一种基于温度差异性探针基因芯片检测方法.pdf

本发明提出了一种基于温度差异性探针基因芯片检测方法，利用两种不同荧光标记对基因芯片进行质量控制，在较低温下，目的探针与带第一荧光基团标记寡聚体序列先进行杂交，检测第一荧光基团，判断目的探针是否固定于基片上；在较高温下，目的探针与第二荧光基团标记待检测的DNA序列杂交，检测第二荧光基团，判断检测的DNA序列信息。同时使用两种荧光能快速、简便地检测目的探针是否固定在基片上，从而排除因目的探针未固定而出现的假阴性结果，提高基因检测结果的准确性及可靠性。

权利要求书
1.  一种基于温度差异性探针基因芯片检测方法，其特征在于，该方法包括以下几个步骤：
步骤一：样品制备：
制备含有目的探针（3）的溶液和第一荧光基团（1）标记的寡聚体序列（4）的溶液；并将上述目的探针（3）的溶液和第一荧光基团标记（1）标记的寡聚体序列（4）的溶液充分混合，制备成点样溶液；
步骤二：基因芯片制备
将上述混合后的点样溶液点样于修饰于手臂分子（6）的基片（7）上形成N个探针斑点，N为自然数，经固定，在低温T1下，低温T1范围为0~30 °C，所述所有探针斑点中目的探针（3）与第一荧光基团（1）标记的寡聚体序列（4）发生杂交反应，获得每个探针斑点对应的第一杂交产物溶液；清除未固定的探针和未杂交的寡聚体序列，完成基因芯片的制备；
步骤三：通过检测寡聚体序列（4）的信号检测目的探针（3）通过手臂分子（6）固定在基片（7）上：
检测上述所有第一杂交产物溶液发出的荧光信号，若在第一荧光基团（1）的激发波长下检测到荧光，则表示寡聚体序列（4）通过手臂分子（6）固定在基片（7）上，同时说明目的探针（3）通过手臂分子（6）固定在基片（7）上；
否则，若任一个探针斑点对应的第一杂交产物溶液在第一荧光基团（1）的激发波长下未检测到荧光，表示寡聚体序列（4）未通过手臂分子（6）固定在基片（7）上。

2.  根据权利要求1所述的基于温度差异性探针基因芯片检测方法，其特征在于，还包括以下步骤：
步骤四：将待测序列（5）杂交
将第二荧光基团（2）标记的待测序列（5）与质量合格基因芯片上所述的探针斑点中的目的探针（3）在高温T2下进行杂交，高温T2范围为20~60°C，杂交后，目的探针（3）中的探针和待测序列（5）结合形成第二杂交产物；
步骤五：确定待测序列（5）的序列信息
对所述第二杂交产物进行荧光信号检测，若在第二荧光基团（2）的激发波长下检测到荧光，则确定目的探针（3）与待测序列（5）互补，并确定待测序列（5）的序列信息；
若在第二荧光基团（2）的激发波长下未检测到荧光，则表示不能确定目的探针（3）与待测序列（5）互补，无法确定待测序列（5）的序列信息。

3.  根据权利要求2所述的基于温度差异性探针基因芯片检测方法，其特征在于，所述的低温和高温相差不小于10°C。

4.  根据权利要求2所述的基于温度差异性探针基因芯片检测方法，其特征在于，所述的目的探针（3）是脱氧核糖核酸、核糖核酸或者肽核酸。

5.  根据权利要求2所述的基于温度差异性探针基因芯片检测方法，其特征在于，所述的基片（7）为玻璃片、硅胶晶片、塑料、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、微型磁珠或者管盖。

6.  根据权利要求2所述的基于温度差异性探针基因芯片检测方法，其特征在于，所述的第一荧光基团（1）和所述的第二荧光基团（2）不相同，且上述两种荧光基团的荧光发射峰大于40nm。

7.  根据权利要求6所述的基于温度差异性探针基因芯片检测方法，其特征在于，所述的第一荧光基团（1）和所述的第二荧光基团（2）为Cy3、Cy5、Fitc、FAM或者Rhodamine。

