一种利用转移编码序列在鸟类中生产抗体的方法 本发明涉及在鸟类中生产抗体的方法，具体涉及利用编码抗原的序列在鸟类中生产抗体的方法。
根据基于表达序列标记(ESTs)的数据库，人类基因组包含有大约6-8万个基因，散布于30亿个染色体DNA的核苷酸中，现在已经完成了整个人类基因组序列测定的草图，完整的序列将在近一两年内完成。其他动植物以及微生物的基因序列也在不断的测定之中，因此DNA序列信息库将越来越庞大。但DNA序列信息只是提供了细胞应用其基因所有可能方式，是一个静态的数据库。这一巨大数量的静态DNA序列信息必须与动态基因产物及其相互关系的信息联系在一起，才能对生物基本机制有一充分的真正的了解，并最终将这一了解应用于不同的领域之中去。
Proteome这一词第一次出现是在1995年7月，被定义为“基因组研究的蛋白质功能方面的补充(Wasinger et al.，Electrophoresis，1995，16：1090-1094)。蛋白功能组学的目标是研究基因的功能，是对基因DNA序列进行补充和完善，其提供的主要信息是蛋白在哪里表达，表达量如何以及在何种条件下表达等。它可帮助了解某些疾病如何导致细胞内蛋白质功能链的改变，从而帮助发现新地潜在药物靶点。另外通过了解先导化合物如何影响蛋白质相互作用的信息可证实进攻某些靶点的特殊药物先导化合物的有效性(Persidis，Nature Biotechnology，1998，16：100-101)。因此，除了解答关于一个细胞在任何时段所处的分子生物学状态外，蛋白功能学还可通过自动分析临床相关的分子现象来加快新药物的发现。
与基因组研究的迅速发展相比，蛋白功能学的研究相对滞后。例如大多数已知人类DNA序列的蛋白质的特征，包括其存在，数量，细胞定位，不同组织及发育过程的特异性表达等都没有确定下来。虽然通过大板的双向电泳可以区分出10000个明显的蛋白质和多肽点，但超过95％的点无法进行蛋白质序列测定，因为它们的量少于目前灵敏度最高的Edman序列分析技术的下限(Persidis，Nature Biotechnology，1998，16：393-394)。
特异性抗体是蛋白功能学研究最有力的工具，也是发现基因功能第一把钥匙。仅通过特异性抗体就可以回答蛋白功能学研究所要解决的蛋白存在、数量、细胞定位、不同组织及发育过程的特异性表达等主要问题。如果没有特异性抗体，蛋白功能学研究的快速发展将是不可能的。随着蛋白抗体芯片技术以及与之相配套的自动化技术建立和不断完善，蛋白功能学研究将加速发展，同时对于抗体的需求也必将越来越大。
抗体生产的传统方法是用蛋白质或多肽疫苗注射到哺乳动物如小鼠、兔子、大鼠或羊等动物中。其基本过程是直接从人、动植物或微生物中提取纯化蛋白质或将基因克隆到原核表达载体中进行蛋白质的表达、体外纯化、此方法耗时多，费用高，且得到的蛋白纯度也有限。另外，许多的蛋白质在人、动植物或微生物体内含量极微，现在的技术无法进行纯化或在原核表达系统中得不到表达。因此传统技术生产抗体还存在许多蛋白无法生产出抗体这一重大缺陷。
考虑到大规模的蛋白功能学研究，即要研究大量的已知DNA序列的蛋白质功能，用传统的蛋白质或多肽疫苗的方法来生产抗体，从费用、时间以及技术上来讲，都是不可行的。
鉴于生物界对于蛋白功能学研究的极大兴趣以及抗体在蛋白功能学研究中的重要性，目前急需一种快速、经济且能通过基因直接生产抗体的方法，以满足大规模的蛋白功能学研究的需求。
现已有一个国际专利(WO 00/29444)，提供了一种在鸟类中生产抗体的方法：通过转运一个连在启动子上的编码抗原的DNA序列到鸟类中，在鸟类中直接表达抗原，表达抗原的数量足够诱导产生针对于该抗原的可检测的抗体，然后从鸟类中回收抗体。该发明中提到的将DNA转运到鸟类中的方法，包括：先将DNA序列转入到鸟类细胞中，然后再将含有DNA序列的上述细胞转到鸟类合适的组织中；或者通过直接注射、基因枪或者脂质介导技术将DNA直接导入鸟类肌肉、皮肤等组织。
