陆地棉中一个新的纤维发育相关microRNA基因 一、技术领域
本发明涉及与陆地棉纤维发育相关的一个未知miRNA(ghr-MIR8)基因的克隆、鉴定。对陆地棉徐州142胚珠分别建立了野生型(WT)和无绒无絮纤维突变体(M)两个小分子RNA文库，采用了目前国际最先进的small RNA高通量测序列技术，获得了上述新的miRNA基因序列。进一步预测该miRNA的靶基因，但未验证到靶基因。本发明属于生物技术领域。ghr-MIR8在棉花纤维中被克隆到且在WT和M中表达丰度悬殊，可见该miRNA在纤维发育过程中有着不容忽视的作用，因此研究该miRNA的功能对探究棉纤维发育的机理将会有推动作用。
二、背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是一类主要在高等动植内新发现的内生的、非编码、长度为20-25nt的单链小分子RNA。大量研究表明，miRNA作为真核生物基因表达的主要负调控因子在调节植物生长发育，细胞增值、胁迫响应等过程中发挥着重要的作用。棉花是一种全球性的重要经济作物，也是最主要的纺织纤维作物，在国民经济中占重要地位。我国是世界上最大的棉花生产和消费国，也是一个重要的棉花贸易国，因此，棉花作为经济作物在我国更是具有举足轻重的地位(http://www.emergingtextiles.com)。棉花纤维的发育机理迄今还不清楚，因此成为备受关注的热点，因为它关系到如何提高棉纤维产量(提高单位面积棉纤维伸长的数量)，改良纤维品质，而所有这些是与纺织工业和民生密切相关的现实问题。
随着现代分子生物学技术的发展，国内外除了利用常规育种手段外，逐步运用基因工程技术对棉纤维品质进行遗传改良。利用基因工程改良纤维品质依赖于对纤维发育相关基因及其调控元件的认识。因此，开展分离、鉴定与棉花纤维发育相关的功能基因是培育优质棉纤维新品种，实现育种理论和关键技术新突破的重要基础，也是提升我国棉花育种原始创新力的关键举措。
据估计，棉花纤维发育过程中有上千特异基因表达，但到目前为止，仅有少数基因被分离鉴定，对这些基因的表达机理及网络调控知之甚少。miRNA与棉纤维发育的关系更是鲜有人研究。2007年我们实验室率先在已有的棉花基因组中挖掘出了37miRNA。这也是国内外迄今为止从棉花植物中发掘到最多的miRNA。这些重要的miRNA基因对调控棉花生长及纤维发育具有重要的生物学意义及潜在的生产开发价值。因此，迫切需要对我国已有的特色棉花资源，通过大规模克隆方法充分挖掘和开发属于本国知识产权的新的miRNA(包括其它sRNA)基因，为后期定向改良和培育优质性状的棉花种质奠定基础。
本专利所克隆到的新的miRNA来自于陆地棉品种，在突变体及野生型中均表达，其在突变体中相对于野生型表现为下调，但未预测到靶基因，可能与棉花至今还不完整的基因组序列相关。ghr-MIR8在WT与M中的表达丰度差异表明其与棉纤维发育存在未知的关系，因此，研究miRNA在棉花纤维发育中的作用具有重要的生物学意义和潜在应用价值。
三、发明内容
技术问题本发明的目的是克隆陆地棉纤维发育过程中一个重要的miRNA(ghr-MIR8)，分析和鉴定了二级结构。对该miRNA基因的功能研究对棉纤维发育的机理有一定的推动作用，且以此miRNA为基础，通过基因工程的方法研究棉纤维发育的机理及改变目前棉纤维的品质特性，能够获得一定的经济及社会效益，为棉花的品质育种提供基因资源，尽快提高我国棉花品种的纤维品质。
技术方案
陆地棉pre-ghr-MIR8(基因表达前体)，长度为76bp，序列如下：
GGTGTGGGAGAGTTGGGCAAGAATTATGACCTTTGTTCAATCCAAAGGGGCAATTCTTACCAACCCCTCCCATACC
1.按照Illumina Sample Preparation Protocol文库构建方法，分别构建了陆地棉Xuzhou-142(WT)和Xuzhou-142光籽突变体(M)开花后(0，1，2，3，4，5，6，8，10天，DPA)胚珠cDNA两个文库。
2.从文库中挑取克隆，进行转化，将分析得到的高质量的长度为18-30nt的小片段RNA进行高通量测序。根据测序结果，进一步进行BLAST比对分析，筛选符合miRNA标准的序列。
有益效果
1.目前常用的sRNA克隆分析技术费时费力而且效率低、不灵敏，有些表达丰度低或者特异性表达的小分子RNA根本测不出来。本研究采用目前国际上最先进的大规模高通量测序，其优点为：
(1)灵敏度高，准确性高，能够测出一个拷贝的小分子RNA，测定的RNA分子的碱基准确率高；
(2)高通量、规模大，能够测定几乎所有基因组的转录子。两个文库的测序量高达到130万条碱基序列以上，包涵所有的小分子RNA序列；
(3)同时测定小分子RNA的表达丰度，因此可以比较两个基因文库中小分子RNA表达谱的差异。
2.本发明所克隆到的miRNA ghr-MIR8为棉花中未被发表过的非保守miRNA，miRNA与纤维发育的关系迄今研究甚少，该基因在纤维中被克隆到并在野生型及突变体中表达量不同，以此基因作为目的基因，对棉花进行基因转化理论上可直接改变纤维质量或数量等，并为探知纤维发育的机理再添一笔，而且可能有效地提高其种植生长效益，打破产量品质的负相关，为棉花的品质育种提供基因资源，获得优质棉花，带来可观的经济社会效益。
3.目前转基因的外源基因大部分来源于微生物，这类转基因作物对安全性评价要求严格。本专利报道的基因来源于棉花，再导入棉花不存在安全性评价问题。同时，与棉纤维发育相关的miRNA基因目前在国内外申请的专利甚少。
四、附图说明
图1.ghr-MIR8前体二级结构图。该miRNA从无绒无絮纤维突变体及野生型陆地棉中克隆得到，并具有较高的相对表达丰度。在5′及3′端均能检测到不同丰度片段(红字黑线部分)，3′端为miRNA＊片段。
五、发明的具体实施例
1.棉花胚珠采集：棉花种植地为江苏省农科院试验田，开花期进行挂牌。不同时期胚珠采集后立即液氮冷冻，-80℃冰箱保存，备用。
2.按照Illumina Sample Preparation Protocol文库构建方法，构建了陆地棉Xuzhou-142(WT)和Xuzhou-142光籽突变体(M)开花后0，1，2，3，4，5，6，8，10天(DPA)胚珠混合cDNA两个文库。
3.从文库中挑取克隆，进行分离鉴定转化，将分析得到的高质量的长度为18-30nt的RNA进行高通量测序。根据测序结果，进一步进行BLAST比对分析，筛选符合miRNA标准的序列。
ghr-MIR8.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>南京农业大学
<120>陆地棉中一个新的纤维发育相关microRNA基因
<130>说明书
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>76
<212>DNA
<213>Gossypium hirsutum
<220>
<221>ghr-MIR8前体基因
<222>(1)..(76)
<223>
<400>1
ggtgtgggag agttgggcaa gaattatgac ctttgttcaa tccaaagggg caattcttac 60
caacccctcc catacc 76