用于检测抗草甘膦转基因大豆及加工品EPSPS基因的引物 【技术领域】
本发明涉及一种利用环介导等温扩增技术进行抗草甘膦转基因大豆及加工品快速筛选与检测的方法，具体是一种快速检测抗草甘膦转基因大豆及加工品内含的整合基因EPSPS所用的引物序列。
背景技术
植物基因工程的迅速发展促进了许多转基因植物的出现，它们对人类健康及环境安全的影响受到全世界的广泛关注。科学地对转基因植物及其产品进行长期有效地监控，建立快速、有效的检测方法体系，对人类健康及农业可持续发展具有重要意义。由于对转基因作物及其产品安全性的关注及国际贸易等问题，世界许多国家纷纷出台了严格的管理法规。现有135个国家在2000年1月对此已达成协议。如欧盟规定，食品中基因修饰物质(genetically modified orgnisms，GMOs)的含量如果超过1％，就必须在标签上做出标示。我国于2002年5月公布了转基因农产品的标识规定，并于2003年3月20起正式实施。我国政府规定，凡是列入标识管理目录并用于销售的农业转基因作物应当加以标识，未标识和不按规定标识的，不得进口和销售。这样，就必须对农作物中的GMOs进行检测。
除草剂是现代农业生产中十分重要的生产资料，为拓展除草剂的应用范围和防止除草剂药害，世界各国对抗除草剂作物品种的选育高度重视，现已育成了一系列抗除草剂的作物品种，转基因抗草甘膦大豆便是其中最有代表性的抗除草剂作物类型之一。草甘膦是一种非选择性除草剂，它通过竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)干扰芳香族氨基酸的生物合成而发挥毒性作用。当前用于生产的抗草甘膦大豆主要是以CP4-EPSPS基因转化大豆获得的。转基因抗草甘膦大豆的育成和应用极大地拓展了草甘膦的应用范围和机动性，为豆田杂草防除带来了历史性变革。
抗草甘膦转基因大豆是通过脓杆菌介导、PEC介导、电击、花粉管通道、微注射和基因枪等方法将外源基因EPSPS导入大豆植株体内而获得的。检测转基因的方法已有不少报道，目前建立的检测抗草甘膦转基因大豆及加工品方法主要依照检测内源基因Lectin，35S启动子，NOS终止子和目的基因EPSPS，操作比较繁琐，且由于豆制品经过高温等处理基因结构遭到破坏，较难检测。近年来出现的以蛋白为目标的检测方法(ELISA和胶体金快速检测试纸条法)价格昂贵，难在日常检测中普及。LAMP技术是2000年NotomiT等发明的一种体外恒温核酸扩增方法，即所谓的环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermalamplification，简称LAMP)技术。因其具有高特异性、高效率和快速反应等特点，可以大量扩增所需的靶序列。该方法只需要极少的试剂费用和一个水浴锅即可完成绝大多数PCR检测的过程，无论是实验室检验还是现场检验都可以准确快速灵敏的完成，是真正普及型的核酸检测方法。
【发明内容】
本发明的目的是针对EPSPS基因设计一组特异性引物，进而建立一种快速筛选和检测抗草甘膦转基因大豆及加工豆制品的方法，以克服基于蛋白的检测方法在豆制深加工产品检测中的局限性，为转基因产品检测提供有效工具，从而加强转基因产品的监督监管，确保产品标签的一致性，保护消费者的知情权和选择权。
本发明的主要原理为：设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109～1010拷贝。扩增结果可通过荧光染料染色肉眼观察。
本发明涉及的EPSPS基因环介导等温核酸扩增检测用的引物，其序列如下：
(1)上游内引物(FIP)：5’-AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGACACC-3’；
(2)下游内引物(BIP)：5’-AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG-3’；
(3)上游外引物(F3)：5’-CCATGGGCGCCAGGAT-3’；
(4)下游外引物(B3)：5’-ATCGGGCGCTTTGTGAG-3’。
在应用中，上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物体积比为：6∶6∶1∶1。
使用上述引物，检测产品中抗草甘膦转基因植物成分的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)：
(1)待检样品DNA地提取
DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。
(2)EPSPS环介导等温扩增
A.在扩增反应管中加入10×Bst buffer反应缓冲液2.5μL(内含200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100)、25mmol/LdNTP1.3μL、100mmol/L硫酸镁3μL、2mol/L甜菜碱5μL、10μmol/L上游内引物3μL、10μmol/L下游内引物3μL、10μmol/L上游外引物0.5μL、10μmol/L下游外引物0.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶1μL、ddH2O(灭菌双蒸水)3.2μL，混匀；
B.在扩增反应管中加入待检样品DNA2μL(约200ng)，混匀；
C.于恒温水浴上65℃放置60min；
D.将水浴调到85℃中止反应，5min后取出待检。
(3)结果检测
在待检的每个反应管中加入1μL显色剂PICO Green，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为红色，说明待检样品未检出EPSPS基因，如果颜色变为橙黄色，则说明检出EPSPS基因，待检样品中含有抗草甘膦转基因植物成分。也可以通过琼脂糖电泳对实验结果进行检测。配制1.5％的琼脂糖凝胶，LAMP实验结果取2μL进行琼脂糖电泳。调整电泳仪至80V电泳约45min，置于凝胶成像分析系统下观测实验结果。
本发明根据EPSPS基因的保守序列，设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物。该组引物可保证在抗草甘膦转基因植物中EPSPS基因的检出。使用该组引物，采用环介导等温扩增技术，可灵敏、特异地检出转基因大豆及加工品中的EPSPS基因。该方法不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅，且结果可以用凝胶电泳方法来观察，亦可以使用荧光染料观察，简单而快速，特别适用于一些基层单位。
【附图说明】
图1用环介导等温扩增技术检测某待测抗草甘膦转基因大豆样品DNA，样品的显色反应。
图2用环介导等温扩增技术检测某待测豆制品——豆腐样品DNA，样品的电泳检测反应。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
按照以下程序进行检测：
(1)待测转基因大豆样品DNA的提取