显然，先将DNA转入细胞，再将含DNA序列的细胞转入组织的方法过于复杂、耗时，不利于大规模抗体生产。该专利提到的直接将DNA导入组织的方法虽然简单，但也有不足之处，如表达抗原的量太少，不足以在动物体内产生高滴度的抗体，操作要求高等。
该专利首选的直接转移DNA的方法是通过基因枪，用基因枪的方法来转移DNA存在一些缺点：1)基因枪本身造价高；2)基因枪微弹及弹筒塑料管价格高；3)基因枪微弹的制作过程复杂，不易操作；4)基因枪微弹的保存以及基因枪操作时对环境的要求高；5)基因枪法对动物的年龄及表皮的角质层的厚度要求高。由于以上原因，利用基因枪法作为转移DNA的方法用于大规模的抗体生产时出现一些困难，主要是成本高和对操作人员的素质要求高。
本发明目的是提供一种转移编码抗原的序列到鸟类体内生产抗体的方法，该方法操作更为简单，并能产生高滴度的抗体。
本发明提供了一种在鸟类中生产抗体的方法，包括：转移含该抗原编码序列的DNA或mRNA到鸟类组织内，然后辅以电穿孔法；鸟类体内表达该抗原，抗原数量是以诱导产生针对该抗原的可检测的抗体产品；从上述鸟类中回收上述抗体。其中鸟类优选鸡、火鸡、鸭、鹅，尤其是鸡。组织可以是肌肉、皮肤和粘膜及腺体、淋巴、结缔组织等可操作的部位，优选肌肉组织。
本发明在鸟类中生产抗体方法的进一步结合图1详述如下：
(1)用DNA替代蛋白质作为抗原注射
将一个编码抗原的DNA序列连在启动子上。它可以直接在鸟类中表达此抗原。具体来讲，这个被转运的DNA序列是一个质粒。
被使用的启动子可以是鸟类自身的内源性启动子。也可以是外源性的启动子，如病毒启动子或其他真核启动子，它也可在鸟类中直接表达抗原。较好的病毒启动子是RSV LTR，MPSV LTR，SV40 IEP，CMV IEP，金属硫蛋白启动子(美国专利5,703,055，1997年)或脾坏死病毒LTR(SNV LTR)(美国专利5,703,055，1997年)。
用于免疫鸟类的DNA序列中还包含有一段序列，它可以在鸟类体内指导编码的抗原直接分泌。这个直接分泌指导序列可以是一个引导序列，该引导序列可以是鸟类内源性的引导序列，如鸡IgY的VH1的引导序列(Kabat etal.，Sequences of Proteins of Immunolloguical Interests，1983，U.S.Department ofHealth and Human Services，Washington，D.C.)，鸡SPARC的引导序列(GenBank Accession No.L24906；Bassuk et al.，Eur.J.Biochem.，1993，218(1)：117-127)，鸡血清白蛋白的引导序列(Gen Bank Accession No.V00381和J00806；Hache et al.，J.Biol.Chem.，1983，258(7)：4556-4564)和鸡组织纤溶酶原激活剂的引导序列(Gen Bank Accession No.U31988)。虽然内源性鸟类引导序列是首选，但在本发明中其他引导序列也可以用。除引导序列外，任何已知的膜蛋白的细胞膜指导序列都可以用。例如这些细胞膜指导序列包括，而又不限于IL-1、CD4、CD34和MHC的细胞膜指导序列。
(2)DNA肌内注射入鸟类
将上述带有启动子的DNA经纯化后，以质粒DNA作为抗原直接注射到鸟类(如鸡)组织内，可以是肌肉，也可以是皮肤或鸡的其他部位，最优的部位为腿部或胸部肌肉。一般使用微量进样器进行注射，一次注射约50-200μg，体积不大于100μl。质粒也可以与其他辅助质粒转入细胞的试剂混合后注射，辅助质粒转入细胞的试剂包括各种脂质体、各种钙盐以及DEAE-dextrant等，但不限于这些试剂。