8.  根据权利要求6所述的基于温度差异性探针基因芯片检测方法，其特征在于，所述的第一荧光基团（1）和第二荧光基团（2）为生物素-亲和素与标记物质结合的标记复合物。

9.  根据权利要求8所述的基于温度差异性探针基因芯片检测方法，其特征在于所述的标记物质为荧光蛋白、铁蛋白、胶体金、荧光素或化学发光物质。

说明书一种基于温度差异性探针基因芯片检测方法
技术领域：
本发明属于基因芯片质量控制领域，具体涉及一种基于温度差异性探针基因芯片检测方法。
背景技术：
基因芯片技术作为近年来快速发展的一项生物高新技术，为解决怎样研究基因在生命过程中所担负的功能提供了光辉的前景。基因芯片技术是指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
与传统核酸印迹杂交方法相比，基因芯片同时将大量根据靶基因的特征及检测要求预先设计好的探针固定在支持物表面，一次杂交可检测和分析样品中多种靶基因的相关信息，解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足，使基因芯片技术具有了高通量、多参数同步分析，快速全自动分析，高精确度分析，高灵敏度分析的特点。但用荧光标记的PCR产物与匹配探针杂交对未知DNA序列片段进行检测的方法本身也存在缺陷：      
1）基因芯片荧光检测主要依赖于检测结果的荧光强度，没有荧光强度或者荧光强度弱的即判断为阴性，但在阴性的结果中无法确定是否是探针固定上；2）多种基因芯片技术平台得到的研究结果不一致，因此基因芯片的有效性控制已成为目前基因技术研究的热点，尤其是应用型基因芯片尚无一些准确、高效地有效性检测方法，其应用的推广尚有困难。因此发展一种准确、高效地有效性检测方案来检测探针是否固定成为一种迫切的需要。
基因芯片有有效性控制方案包括基因芯片探针、支持物制备的有效性控制、探针在支持物上的固定效率即基因芯片制备的有效性控制，以及基因芯片检测时的有效性控制、检测结果的标准化等一系列问题。本专利主要针对的是制备有效性的基因芯片。
制备有效性基因芯片的传统方法有以下几种：一种方法是利用荧光DNA染料对单链DNA探针染色，根据荧光DNA染料强度来估计芯片的有效性；利用目的探针3点样液和荧光基团1标记的质量控制探针8点样液分别点样于修饰了手臂分子6的基质7上，形成各自的斑点，然后使目的探针3在斑点处与带基团有同种或异种荧光基团标记2的待测DNA序列杂交，根据质量探针8点样位置是否发荧光，估计芯片的有效性，根据目的探针点位置是否发荧光，判定待测DNA序列信息，如图１所示。但是以上的这些方法都无法直接、有效地评价芯片制备的质量。
这种基因芯片质量控制的方法可减少了基因检测中假阳性结果出现的可能性，极大地提高了检测结果的准确性。通常基因芯片的缺陷是其自身质量无法得到较好的控制，如果能够有一种方法能够对这样一种新型的基因芯片对芯片的有效性进行控制，那么将会大大提高其检测的可靠性，为其利用的推广更进一步。
发明内容：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于温度差异性探针基因芯片检测方法，能较直接地检测探针是否固定在基片上，以排除因探针缺失而造成的阴性结果出现的可能性，提高了基因芯片检测的准确性和可靠性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明基于温度差异性探针基因芯片检测方法包括以下几个步骤：
步骤一：样品制备：
制备含有目的探针的溶液和第一荧光基团标记的寡聚体序列的溶液；并将上述目的探针的溶液和第一荧光基团标记的寡聚体序列的溶液充分混合，制备成点样溶液；
步骤二：基因芯片制备
