杀菌剂万隆霉素及其应用 技术领域
本发明涉及植物保护及农药技术领域，具体是指一种杀菌剂万隆霉素及其应用。
背景技术
农用抗生素具有选择性较强、高效、低毒等特点，研究开发抗生素是农药研究的热点。目前报道的防治植物病害的抗生素种类虽多，但能在生产上大面积推广应用的种类却较少，尚缺乏防治病害的高效、低毒的农用抗生素。卵菌病害是指由卵菌纲藻状真菌侵染蔬菜、果树等主要经济作物而引起的病害，常见的如：瓜类疫病、辣椒疫病、番茄晚疫病、马铃薯晚疫病、十字花科蔬菜霜霉病、瓜类霜霉病、荔枝霜霉病等，这些病害病情发展迅速，危害很大，常常造成大面积毁灭、失收。目前对植物卵菌病害的防治，主要依靠化学防治，常用杀菌剂主要是进口的瑞毒霉、杀毒矾及国产的甲霜灵等药物，这些药剂价格昂贵，且使用多年，部分地区已产生抗药性。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述现有技术中存在的不足之处，提供一种杀菌剂万隆霉素及其应用。该杀菌剂由一个新的链霉菌属菌种产生，它适用于防治植物病害等，特别是细菌和卵菌纲真菌引起的病害，而且不污染环境，具有吸引人的防治效果。
本发明首先提供一个新的链霉菌属的菌株，所述菌株被命名为Streptomyces griseovariabilis subsp.Bandungensis n.subsp.GAAS2507，它是从土壤样品中分离所得，所述菌株于2003年7月7日在位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M203059。
本发明所述的一种杀菌剂万隆霉素，其特征是，它的有效成分的分子式为：C53H67N13O13S2，分子量为：1157，化学结构式为：
本发明所述地一种杀菌剂万隆霉素，适用于防治细菌和卵菌病害，包括青枯病、水稻细菌性条斑病、水稻白叶枯病、细菌性软腐病以及植物疫病、霜霉病、霜疫霉病、晚疫病，对镰刀菌引起的病害以及枯草杆菌和大肠杆菌有效。
本发明所述一种杀菌剂万隆霉素，可以通过下述方法制备：
第一步 将GAAS2507的培养物接种入营养培养基，在32℃和250rpm的振荡下生长36小时；
第二步 取成熟的第一阶段营养培养物接种营养培养基，取得二次营养培养物，在32℃和300rpm条件下培养48小时，将成熟的菌种发酵培养，在32℃和300rpm下保持培养4天；可用合适的溶剂提取成熟的发酵物，并通过色谱分离而获得代谢物。
本发明所述菌株GAAS2507的培养物特征如下表：
表1培养基 基丝 气丝 色素高氏一号 烟灰色 无色或黄白色 无察氏蔗糖 灰白色 无色或微灰 无克氏一号 浅烟灰色 无色至黄白色 无葡萄糖天冬素 白色(少量) 无 无甘油天冬素 几乎无 浅棕色 鹦鹉冠黄马铃薯块 浅灰或烟灰 烟灰 黑褐色燕麦粉 深灰色 无或灰白 无酪氨酸 无 浅灰 褐色无机盐淀粉 浅灰 无 无葡萄糖酵母 烟灰 白至黄白 无苹果酸钙 灰白 灰白 茉莉黄
本发明所述菌株GAAS2507的形态特征为：2507产生菌的孢子丝为松散螺旋形，孢子表面光滑。在高氏一号培养基上，其气丝呈烟灰色，基丝无色至黄折色，不产色素。在形态、培养特征和生理生化特性上与灰色变异链霉菌相似，修正又存在显著的差异，因此定名为灰色变异链霉菌万隆亚种(Streptomyces griseovariabilis subsp.Bandungensis n.subsp.)。
本发明所述菌株GAAS2507的生理特征为：明胶液化可疑；牛奶凝固且强烈胨化；水解淀粉能力较强；纤维素上不生长；不产生H2S。可利用葡萄糖、乳糖、棉子糖、麦芽糖、甘露醇、肌醇、鼠李糖、甘露糖、半乳糖；不利用D-果糖、山梨糖、阿拉伯糖、木糖、蔗糖、菊糖、甜醇、山梨醇。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
1.本发明的制备工艺简单、易操作、易制备。
2.本发明的杀菌剂万隆霉素对卵菌剂细菌等植物病害防治效果好，比常规药剂用量少，可以克服植物病害对常规农药的抗药性。
3.本发明的杀菌剂使用安全，不污染环境，是一种无公害的生物农药。
附图说明
图1是本发明菌株GAAS2507的形态示意图；