(3)用电穿孔法辅助DNA转移入组织(肌肉)细胞以提高基因表达水平。电穿孔法可按以下方法进行：在注射质粒DNA后约10-90秒，在注射点两侧加上100-300V/cm的电脉冲刺激。每次10-100毫秒，间隔0.5-2秒，刺激2-10次，反转电极后再刺激同样的次数。
(4)转移入鸟类的DNA直接表达抗原的数量足以诱导产生针对该抗原的可检测抗体
转移入鸟类组织中的DNA在肌内表达后，由于是外源蛋白，因此可在体内诱发抗体的产生。抗体的产生量主要用ELISA法进行检测。第一次注射前收集1-2个禽蛋作为对照，第一次注射后两周进行一次DNA的加强，以提高抗体的产量，一般第三周时的禽蛋中就可以用ELISA法检测到特异抗体的出现。四周后即开始达到第一个高峰。根据ELISA法检测的结果收集适量的禽蛋，在4℃度冰箱中保存。
(5)从鸟类中回收抗体
收集到足够数量的禽蛋后，从禽蛋的蛋黄中提取抗体，一般使用PEG(聚乙二醇)沉淀法，也可用硫酸胺沉淀法、辛酸沉淀法等提取。操作简单，得到的抗体的纯度在90％以上。
本发明的优点：本发明采用的组织直接注射辅以电穿孔的方法，不仅操作简单易于掌握、成本低廉，尤其大大提高DNA的转导效率，在鸟类内表达量高，足以诱导产生针对该抗原的可检测的抗体，尤其适于在大规模抗体生产中应用。
本发明提供的方法，与先将DNA转入到鸟类细胞中，然后将含有DNA序列的上述细胞再转移到鸟类合适组织的方法相比，具有操作简单、易于掌握，且成功率高的优点。
本发明方法与WO 00/29444专利中用基因枪转移DNA的方法相比有以下优点：
(1)仪器的成本低：不必购买基因枪、金粉、塑料子弹筒、子弹制备器等昂贵的设备，从而降低了仪器的成本；
(2)操作简便：由于是进行肌内直接注射，因此操作简便，而基因枪的子弹制备及射击的操作都较为复杂；
(3)对环境要求低：在正常的环境下都可以进行，而基因枪因为微弹不能受潮，因此要求环境湿度不能过大；
(4)对动物要求低：不同年龄不同角质层厚度的动物都可以使用，从而延长了动物的使用时间；
(5)成功率高：由于组织注射对操作、环境、工作人员以及动物的要求都较低，因此其生产抗体的成功率高；
(6)由于以上原因，此方法更利用大规模化生产抗体。
本发明方法与直接肌肉注射质粒DNA相比则有质粒DNA转入率高，从而质粒DNA在体内表达的抗原量大大提高，产生的抗体的滴度相应大大提高。如表1所示，比较直接注射质粒pS & DV-CD34到鸡肌肉中与注射后加上电穿孔法辅助所产生的抗CD34抗体滴度，可见采用电穿孔法辅助后，用Elisa方法检测，抗体滴度从800倍提高到3000倍；用Western blot方法检测，抗体滴度从1500倍提高到6000倍。(注射加上电穿孔的具体方法见实施例1；直接注射法则是将实施例1中的第(3)步减去。)
表1 直接注射质粒pS & DV-CD34到鸡肌肉中与注射后加上电击辅助所产生的抗CD34抗体滴度的比较：检测方法 Elisa Western blot转染方法直接注射注射加上电穿孔直接注射注射加上电穿孔抗体滴度800倍3000倍1500倍6000倍
下面通过附图和实施例进一步阐明本发明，但并不限制本发明的范围。
图1是本发明是利用肌肉注射DNA在鸟类中生产抗体方法的流程示意图。
图2是pS&DV-CD34及pS & DV-CAT双表达质粒的0.8％琼脂糖凝胶电泳图。
图中1：Qiagen-tip 500提取的pS & DV-CAT质粒电泳图，上样量350ng
2：Qiagen-tip 500提取的pS & DV-CD34质粒电泳图，上样量200ng
3：TakaRa公司λ/EcoT14I分子量标准。
图3是纯化后抗CD34抗体及抗CAT抗体(IgY)的SDS-PAGE电泳图。
图4是抗CD34抗体的Western blot(蛋白质印迹)鉴定结果图。
图中A-SDS-PAGE胶 B-Western膜
