特异性结合伐地那非及其结构类似物的单克隆抗体的制备.pdf

特异性结合伐地那非及其结构类似物的单克隆抗体的制备，包括人工免疫抗原、人工检测抗原的合成、免疫小鼠、单克隆抗体的筛选、单克隆抗体的结构特异性鉴定，把M-BSA和伐地那非混合，调节pH，加入戊二醛连接剂；磁力搅拌器缓慢搅拌反应；用蒸馏水透析，冷冻真空干燥，合成得人工免疫抗原；把M-OVA和伐地那非混合，调节pH，加入戊二醛连接剂；磁力搅拌器缓慢搅拌反应；用蒸馏水透析，冷冻真空干燥，合成得人工检测抗原；以竞争抑制ELISA方法检测单克隆抗体对伐地那非和piperidenafil的交叉反应，鉴别出交叉反应率大的、能够特异性结合伐地那非及其结构类似物的单克隆抗体。本发明制备的单克隆抗体对伐地那非及其结构类似物的亲和力平衡常数大于109M-1。

1、  特异性结合伐地那非及其结构类似物的单克隆抗体的制备，包括人工免疫抗原、人工检测抗原的合成、免疫小鼠、单克隆抗体的筛选、单克隆抗体的结构特异性鉴定，其特征是所述人工免疫抗原合成步骤为：把M-BSA和伐地那非以1/160-180摩尔比混合，调节pH到4.5-5.0，加入摩尔数为伐地那非1/5.5-1/6.5的戊二醛连接剂；在25-30℃下用磁力搅拌器缓慢搅拌反应24小时；用蒸馏水4℃透析3天，冷冻真空干燥，4℃保存备用；
所述人工检测抗原合成步骤为：把M-OVA和伐地那非以1/100-120的摩尔比混合，调节pH到4.5-5.0，加入摩尔数为伐地那非1/3-1/4的戊二醛连接剂；在25-30℃下用磁力搅拌器缓慢搅拌反应24小时；用蒸馏水4℃透析3天，冷冻真空干燥，4℃保存备用；
所述单克隆抗体的结构特异性鉴定是以竞争抑制ELISA方法检测每株单克隆抗体对伐地那非和piperidenafil的交叉反应，交叉反应率大的单克隆抗体就是能够特异性结合伐地那非及其结构类似物的单克隆抗体。

特异性结合伐地那非及其结构类似物的单克隆抗体的制备
技术领域
本发明属于免疫化学技术领域，具体涉及一种伐地那非人工抗原的制备方法。在人工抗原中，伐地那非药效必须基团被完整保留并暴露在载体蛋白外部；以此人工免疫抗原、检测抗原为基础，使用杂交瘤技术筛选、鉴定得到特异性识别伐地那非药效必须基团的单克隆抗体。为构建方便、快捷、价廉、高效的伐地那非及其结构类似物免疫检测试剂奠定基础。
背景技术
上世纪末，美国辉瑞公司拟研发一个治疗心绞痛的磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制剂药品，在I、II期临床实验过程中发现部分受试者阳痿症状得到治愈。这个治疗阳痿的药品在1998年获得美国FDA批准上市，就是在全世界掀起“蓝色风暴”的枸橼酸西地那非PDE-5属于环核苷酸水解酶家族，催化细胞第二信使物质环磷鸟苷(cGMP)的水解，PDE-5抑制剂选择性抑制存在于阴茎海绵体的磷酸二酯酶-5的活性，使局部cGMP浓度维持在较高的水平，促进海绵体平滑肌松弛、血流量增加达到治疗阳痿的效果。在西地那非获得成功之后，另外两个抗阳痿PDE-5抑制剂药品盐酸伐地那非(Bayer出品)、他达那非(Lilly出品)在2003年获准上市，这三种PDE-5抑制剂药物牢固地主导着目前全球壮阳药品市场。近几年，世界各国的科研机构和药品检验部门，不断报道在天然保健品中检出了违法添加的PDE-5抑制剂药品，其中不仅包括三种已经获准上市的药物，而且还包括它的进行了轻微结构改造的类似物。美国FDA的S.R.Gratz课题组对来自市场的40种壮阳食品进行检验，结果显示竟有19种含PDE-5抑制剂及相关类似物。