将上述混合后的点样溶液点样于修饰了手臂分子的基片上形成N个探针斑点，N为自然数，经固定，在低温T1下，低温T1范围为0~30 °C，所述所有探针斑点中目的探针与第一荧光基团标记的寡聚体序列发生杂交反应，获得每个探针斑点对应的第一杂交产物溶液；清除未固定的探针和未杂交的寡聚体序列，完成基因芯片的制备；
步骤三：通过检测寡聚体序列（4）的信号检测目的探针通过手臂分子固定在基片上：
检测上述所有第一杂交产物溶液发出的荧光信号，若在第一荧光基团的激发波长下检测到荧光，则表示寡聚体序列通过手臂分子固定在基片上，同时说明目的探针通过手臂分子固定在基片上，从而判定基因芯片质量合格；
否则，若任一个斑点中在第一荧光基团的激发波长下未检测到荧光，表示寡聚体序列未通过手臂分子固定在基片上，判定为基因芯片质量不合格。
本发明混合型探针检测基因芯片有效性的方法，还包括以下步骤：
步骤四：杂交
将第二荧光基团标记的待测序列与质量合格的基因芯片上点样的斑点中的目的探针在高温T2下进行杂交，高温T2范围为20~60°C，杂交后，目的探针中的探针和待测序列结合形成第二杂交产物；
步骤五：确定待测序列的序列信息
对所述第二杂交产物进行荧光信号检测，若在第二荧光基团的激发波长下检测到荧光，则确定目的探针与待测序列互补，并确定待测序列的序列信息；
若在第二荧光基团的激发波长下未检测到荧光，则表示不能确定目的探针与待测序列互补，无法确定待测序列的序列信息。
   所述的低温和高温相差不小于10°C。
所述的目的探针是脱氧核糖核酸、核糖核酸或者肽核酸。
所述的基片为玻璃片、硅胶晶片、塑料、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、微型磁珠或者管盖。
所述的第一荧光基团和所述的第二荧光基团可为Cy3、Cy5、Fitc、FAM或者Rhodamine，但是所述的第一荧光基团和所述的第二荧光基团使用时不相同，并且在检测时两种荧光基团的荧光发射峰要大于40nm的差异，防止两者在检测时由于吸收峰重叠而无法正确得出结果。
所述的第一荧光基团和第二荧光基团为生物素-亲和素与标记物质结合的标记复合物。
   所述的标记物质为荧光蛋白、铁蛋白、胶体金、荧光素或化学发光物质。
    本专利所提的目的探针是一段已知的核酸或核酸类似物序列片断，并在核酸或核酸类似物链上修饰了活性基团，可通过化学反应固定在被修饰手臂分子的基底上；寡聚体序列是一段已知的、较短核酸或核酸类似物序列片断，末端标记了发光基团或标记复合物；待测序列是一段未知的核酸或核酸类似物序列片断，末端标记了发光基团或标记复合物；手臂分子是多个碳原子组成两端均含有活性基团的小分子有机化合物，一端活性基团可与基底发生化学反应，另一端活性基团可与修饰了活性基团的核酸或核酸类似物链发生化学反应。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
1）传统的检测，只是把一定浓度的质量控制探针固定在目的探针的周围，质量控制探针与目的探针分开点样于基片上，没有考虑到目的探针与待测DNA序列的杂交通常位于固相表面，有一定程度的空间阻碍，若目的探针浓度过高，导致目的探针固定不上去，而本发明是先将目的探针与第一荧光基团标记的寡聚体序列杂交，为后续目的探针与待测DNA序列的提供杂交空间位置，这样大大方便了待检测的DNA序列与目的探针杂交。
   2）目的探针与标记第一荧光的寡聚体序列混合，点样，杂交，因目的探针和寡聚体序列互补，存在分子之间的力，通过检测第一种荧光，可确定目的探针是否通过手臂分子结合在基片上，保证了芯片制作的质量，这种方式也达到实时监测实时监测整个芯片的有效性。
   3）因寡聚体序列相对于目的探针较短，低温0~30 °C时，目的探针与与标记第一荧光的寡聚体序列杂交，高温20~60 °C时，目的探针与标记第二荧光基团的待测序列杂交，通过杂交温度的控制达到与目的探针杂交与寡聚体序列还是待测序列的类型，设计精巧，操作简便。