1为诱导前，2为诱导后
图5是抗CAT抗体的Western blot(蛋白质印迹)鉴定结果图。
图中A-SDS-PAGE胶 B-Western膜
1为诱导前，2为诱导后
实施例1 抗CD34抗体的生产(电穿孔法辅助)
(1)按照人的CD34基因(human hematopoietic stem cell surface antigen，由美国Genway公司提供)序列设计PCR引物，扩增CD34基因原451-1122bp片段。5′和3′引物分别设计EcoR I和Hind III位点，二个引物为：(上游引物：5’GGAATTC TCA TCT_TCT CCT ATC CTA AGT GA3’下游引物：5’CCCAAGCT TCA CAA TTC GGT ATC AGC C3’)，
然后进行PCR扩增，扩增35个周期，条件为(94度45秒；55度1分钟；72度1分钟。)，得到人的CD34基因C端片段。
(2)将这一PCR产物通过常规的基因重组方法(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验手册》)克隆到双表达质粒pS & DV-IgY-S的EcoR I和HindIII位点(US Provisional Application Serial No：60/108487，Nov.16，1998)，并EcoR I和Hind III进行双酶切鉴定，从而得到CD34基因的双表达质粒pS &DV-CD34。将该双表达质粒pS & DV-C34转化到大肠肝菌DH5a中，挑选单菌落转接到500ml LB培养液中，37℃培养过夜。用Qiagen公司的Qiagen-tip 500试剂盒进行质粒的提取(提取方法参照试剂盒说明书)。用紫外分光光度计进行质粒的定量，并用PBS将质料稀释成1μg/μl，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。结果见图2中的第2泳道，上样量200ng。
(3)每次用微量进样器在鸡的大腿外侧注射50μg(1μg/μl)质粒DNA，每次注射4个点，注射深度为0.5cm。在注射质粒DNA后约50秒，在注射点两侧加上200V/cm的电脉冲刺激。每次10毫秒，间隔1秒，每个点刺激6次，反转电极后再刺激同样的次数。14天后，再重复一次注射进行加强。再过14天。同时将免疫期三周后鸡所生的蛋收集，并于4℃保存。
(4)将双表达质粒pS & DV-CD34转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)作为诱导剂进行诱导表达，将诱导前和诱导后菌体保留。
(5)将免疫后21-23天所收的三个蛋用PEG沉淀法提取抗体，其步骤为：将蛋黄用PBS稀释4倍后，加入PEG6000至5％，10000g离心除脂类及部分蛋白杂质。然后加入PEG6000至12％，离心收集沉淀。将沉淀用PBS溶解后，得到抗CD34抗体。然后进行SDS-PAGE鉴定，电泳结果见图3。由图3可知，沉淀中抗CD34抗体的纯度在90％以上。
(6)将纯化得到的抗CD34抗体作一抗用ELISA法测定其免疫活性(参见Ed Harlow等，《Antibodies-A Iaboratory Manual》)。以注射前的鸡蛋作为对照，以(4)中诱导后的菌体为抗原，用HRP(辣根过氧化物酶)标记的兔抗鸡IgY作为二抗，检测结果在405nm处用酶联仪进行读数。结果见表2。
表2 抗CD34抗体的ELISA鉴定结果 OD405 稀释度 抗CD34抗体 对照 1∶800 0.45 0.01 1∶2000 0.30 0.01