获准上市PDE-5抑制剂药品是处方药，会产生低血压、头痛、肌肉疼痛、鼻塞、脸部潮红、消化不良、视觉异常等副作用，在医生的指导下正确使用正规厂家生产的PDE-5抑制剂，可以把副作用控制在安全的范围，但在不知情的情况下服用违法添加的PDE-5抑制剂，主要有以下几个方面的危险：
①PDE-5抑制剂与硝酸酯药物相互作用导致严重低血压；②众多PDE-5抑制剂类似物存在未知危险因素；③违法添加的PDE-5药物剂量超过安全范围。
任何药物都设定安全使用剂量，三种获准上市的PDE-5药物推荐服用剂量分别是：西地那非25-100mg，伐地那非5-20mg，他达那非5-20mg，超量服用会对身体健康构成威胁。但是，不法商家为了追求更显著的疗效，往往在产品中添加超量的PDE-5药物。多数PDE-5药物结构类似物的药效强于相应的获准上市药品，在超剂量添加的情况下，危险程度成倍增加。美国FDA报道，在饮料中检测出每次服用量含有130mg的西地那非结构类似物homosildenafil，在一颗胶囊中检测到41mg的伐地那非结构类似物piperidino-vardenafil，在固体保健品中检测出含量高达310mg/g的他达那非。患者服用这样的产品危险性是非常大的。
目前，PDE-5抑制剂类药物的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法等等，但是这些方法设备昂贵、运行费用高、操作过程复杂，不适用于在基层部门广泛开展。另外，对于新出现的PDE-5药物的结构类似物，其在色谱柱上的运行规律与已知药物大不相同，得到的阳性结果容易判定为假阴性。免疫检测方法灵敏度高、特异性强、方便快捷、操作简单、成本低廉，无需借助昂贵的设备。
相对于其它几种PDE-5药物，伐地那非及其相关类似物检测方法的研究开发相对薄弱，在国内还没有推出法定的伐地那非检测方法。而伐地那非由于在水、酒类饮料中的溶解性能优于西地那非和他达那非，在国内壮阳中成药和保健品中违法添加的情况十分严重，开发灵敏、高效、特异的伐地那非及其相关类似物检测方法的要求十分迫切。
发明内容
本发明的目的是伐地那非及其结构类似物的单克隆抗体的制备及其在免疫检测试剂制备中的应用，以满足国内外药品检测部门进行专项打假的技术需要。
本发明具体涉及一种使伐地那非药效必须基团被完整保留并暴露在载体蛋白外部的伐地那非人工抗原制备方法。以此人工免疫抗原、检测抗原为基础，使用杂交瘤技术筛选、鉴定得到特异性识别伐地那非药效必须基团的单克隆抗体。并以此为基础开发出的免疫检测试剂，可以检测出所有含伐地那非药效必须基团的药物。
发明内容包括以下几个方面：①把伐地那非化学分别偶联到载体蛋白M-BSA、M-OVA上，分别合成人工免疫抗原、人工检测抗原，药效必须基团被完整保留并暴露在两种人工抗原外部；②用人工免疫抗原免疫Balb/C小鼠，经过初免和三次加强免疫，获得高滴度的特异性抗体；③使用杂交瘤技术，经过细胞融合与筛选，得到尽可能多的分泌特异性结合伐地那非的单克隆抗体细胞株；④使用伐地那非结构类似物，对每一株能够特异性结合伐地那非单克隆抗体进行交叉反应检测，交叉反应率大的单克隆抗体就是能够特异性结合伐地那非及其结构类似物的单克隆抗体。
本发明包括以下技术途径：
①人工免疫抗原和人工检测抗原的合成
