性的方法 【技术领域】
本发明涉及涉及的是生物工程下游蛋白质纯化领域，具体涉及大肠杆菌蛋白表达形成包涵体的复性方法。
背景技术
大肠杆菌被广泛用来表达那些不需要翻译后修饰如糖基化维持活性的蛋白质，然而大肠杆菌大量表达重组蛋白质常常导致其聚集并形成蛋白沉淀——包涵体。包涵体蛋白没有生物活性，需要复杂的溶解，复性，纯化来得到有功能活性的产品。通常，要用高浓度的变性剂(尿素，盐酸胍)溶解包涵体，同时加入还原剂如β-巯基乙醇，蛋白溶解后，在存在氧化剂的条件下通过缓慢去掉变性剂的方法来复性。
传统的包涵体复性方法的缺点：(1)用高浓度变性剂溶解包涵体将导致蛋白质二级结构丧失，这样将使肽链随机缠绕并使疏水表面暴露，而包涵体复性出有生物活性的蛋白质效率低的主要原因是在溶解时失去了蛋白质二级结构，在复性的过程中变性的蛋白质相互缠绕聚集沉淀。(2)在很多时候，包涵体复性的回收率大概为15-25％，其占有大肠杆菌生产重组蛋白的绝大部分费用。因此，生物工程的一个很大挑战就是将这种没有活性和不可溶的蛋白更有效的转化为可溶和正确折叠的蛋白质。因此，如果能找到一种溶解的方法使包涵体溶解但又不使其二级结构丧失，这不仅可以使蛋白质复性成功率更高，而且可以大大减少其生产活性蛋白的费用。
【发明内容】
为了克服现有的包涵体复性方法需要复杂的操作步骤，周期长，而且回收率低的缺点，本发明在包涵体溶解时采用温和的溶解方法保留了蛋白聚集体的二级结构，从而简化了蛋白质复性，提高了蛋白回收率，降低生产成本。
为实现上述目的，设计一种大肠杆菌包涵体复性的方法，其特征在于具体的工艺步骤如下：(1)包涵体蛋白的收集，4℃5000rpm/min 6min离心收集菌体，将菌体超声破碎，4℃8000rpm/min 30min高速冷冻离心得到P003B蛋白包涵体；(2)包涵体的纯化，重悬包涵体于50mL洗涤缓冲液(50mM Tris，500mMNaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100，10％甘油，pH 8.0)溶解杂蛋白及其他杂质从而纯化P003B包涵体；(3)包涵体复性，在4℃，溶解的包涵体通过恒流泵(BT-100上海青浦沪西仪器厂)用复性缓冲液(50mM Tris 500mM NaCl 2M Urea0.5mM EDTA 1％Triton X-100 10％甘油1mM PMSF pH 8.0)缓慢稀释(0.5mL/min)至缓冲液pH为8.0，并不断搅拌。
本发明与现有技术相比，温和溶解方法保留了在包涵体形成过程中形成的蛋白质二级结构，提高了包涵体复性的效率，简化了复性的步骤，节约了时间，从而大大降低了重组蛋白生产的费用。
【具体实施方式】
实施例1 P003B包涵体蛋白纯化
1.培养1L P003B重组大肠杆菌37℃240rpm/min诱导表达重组蛋白使其形成包涵体。
2.4℃5000rpm/min 6min离心收集菌体(CR21G II日本日立)。
3.弃去上清重悬菌体沉淀于50mL重悬缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，5mMEDTA，pH 8.0)。
4.超声破碎(400瓦，工作1秒，间息1秒，总时长5分钟)(JY96-II超声波细胞粉碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司)。
5.4℃8000rpm/min 30min高速冷冻离心(CR21G II日本日立)。
6.弃去上清重悬沉淀于50mL洗涤缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100，10％甘油，pH 8.0)。
7.超声溶解(400瓦，工作1秒，间息1秒，总时长5分钟)
8.4℃8000rpm/min 30min高速冷冻离心(CR21G II日本日立)。
9.弃去上清重悬沉淀于50mL洗涤缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100，10％甘油，pH 8.0)37℃孵育过夜。
10.超声溶解(400瓦，工作1秒，间息1秒，总时长5分钟)
11.4℃8000rpm/min 30min高速冷冻离心(CR21G II日本日立)。
12.弃去上清重悬沉淀于50mL洗涤缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，5mM EDTA，1％Triton X-100，10％甘油，pH 8.0)室温孵育30min。
13.超声溶解(400瓦，工作1秒，间息1秒，总时长5分钟)
14.4℃8000rpm/min 30min高速冷冻离心(CR21G II日本日立)。(得到纯净的包涵体)
15.弃去上清重悬沉淀于100mL包涵体溶解缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，2M Urea，1mM PMSF pH 8.0)。
16.将重悬的包涵体分成11份，分别调节包涵体溶解缓冲液pH值到3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，13.0。
17.分别超声溶解(400瓦，工作1秒，间息1秒，总时长1分钟)。
18.分别4℃8000rpm/min 30min高速冷冻离心(CR21G II日本日立)。
19.分别取各不同pH值超声溶解液上清液20ul进行SDS-PAGE分析，观察哪个酸碱度下包涵体溶解的量大，筛选出包涵体温和溶解最适酸碱度pH 12。
20.在4℃，溶解的包涵体通过恒流泵(BT-100上海青浦沪西仪器厂)用复性缓冲液(50mM Tris 500mM NaCl 2M Urea 0.5mM EDTA 1％Triton X-100 10％甘油1mM PMSF pH 8.0)缓慢稀释(0.5mL/min)至缓冲液pH为8.0，并不断搅拌。
21.复性好的包涵体用0.22um滤膜过滤使其澄清。