4）本发明检测基因芯片有效性的方法，若应用于基因芯片制备中，则能够大大提高基因检测结果的准确性及可靠性；同时，不仅可以为基因芯片的制造者提供有效性控制的方法，提高生产质量，又可以为基因芯片的使用者在使用之前对芯片做出评价，简单有效地查出实验中可能出现的问题，从而减少了实验中的分析过程，提高了实验效率。
附图说明
图1为现有技术中的基因芯片有效性的方法的结构示意图；
图2（a）为本发明的基于温度差异性探针基因芯片检测方法低温下的结构示意图；
图2（b）为本发明的基于温度差异性探针基因芯片检测方法高温下的结构示意图；
图 3 （a）为本发明的基于温度差异性探针基因芯片检测方法低温下结构局部放大示意图；
图3（b）为本发明的基于温度差异性探针基因芯片检测方法高温下结构局部放大示意图。
图中：1、第一荧光基团，2、第二荧光基团，3、目的探针，4、寡聚体序列，5、待测序列，6、手臂分子，7、基片，8、质量控制探针。
具体实施方式
    下面将结合附图对本发明作进一步说明。
本发明基于温度差异性探针基因芯片检测方法，包括以下几个步骤：
1、样品制备：
如图2 a、2b、3a、3b所示，制备含有目的探针3的溶液和第一荧光基团1标记的寡聚体序列4的溶液；并将上述目的探针3的溶液和第一荧光基团标记1标记的寡聚体序列4的溶液充分混合，制备成点样溶液；
    2、基因芯片制备
将上述混合后的点样溶液点样于修饰了手臂分子6的基片7上形成N个探针斑点，N为自然数，经固定，在低温T1下，低温T1范围为0~30 °C，所述所有探针斑点中目的探针3与第一荧光基团1标记的寡聚体序列4发生杂交反应，获得每个探针斑点对应的第一杂交产物溶液；清除未固定的探针3和未杂交的寡聚体序列4，完成基因芯片的制备；
3、通过检测寡聚体序列4的信号检测目的探针3通过手臂分子6固定在基片7上：
检测上述所有第一杂交产物溶液发出的荧光信号，若在第一荧光基团1的激发波长下检测到荧光，则表示寡聚体序列4通过手臂分子6固定在基片7上，同时说明目的探针3通过手臂分子6固定在基片7上，从而判定基因芯片质量合格；
否则，若任一个探针斑点对应的第一杂交产物溶液在第一荧光基团1的激发波长下未检测到荧光，表示寡聚体序列4未通过手臂分子6固定在基片7上，判定为基因芯片质量不合格。
    4、将待测序列杂交
将第二荧光基团标记的待测序列5与质量合格基因芯片上所述的探针斑点中的目的探针3在高温T2下进行杂交，高温T2范围为20~60°C，杂交后，目的探针3中的探针和待测序列5结合形成第二杂交产物；
    5、确定待测序列5的序列信息
对所述第二杂交产物进行荧光信号检测，若在第二荧光基团1的激发波长下检测到荧光，则确定目的探针3与待测序列5互补，并确定待测序列5的序列信息；
若在第二荧光基团的激发波长下未检测到荧光，则表示不能确定目的探针3与待测序列5互补，无法确定待测序列5的序列信息。
本发明通过在目的探针与第一荧光基团1标记的寡聚体序列先杂交，优势是可以为目的探针与待测序列的提供空间位置，方便待测序列与目的探针结合，并由多个待测序列分别与相对应的目的探针结合在同一修饰基片中构成一种可以用于控制质量的基因芯片。
通过在第一荧光基团的激发波长下检查探针是否固定于基片上，再在荧光基团1的激发波长下检测待测片段DNA序列。若在第二荧光基团的激发波长下没有检测到荧光则表示探针未固定，若这时能检测到荧光而在第一荧光基团的激发波长下没有检测到荧光则表明结果为阴性，若两次都检测到荧光则结果为阳性。不同的是，由于目的探针与标记第一荧光基团的寡聚体序列稳定杂交的温度0~30 °C较低，而与样品稳定杂交的温度20~60 °C较高。也就是说，较低温度0~30 °C下，标记第一荧光基团的寡聚体序列与目的探针可以稳定杂交（如图2a），而在较高温度20~60 °C下，目的探针与待测序列可以稳定杂交（如图2b）。因此在目的探针与样品进行杂交之前就应当检测第二荧光基团发出的荧光。