伐地那非结构中的苯环是一个富含电子的基团，容易与亲电试剂发生亲电取代。选取该基团作为连接基团，能够使伐地那非药效必须基团保持完整。戊二醛在酸性条件下是亲电试剂，可以分别连接到蛋白质的酪氨酸残基和伐地那非结构中的苯环，合成完整保留伐地那非药效基团并使之暴露在载体蛋白外部的人工抗原。
②单克隆抗体的结构特异性鉴定
使用伐地那非结构类似物，对每一株特异性结合伐地那非单克隆抗体进行交叉反应检测，鉴别交叉反应率大的单克隆抗体，就是能够特异性结合伐地那非及其结构类似物的单克隆抗体。
以下是伐地那非与其类似物的基因分子式。中方框部分是伐地那非及其目前发现的两种类似物的共同基团，是伐地那非及相关类似物的药效必须基团，这个基团将存在于不断出现的伐地那非类似物中。

以下基因分子式表明：使用亲电试剂对伐地那非上的苯环进行取代连接，使伐地那非药效必须基团被完整保留，并在连接剂的手臂效应下暴露在人工抗原外部，有利于刺激动物产生针对伐地那非药效必须基团的抗体。

伐地那非和piperidenafil的共同结构是与药物活性相关的发色团结构，对获得的单克隆抗体进行的结构特异性筛选，是以竞争抑制ELISA方法检测每株单克隆抗体对伐地那非和piperidenafil的交叉反应。交叉反应率大就是特异性识别这两种药品共同结构(发色团结构)的单克隆抗体。利用这种单克隆抗体建立起的免疫检测体系，不仅能够检测伐地那非，还能够检测含有伐地那非发色团结构的结构衍生物。
具体地说，本发明是通过以下技术方案实现的。
1、伐地那非人工免疫抗原和检测抗原的合成；
(1)伐地那非人工免疫抗原的制备：把M-BSA和伐地那非以1/160-180摩尔比混合，调节pH到4.5-5.0，加入摩尔数为伐地那非1/5.5-1/6.5的戊二醛连接剂；在25-30℃下用磁力搅拌器缓慢搅拌反应24小时；用蒸馏水4℃透析3天，冷冻真空干燥，4℃保存备用；
(2)伐地那非人工检测抗原的制备：把M-OVA和伐地那非以1/100-120的摩尔比混合，调节pH到4.5-5.0，加入摩尔数为伐地那非1/3-1/4的戊二醛连接剂；在25-30℃下用磁力搅拌器缓慢搅拌反应24小时；用蒸馏水4℃透析3天，冷冻真空干燥，4℃保存备用；
2、使用伐地那非人工免疫抗原免疫小鼠；
3、用细胞融合杂交瘤技术筛选抗伐地那非单克隆抗体；
4、抗伐地那非单克隆抗体的结构特异性鉴定
(1)使用伐地那非结构类似物piperidenafil，以竞争抑制ELISA方法对每一株特异性结合伐地那非单克隆抗体进行交叉反应检测；
(2)鉴别交叉反应率大的单克隆抗体，就是能够特异性结合伐地那非及其结构类似物的单克隆抗体。
本发明所述的M-BSA(阳离子化牛血清白蛋白)、M-OVA(阳离子化卵清蛋白)以现有的常规方法制备；伐地那非人工免疫抗原免疫小鼠、抗伐地那非单克隆抗体的筛选均采用现有技术。
本发明制备的单克隆抗体对伐地那非及其结构类似物的亲和力平衡常数大于10⁹M^-1。为构建方便、快捷、价廉、高效的伐地那非及其结构类似物免疫检测试剂、为食品药品监管部门专项打假提供有力检测工具打下基础。无论以后出现的伐地那非类似物在结构上如何被衍生化，伐地那非药效必须基团是一定会存在的，都能够被本发明开发出的免疫检测试剂检出。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
具体实施方式一。伐地那非人工免疫抗原、人工检测抗原的合成方法：