图2是本发明实施例四中被万隆霉素抑制的节瓜枯萎病菌菌落示意图。
本发明菌株Streptomyces griseovariabilis subsp.Bandungensisn.subsp.GAAS2507于2003年7月7日在位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M203059。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明做进一步地详细描述。
实施例一
通过在发酵培养基中培养菌株GAAS2507而制备杀菌剂万隆霉素。将1ml的冷冻的GAAS2507营养培养基融化，接种入500ml三角瓶内的100ml营养培养基，在32℃和250rpm的振荡下生长48小时。
表2 营养培养基成分
成分名称 含量(％)
葡萄糖 3
玉米浆 1.5
黄豆饼粉 1.5
淀粉 1
NaCl 0.5
(NH4)2SO4 0.5
CaCO3 0.5
pH 7.2
取3500ml成熟的第一阶段营养培养物用于接种50L搅拌式发酵罐的35L的营养培养基的二次营养培养物，在32℃和300rpm条件下培养48小时，将成熟的菌种接种到500L的搅拌式发酵罐中，发酵培养在32℃、300rpm下保持培养4天。可用合适的溶剂提取成熟的发酵物，并通过色谱分离而获得代谢物——杀菌剂万隆霉素。
实施例二
本发明可通过测试发酵液的提取物而在发酵期间跟踪杀菌剂万隆霉素的制备，例如通过生物测定法分析发酵液提取物。
发酵完毕，来自500L的发酵物，用板框压滤的方法分离获取菌丝，将菌丝用1∶2的丙酮溶液浸取10小时，将浸取液浓缩去丙酮，再用乙酸乙酯萃取有效物，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩获取油状物，提取浓缩液拌硅胶过柱，用乙酸乙酯、石油醚多次硅胶柱层析和浓缩，获得油状物质纯品。
实施例三
本发明所述的一种杀菌剂万隆霉素适用于防治细菌和卵菌病害，包括在田间使用病菌抑制量。通过杀菌剂万隆霉素来防治植物病害的效果与使用次数和使用方法有关，同时与被防治的病害的种有关。本发明是通过中国发明专利申请(专利申请号为99117029.6)公开的技术方案来实现使用制剂的。
将杀菌剂万隆霉素丙酮溶液用无菌水2倍稀释，采用双层琼脂管碟法测定对枯草杆菌和细菌性条斑病菌的抑制曲线和MIC。使用结果如表3、4所示。
表3 杀菌剂万隆霉素对枯草杆菌的抑制作用
浓度 抑菌圈半径(mm)
(μg/ml) 1 2 3 4 平均*
100 8.25 8.50 10.50 11.50 9.688±0.786A
50 8.00 8.25 9.75 9.75 8.938±40.472A
25 7.10 7.10 8.00 8.75 7.738±0.399B
12.5 6.40 6.50 7.00 7.75 6.913±0.308BC
6.25 5.50 6.25 6.10 6.40 6.063±0.197C
3.125 4.75 5.00 5.00 5.10 4.963±0.075D
1.563 4.25 4.40 4.25 5.50 4.600±0.302D
0.781 3.25 3.50 3.50 3.90 3.538±0.134E
0.391 2.75 2.90 2.75 3.00 2.850±0.061E
0.195 2.50 2.50 2.50 2.50 2.500±0.000E
CK(无菌水) 2.50 2.50 2.50 2.50 2.500±0.000E
回归方程** Y＝0.0288484890X-0.4820479049
*：经SAS统计软件DUNCAN氏多重比较，R＝0.938006，P＝0.0001。
**：根据杀菌剂万隆霉素的浓度对数Y和抑菌圈半径的平方值X，用SAS统计软件求得回归方程(R＝0.940579，P＝0.0001)。
表4 杀菌剂万隆霉素对水稻细菌性条斑病菌的抑制作用
浓度(μg/ml) 抑菌圈半径(mm)
1 2 3 4 5 平均*
50 7.25 7.25 6.50 7.75 8.00 7.35±0.257A
