WISTAR大鼠胃肠ICC的分离培养方法.pdf

一种利用Wistar大鼠，分离培养胃肠Cajal间质细胞(简称ICC)的方法，包括四个步骤：a.Wistar大鼠胃肠肌肉组织块的制备；b.胃肠ICC的酶解、分离和培养；c.ICC的c－Kit免疫荧光标记；d.采用倒置显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察并采集图像，对分离培养的细胞进行确认。具有以下特点：①选用Wistar大鼠易得到，易饲养；②采用普通酶解法分离ICC，方法简单；③ICC的培养无须特殊设备和制剂；④分离、培养的ICC特征明显，图象清晰，形态稳定。

1.  一种Wistar大鼠胃肠Cajal间质细胞(简称ICC)的分离培养方法，其特征是从Wistar大鼠胃肠组织中分离、培养Cajal间质细胞；本方法主要包括四个步骤：a.Wistar大鼠胃肠肌肉组织块的制备；b.胃肠ICC的酶解、分离和培养；c.ICC的c-Kit免疫荧光标记；d.采用倒置显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察并采集图像，对分离培养的细胞进行确认。

2.  根据权利要求1所述的Cajal间质细胞的分离培养方法，其特征在于：具体分离培养方法为：a.胃肠肌肉组织标本采集：取Wistar大鼠胃、小肠或结肠置于冷KRB液(Krebs-Ringer bicarbonate solution：Na⁺ 137.4mMOL，K⁺5.9mMOL，Ca²⁺2.5mMOL，Mg²⁺ 1.2mMOL，Cl^-134mMOL，HCO₃^-15.5mMOL，H₂PO₄^-1.2mMOL，葡萄糖11.5mMOL，37.5±0.5℃，pH7.3-7.4，97％O₂-3％CO₂冒泡)中。小心去除系膜，沿小弯缘剪开胃肠，并洗净内容物后，钉固于蜡板上，锐性去除粘膜和粘膜下层，然后将分离出的肌肉组织剪成约1-2mm³小块；b.胃肠ICC的酶解、分离和培养：将新鲜分离的肌条小块在酶解液中37℃孵育60分钟，酶解液组成为：DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’smedium，)中含有1.0mg/ml II型胶原酶(Sigma公司，USA)，并轻微搅拌，30分钟后更换一次酶解液，吸出的上清酶液置于离心管内4℃保存；酶解消化结束后，将组织和前面的上清液一同经过100目筛网过滤，收集滤液，1000转/分离心10分钟；弃上清，加入含20％胎牛血清的SMGM(Smooth MuscleGrowth Medium)，吹打沉淀，使细胞悬浮，混悬液置于培养瓶中，37℃贴壁1小时后，再加入含20％胎牛血清的SMGM、2％抗菌素(含有：青霉素G钠200IU/ml，硫酸链霉素200mg/ml，两性霉素B 0.5mg/ml)、2mMOL/L谷氨酰氨、5ng/ml干细胞因子(stem cell factor from mouse，SCF)，吹打均匀，轻轻吸取出上清，平均加到带有圆形盖玻片的无菌六孔培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育48小时后，培养基换为含有SCF的SMGM，并加入2％抗菌素和2mMOL/L谷氨酰氨，培养基隔日更换；c.ICC的c-Kit免疫荧光标记：取贴壁良好的细胞玻片，弃去培养基，用4％多聚甲醛(PBS稀释)溶液，于4℃固定30分钟后，标本在PBS液(0.01M、pH7.4)中分三次冲洗共45分钟(3×15分钟)，然后在含10％(w/v)山羊血清的PBS液中室温孵育60分钟，以减少非特异性抗体的结合；标本中加入兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆IgG抗体(c-19，Santa Cruz，Biotech，California，USA，1∶200，PBS稀释)于37℃温箱孵育一小时，并在4℃冰箱孵育过夜后，用PBS液分三次冲洗共15分钟(3×5分钟)，加入次级抗体FITC结合山羊抗兔IgG抗体(1∶50，PBS稀释)于37℃温箱避光孵育60分钟；阴性对照不加一抗，只用PBS，余操作步骤相同；d.采用倒置显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察并采集图像，对分离培养的细胞进行确认。

Wistar大鼠胃肠ICC的分离培养方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是一种Wistar大鼠胃肠Cajal间质细胞(简称ICC)分离培养方法。
背景技术