A.称取0.1g大豆，磨碎，转至1.5mL离心管中。加入600μL预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65℃水浴保温10min；
B.在管中加入等体积酚/氯仿600μL，上下颠倒充分混匀，抽提2min；
C.12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液，混匀，常温放置10min后，12000g离心5min，去上清，保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μL RNA酶，37℃放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37℃溶解沉淀，5min后加入300μL缓冲液，上下颠倒混匀10次；
E.取出离心柱，将离心柱放置在1个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min；
F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入200μL洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
G.在离心柱中加入200μL70％乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
H.12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；
I.将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50μL洗脱缓冲液，37℃放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。
(2)待测大豆样品DNA的环介导等温核酸扩增
A.在扩增反应管中加入10×Bst buffer反应缓冲液2.5μL(内含200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100)、25mmol/LdNTP1.3μL、100mmol/L硫酸镁3μL、2mol/L甜菜碱5μL、10μmol/L上游内引物3μL、10μmol/L下游内引物3μL、10μmol/L上游外引物0.5μL、10μmol/L下游外引物0.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶1μL、ddH2O(灭菌双蒸水)3.2μL，混匀；
B.在扩增反应管中加入待检样品DNA 2μL(约200ng)，混匀；
C.于恒温水浴上65℃放置60min；
D.将水浴调到85℃中止反应，5min后取出待检。
(3)加入显色剂PICO Green，显色检测
样品管颜色变为橙黄色，见图1。阴性对照和空白对照结果均正常，据此可判定该样品检出EPSPS基因。
实施例2
按照以下程序进行检测：
(1)待测豆腐样品DNA的提取
A.称取0.1g豆腐，剪碎，转至1.5mL离心管中。加入600μL预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65℃水浴保温10min；
B.在管中加入等体积酚/氯仿600μL，上下颠倒充分混匀，抽提2min；
C.12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液，混匀，常温放置10min后，12000g离心5min，去上清，保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μL RNA酶，37℃放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37℃溶解沉淀，5min后加入300μL缓冲液，上下颠倒混匀10次；
E.取出离心柱，将离心柱放置在1个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min；
F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入200μL洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
G.在离心柱中加入200μL70％乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
H.12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；
I.将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50μL洗脱缓冲液，37℃放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。
(2)待测豆腐样品DNA的环介导等温扩增
A.在扩增反应管中加入10×Bst buffer反应缓冲液2.5μL(内含200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100)、25mmol/LdNTP1.3μL、100mmol/L硫酸镁3μL、2mol/L甜菜碱5μL、10μmol/L上游内引物3μL、10μmol/L下游内引物3μL、10μmol/L上游外引物0.5μL、10μmol/L下游外引物0.5μL、8U/μL Bst DNA聚合酶1μL、ddH2O(灭菌双蒸水)3.2μL，混匀；
B.在扩增反应管中加入待检样品DNA 2μL(约200ng)，混匀；
C.于恒温水浴上65℃放置60min；
D.将水浴调到85℃中止反应，5min后取出待检。
(3)琼脂糖电泳检测
对豆制品——豆腐样品进行LAMP检测，电泳图谱见图2。结果表明豆腐样品出现阶梯状条带，而阴性和空白对照均没有条带产生，即检测到转基因成分EPSPS基因。阴性对照和阳性对照结果均正常，据此可判定该样品检出EPSPS基因阳性。
核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>用于检测EPSPS基因的引物
<160>4
<210>1
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)…(38)
<400>1
aatcgagcggcgcctcaggccgtaaggaaggcgacacc 38
<210>2
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)…(33)
<400>2
aatgccgccacgggctcgtcgccgatgaaggtg 33
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)…(16)
<400>3
ccatgggcgccaggat 16
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim_bind
<222>(1)…(17)
<400>4
atcgggcgctttgtgag 17