25 7.00 4.75 5.50 6.50 7.25 6.20±0.470B
12.5 4.50 5.00 4.25 4.50 4.50 4.55±0.122C
6.25 5.25 4.75 4.00 3.50 4.00 4.30±0.310C
3.125 3.50 3.50 3.50 3.25 3.25 3.40±0.061D
1.563 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00±0D
0.781 2.75 2.75 2.75 2.75 2.75 12.75±0D
CK(无菌水)
回归方程**Y＝0.0348525860X-0.0003572797
*：经SAS统计软件DUNCAN氏多重比较，R＝0.916090，P＝0.0001。
**：根据杀菌剂万隆霉素的浓度对数Y和抑菌圈半径的平方值X，用SAS统计软件求得回归方程(R＝0.857593，P＝0.0027)。
实施例四
采用培养基液体稀释法和接种琼脂块法测定黄瓜疫病菌、节瓜枯萎病菌、水稻稻瘟病菌和芒果炭蛆病菌的抑制曲线和LD50，使用结果如表5所示。
实验结果表明，杀菌剂万隆霉素对黄瓜疫病菌菌丝生长有明显的抑制作用(见表5)，当2507A1的浓度为50μg/ml时，黄瓜疫病菌菌丝生长被完全抑制。
通过回归方程求得杀菌剂万隆霉素对黄瓜疫病菌菌丝生长的LD50＝1.256μg/ml。
表5 杀菌剂万隆霉素对黄瓜疫病菌生长的抑制作用效果
浓度 菌丝生长直径* 菌丝生长抑制率 抑菌工作几率值
(μg/ml) (42hrmm (％)
50 0±0F 100 -
25 8.7±0.539E 78.7 5.7961
12.5 12.5±0.880D 69.4 5.5072
6.25 14.0±0.158CD 65.8 5.4070
3.125 14.5±0.447C 64.5 5.3719
1.563 16.0±1.007C 60.9 5.2767
0.781 26.0±0.447B 36.4 4.6505
CK(无菌水) 40.9±0.843A -
回归方程** Y＝0.612791330X+4.939325911
*：经SAS统计软件DUNCAN氏多重比较，R＝0.987862，P＝0.0001。
**：根据抑菌工作几率值Y和杀菌剂万隆霉素的浓度对数X(后6组数据)，用SAS统计软件求得回归方程(R＝0.826143，P＝0.0121)。
结果表明，杀菌剂万隆霉素对节瓜枯萎病菌菌丝生长也有较好的抑制作用(见表6，图1)。根据回归方程求得杀菌剂万隆霉素对节瓜枯萎病菌菌丝生长的LD50＝20.570μg/ml。
表6 杀菌剂万隆霉素对节瓜枯萎病菌生长的抑制作用效果
浓度 菌丝生长直径* 菌丝生长抑制率 抑菌工作几率值
(μg/ml) (60hrmm) (％)
50 15.6±1.317F 56.7 5.1687
25 16.7±0.436F 53.6 5.0904
12.5 19.8±1.114E 45.0 4.8743
6.25 23.4±0.030D 35.0 4.6147
3.125 24.6±0.678D 31.7 4.5239
1.563 27.8±1.800C 22.8 4.2546
0.781 32.8±0.200B 8.9 3.6531
0.391 34.3±0.200AB 4.7 3.3253
0.195 33.4±0.748AB 7.2 3.5462
CK(无菌水) 36.0±1.049A —
回归方程** Y＝0.807660378X+3.939351467
*：经SAS统计软件DUNCAN氏多重比较，R＝0.939921，P＝0.0001。
**：根据抑菌工作几率值Y和杀菌剂万隆霉素的浓度对数X，用SAS统计软件求得回归方程(R＝0.937433，P＝0.0001)。
从试验结果看出，本发明所述杀菌剂万隆霉素效果很好，不但对植物细菌性病害防治效果很好，而且对植物卵菌病害效果也很好，对环境没有污染。同时，可以克服植物病菌对药剂的抗药性。作为植物病害的防治剂，将有利于农业的稳产和高产，从而产生较大的经济和社会效益。
如上所述，即可较好地实现本发明。