一百多年前，西班牙科学家Cajal首先在胃肠道中发现一类小的梭形或星形细胞，并对其进行了详细描述，这些细胞具有明显的核及多个突起，细胞间突起相互连接形成网络，后来该细胞被命名为Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，简称ICC)。ICC是胃肠道神经系统的一种非神经但与神经有关的特殊类型的间质细胞。研究表明，ICC在控制胃肠道运动中起着重要的作用，是胃肠慢波活动的起搏器和传导者。近十年来，ICC的作用逐渐被阐明。其功能主要有三个：①胃肠道慢波活动的起搏细胞；②有利于推进胃肠电活动的传播；③介导神经递质。ICC还具有产生一氧化氮(nitric oxide，NO)和放大抑制性神经递质等作用。胃肠道的正常运动依赖于肠神经系统(enteric nervous system，ENS)、平滑肌细胞和ICC。模型动物或人类ICC缺乏或分布异常可引起多种胃肠运动障碍性疾病。关于ICC起搏电流发生的确切机制尚存在不少争议。不同类型ICC的确切功能及它们之间的相互联系，ICC对体内胃肠电活动和胃肠运动的影响尚不明确。目前体内、体外胃肠起搏尚处实验阶段，有待进一步探索治疗胃电节律紊乱综合症，如胃轻瘫、假性肠梗阻等胃肠功能紊乱等疾病的新方法。胃肠道具有消化食物、吸收营养等功能，人体能量的摄取有赖于胃肠道的运动、消化和吸收功能。胃肠道运动功能的好坏直接影响着人体的健康和疾病的康复。Cajal间质细胞对胃肠道运动的调节作用越来越受到人们的重视。ICC缺少或功能异常是否一定会引起临床一系列症状？ICC的减少是原发或继发？是持久性或一过性？什么因素可以引起ICC减少？ICC的异常分布可能是诊断疾病的一个有用指标。胃肠起搏和药物干扰ICC的异常功能可能为胃肠运动功能障碍疾病的治疗提供新的手段。ICC研究已成为当今消化病学的一个热点。急需采用简单易行的ICC分离和培养技术，为ICC的研究提供一个可靠的手段。目前国内外常用Balb/c小鼠来分离培养ICC，这种小鼠生活条件要求较高，分离和培养技术亦较复杂，严重制约了ICC的研究。
发明内容
本发明的目的在于，在成功分离Wistar大鼠胃肠平滑肌细胞的基础上，通过技术改进建立Wistar大鼠胃肠ICC的分离培养方法，以达到利用Wistar大鼠大量培养、分离ICC的目的。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种Wistar大鼠胃肠ICC的分离培养方法，是从Wistar大鼠胃肠组织中分离Cajal间质细胞；本方法主要包括四个步骤：a.Wistar大鼠胃肠肌肉组织块的制备；b.胃肠ICC的酶解、分离和培养；c.ICC的c-Kit免疫荧光标记；d.采用倒置显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察并采集图像，对分离培养的细胞进行确认；其具体方法为：a.胃肠肌肉组织标本采集：取Wistar大鼠胃、小肠或者结肠置于冷KRB液(Krebs-Ringer bicarbonate solution：Na⁺137.4mMOL，K⁺5.9mMOL，Ca²⁺2.5mMOL，Mg²⁺1.2mMOL，Cl^-134mMOL，HCO₃^-15.5mMOL，H₂PO₄^-1.2mMOL，葡萄糖11.5mMOL，37.5±0.5℃，pH7.3-7.4，97％O₂-3％CO₂冒泡)中。小心去除系膜，沿小弯缘剪开胃肠，并洗净内容物后，钉固于蜡板上，锐性去除粘膜和粘膜下层，然后将分离出的肌肉组织剪成约1-2mm³小块；b.胃肠ICC的酶解、分离和培养：将新鲜分离的肌条小块在酶解液中37℃孵育60分钟，酶解液组成为：DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，)中含有1.0mg/ml II型胶原酶(Sigma公司，USA)，并轻微搅拌，30分钟后更换一次酶解液，吸出的上清酶液置于离心管内4℃保存；酶解消化结束后，将组织和前面的上清液一同经过100目筛网过滤，收集滤液，1000转/分离心10分钟；弃上清，加入含20％胎牛血清的SMGM(Smooth Muscle GrowthMedium)，吹打沉淀，使细胞悬浮，混悬液置于培养瓶中，37℃贴壁1小时后，再加入含20％胎牛血清的SMGM、2％抗菌素(含有：青霉素G钠200IU/ml，硫酸链霉素200mg/ml，两性霉素B 0.5mg/ml)、2mMOL/L谷氨酰氨、5ng/ml干细胞因子(stem cell factor from mouse，SCF)，吹打均匀，轻轻吸取出上清，平均加到带有圆形盖玻片的无菌六孔培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育48小时后，培养基换为含有SCF的SMGM，并加入2％抗菌素和2mMOL/L谷氨酰氨，培养基隔日更换；c.ICC的c-Kit免疫荧光标记：取贴壁良好的细胞玻片，弃去培养基，用4％多聚甲醛(PBS稀释)溶液，于4℃固定30分钟后，标本在PBS液(0.01M、  pH7.4)中分三次冲洗共45分钟(3×15分钟)，然后在含10％(w/v)山羊血清的PBS液中室温孵育60分钟，以减少非特异性抗体的结合；标本中加入兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆IgG抗体(c-19，Santa Cruz，Biotech，California，USA，1∶200，PBS稀释)于37℃温箱孵育一小时，并在4℃冰箱孵育过夜后，用PBS液分三次冲洗共15分钟(3×5分钟)，加入次级抗体FITC结合山羊抗兔IgG抗体(1∶50，PBS稀释)于37℃温箱避光孵育60分钟；阴性对照不加一抗，只用PBS，余操作步骤相同d.