(7)将(4)中诱导前和诱导后样品进行SDS-PAGE电泳，各上两份样品，一份电泳完毕后，用考马斯亮蓝进行染色，结果见图(4)中A，另一份用电转移仪转到PVDF膜上，以纯化的抗CD34抗体为一抗(原抗体稀释6000倍)，HRP标记的兔抗鸡IgY作为二抗，用DAB(二氨基联苯胺)为底物进行酶活性显色进行Western blot检测，检测结果见图(4)中B。
实施例2 抗CAT抗体的生产
(1)按照CAT基因(chloramphenicol acetyltransferase，由美国Genway公司提供)序列设计PCR引物，5′和3′引物分别设计Pac I和Not I位点，二个引物为：(上游引物：5’TTA ATT AAG GAG AAA AAA ATC ACT GGATAT AC3’下游引物：5’GC GGC CGC TTA CGC CCC GCC CTG 3’)。
然后进行PCR扩增，扩增35个周期，条件为(94度45秒；55度1分钟；72度1分钟。)，得到CAT全长基因。
(2)将这一PCR产物通过常规的基因重组方法，(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验手册》)克隆到双表达质粒pS & DV-IgY-S的Pac I和Not I位点(US Provisional Application Serial No：60/108487，Nov.16，1998)，并EcoR I和Hind III进行双酶切鉴定，从而得到CAT基因的双表达质粒pS&DV-CAT。将该双表达质粒pS & DV-CAT转化到大肠杆菌DH5a中，挑选单菌落转接到500ml LB培养液中，37℃培养过夜。用Qiagen公司的Qiagen-tip 500试剂盒进行质粒的提取(提取方法参照试剂盒说明书)。用紫外分光光度计进行质粒的定量，并用PBS将质料稀释成1μg/μl，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。结果见图2中的第1泳道，上样量350ng。
(3)每次用微量进样器在鸡的大腿外侧注射50μg(1μg/μl)质粒DNA，每次注射2个点，注射深度为0.5cm。14天后，再重复一次注射进行加强。再过14天。同时将免疫期三周后鸡所生的蛋收集，并于4℃保存。
(4)将双表达质粒pS & DV-CAT转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，用IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)作为诱导剂进行诱导表达，将诱导前和诱导后菌体保留。
(5)将免疫后21-23天所收的三个蛋用PEG沉淀法提取抗体，其步骤为：将蛋黄用PBS稀释4倍后，加入PEG6000至5％，10000g离心除脂类及部分蛋白杂质。然后加入PEG6000或PEG8000至12％，离心收集沉淀。将沉淀用PBS溶解后，进行SDS-PAGE鉴定，电泳结果见图3。由图3可知，沉淀中抗CAT抗体的纯度在90％以上。
(6)将纯化得到的抗CAT抗体作一抗，用ELISA法测定其免疫活性(参见Ed Harlow等，《Antibodies-A laboratory Manual》)。以注射前的鸡蛋作为对照，以(4)中诱导后的菌体为抗原，用HRP(辣根过氧化物酶)标记的兔抗鸡IgY作为二抗，检测结果在405nm处用酶联仪进行读数。结果见表3。
表3 抗CAT抗体的ELISA检测结果 OD405 稀释度 抗CAT抗体 对照 1∶800 0.1 0.01
(7)将(4)中诱导前和诱导后样品进行SDS-PAGE电泳，各上两份样品，一份电泳完毕后，用考马斯亮蓝进行染色，结果见图(5)中A，另一份用电转移仪转到PVDF膜上，以纯化的抗CAT抗体为一抗(原抗体稀释2000倍)，HRP标记的兔抗鸡IgY作为二抗，用DAB(二氨基联苯胺)为底物进行酶活性显色进行Western blot检测，检测结果见图(5)中B。