实施例1：转基因大豆检测基因芯片
1、样品制备：
制备转基因大豆的目的探针5'-NH2-AAA AAA AAA AAA AAA CTG AAC GGG AAA CGA CAA TCT G-3'的溶液，和采用第一荧光基团Cy5标记寡聚体序列5'-Cy5-TTT TTT TTT TTT TTT-3'的溶液，将上述两个点样溶液充分混合，制备成点样溶液。
2、基因芯片制备：
上述混合后的点样溶液点样于醛基片上，醛基片是经硅烷、戊二醛处理的玻璃片制备成末端修饰了醛基的基片，在醛基片上形成N个探针斑点，N为自然数，经固定，在低温25°C下，所述所有探针斑点中目的探针5'-NH2-AAA AAA AAA AAA AAA CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'与Cy5标记寡聚体序列5'-Cy5-TTT TTT TTT TTT TTT-3'发生杂交反应，获得每个探针斑点对应的第一杂交产物溶液；清除未固定的探针3和未杂交的寡聚体序列4，完成基因芯片的制备。
3、通过检测寡聚体序列5'-Cy5-TTT TTT TTT TTT TTT-3'的溶液的信号检测转基因大豆的目的探针5'-NH2-CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'通过醛基固定在玻璃片上
检测上述所有第一杂交产物溶液发出的荧光信号，若在Cy5的激发波长633 nm下检测到荧光，则表示寡聚体序列5'-Cy5-TTT TTT TTT TTT TTT-3'的溶液通过醛基固定在玻璃片上，同时说明转基因大豆的目的探针5'-NH2-AAA AAA AAA AAA AAA  CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'能通过醛基固定在玻璃片上，从而判定基因芯片质量合格。
    否则，若任一个探针斑点对应的第一杂交产物溶液在Cy5的激发波长633 nm下未检测到荧光，表示寡聚体序列5'-Cy5-TTT TTT TTT TTT TTT-3'的溶液未能通过醛基固定在玻璃片上，判定为基因芯片质量不合格。
4、将待测DNA序列杂交：
将上游引物5'-CTG CTC CAC TCT TCC TTT-3'、下游引物5'-AGA CTC TGT ACC CTG ACC T-3'，及转基因大豆基因组、Tak酶作用下，经PCR扩增得到第二荧光基团Cy3标记的待测序列5，将其与质量合格基因芯片上所述的探针斑点中的目的探针5'-NH2-AAA AAA AAA AAA AAA CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'在55 °C进行杂交，杂交后，目的探针5'-NH2-AAA AAA AAA AAA AAA CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'中的探针和待测序列5结合形成第二杂交产物。
5、确定待测序列5的序列信息：
对所述第二杂交产物溶液进行荧光信号检测，若在Cy3的激发波长533 nm下检测到荧光，则确定转基因大豆的目的探针5'-NH2-AAA AAA AAA AAA AAA CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'与待测序列互补，并确定待测序列5的序列信息含有序列5'-CAG ATT GTC CTT ACC CGC GTT CAG-3'。
若在Cy3的激发波长533 nm下未检测到荧光，则表示不能确定转基因大豆的目的探针5'-NH2-AAA AAA AAA AAA AAA CTG AAG GCG GGA AAC GAC AAT CTG-3'与待测序列5互补，从而无法确定待测序列的排布信息。