①阳离子化牛血清白蛋白(M-BSA)的制备：将300mg牛血清白蛋白(BSA)和400mg碳二亚胺(EDC)溶于15mL蒸馏水中，加入10％乙二胺水溶液1mL，用1N盐酸调pH值至5.5，室温下缓慢搅拌反应2小时。加入200mg EDC，并用1N盐酸调pH值至5.5，室温下继续缓慢搅拌反应过夜。用蒸馏水4℃透析3天，冷冻真空干燥，4℃保存备用；
②阳离子化卵清蛋白(M-OVA)的制备：将100mg卵清蛋白(OVA)和300mg碳二亚胺(EDC)溶于10mL蒸馏水中，加入10％乙二胺水溶液1mL，用1N盐酸调pH值至5.5，室温下缓慢搅拌反应2小时。加入150mg EDC，并用1N盐酸调pH值至5.5，室温下继续缓慢搅拌反应过夜。用蒸馏水4℃透析3天，冷冻真空干燥，4℃保存备用；
③伐地那非人工免疫抗原的制备：把M-BSA和伐地那非以1/160摩尔比混合，调节pH到4.5，加入摩尔数为伐地那非1/5.5的戊二醛连接剂；在25℃下用磁力搅拌器缓慢搅拌反应24小时；用蒸馏水4℃透析3天，冷冻真空干燥，4℃保存备用；
④伐地那非人工检测抗原的制备：把M-OVA和伐地那非以1/100摩尔比混合，调节pH到4.5，加入摩尔数为伐地那非1/3的戊二醛连接剂；在25℃下用磁力搅拌器缓慢搅拌反应24小时；用蒸馏水4℃透析3天，冷冻真空干燥，4℃保存备用；
具体实施方式二：使用伐地那非人工免疫抗原免疫小鼠：
①以伐地那非人工免疫抗原与等量弗氏完全佐剂乳化后，采用皮下多点注射(100μg/0.2mL·只)方式对4只4周龄的雌性BALB/c小鼠进行皮下免疫；
②初免4周后，取伐地那非人工免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，对小鼠采用皮下注射加强免疫(100μg/只)；以后每三周加强免疫1次；
③融合前三天，采用尾静脉注射伐地那非人工免疫抗原水溶液(50μg/只)。准备进行细胞融合实验；
具体实施方式三。用杂交瘤细胞技术筛选抗伐地那非单克隆抗体：
①将1×10⁸脾细胞与2×10⁷骨髓瘤细胞SP2/0混合于50mL融合管中，加DMEM培养基至30mL。1000rpm离心7min，将上清尽量吸净；
②在手掌上轻击融合管底部，使沉淀细胞松散均匀，置40℃水浴中预热。用1mL吸管在1分钟内加预热至40℃的50％PEG(pH 8.0)1mL，边加边轻轻摇动混匀。用5mL吸管在90秒内加20-30mL预热至37℃的不完全DMEM培养基，室温静置10min。800rpm离心7分钟，弃上清；
③加入5mL HAT完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加HAT培养基至80-100mL。分装至融合前一天培养的含有饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100μL；培养板置37℃5％CO₂培养箱内培养；
④培养至第5天，用HT完全培养基换出孔内1/2的HAT培养液。培养至第7天，用HT培养基换出孔内全部培养液；
⑤每天观察杂交瘤细胞生长情况，待杂交瘤细胞长至10％以上孔底面积时，吸出培养液，进行抗体检测；用竞争抑制ELISA方法，筛选出分泌抗伐地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞。
具体实施方式四。单克隆抗体的结构特异性鉴定：
①使用伐地那非结构类似物piperidenafil，以竞争抑制ELISA方法对每一株特异性结合伐地那非单克隆抗体进行交叉反应检测；
②交叉反应率大的单克隆抗体就是能够特异性结合伐地那非及其结构类似物的单克隆抗体。