采用倒置显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察并采集图像，对分离培养的细胞进行确认。
本发明所提供的Wistar大鼠胃肠Cajal间质细胞(ICC)的分离培养方法，选用很容易得到的Wistar大鼠，饲养容易，无须特殊生活条件，而且采用普通酶解法分离ICC，方法简单、易操作。ICC的培养不仅无须特殊设备和制剂，而且在显微镜下观察确认ICC的分离、培养过程时，特征明显，图象清晰，形态稳定。这种简单易行的ICC分离和培养技术可为ICC的研究提供一个可靠的保证。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
附图说明
图1.为培养3天后的ICC形态图(×200)。
图2.为培养5天后地ICC形态图(×100)。
图3.为培养7天后的ICC形态图(×100)。
图4.为培养9天后的ICC形态图(×200)。
图5.为培养9天后经c-Kit染色阳性的ICC形态图(×200)。
图6.为普通光镜下培养9天后ICC的形态图(×200)。
具体实施方式
实施例1.a.胃肠肌肉组织标本采集：取Wistar大鼠胃、小肠或者结肠置于冷KRB液(Krebs-Ringer bicarbonate solution：(mMOL)Na⁺137.4，K⁺5.9，Ca²⁺2.5，Mg²⁺1.2，Cl^-134，HCO₃^-15.5，H₂PO₄^-1.2，葡萄糖11.5，37.5±0.5℃，pH7.3-7.4，97％O₂-3％CO₂冒泡)中。小心去除系膜，沿小弯缘剪开胃肠，并洗净内容物后钉固于蜡板上，锐性去除粘膜和粘膜下层，然后将分离出的肌肉组织剪成约1-2mm³小块；b.胃肠ICC的酶解、分离和培养：将新鲜分离的肌条小块在酶解液中37℃孵育60分钟，其中酶解液组成为：DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，)，1.0mg/ml II型胶原酶。30分钟后更换一次酶解液，吸出的上清酶液置于离心管内4℃保存；酶解消化结束后，将组织和前面的上清液一同经过100目筛网过滤，收集滤液，1000转/分离心10分钟，弃上清，加入含20％胎牛血清的SMGM(Smooth MuscleGrowth Medium)，吹打沉淀，使细胞悬浮；混悬液置于培养瓶中，37℃贴壁1小时后，再加入含20％胎牛血清的SMGM、2％抗菌素、2mMOL/L谷氨酰氨、5ng/ml SCF(stem cell factor from mouse)，吹打均匀，轻轻吸取出上清，平均加到带有圆形盖玻片的无菌六孔培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育48小时后，培养基换为含有SCF的SMGM，并加入2％抗菌素和2mMOL/L谷氨酰氨，培养基隔日更换。其中2％抗菌素组成为：青霉素G钠200IU/ml，硫酸链霉素200mg/ml，两性霉素B 0.5mg/ml。c.ICC的c-Kit免疫荧光标记：取贴壁良好的细胞玻片，弃去培养基，用4％多聚甲醛(PBS稀释)溶液4℃固定30分钟后，标本在PBS液(0.01M、  pH7.4)中分三次冲洗共45分钟(3×15分钟)，然后在含10％(w/v)山羊血清的PBS液中室温孵育60分钟，以减少非特异性抗体的结合；标本中加入兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆IgG抗体(c-19，Santa Cruz，Biotech，California，USA，1∶200，PBS稀释)于37℃温箱孵育一小时，并在4℃冰箱孵育过夜后，用PBS液分三次冲洗共15分钟(3×5分钟)，加入次级抗体FITC结合山羊抗兔IgG抗体(1∶50，PBS稀释)于37℃温箱避光孵育60分钟；阴性对照不加一抗，只用PBS，余操作步骤相同d.采用倒置显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察并采集图像，对分离培养的细胞进行确认。
从图1可以看出：培养3天后的ICC(×200)，细胞胞体呈三角形，突起伸展；从图2可以看出：培养5天后的ICC(×100)，细胞突起伸出，周围有平滑肌细胞；从图3可以看出：培养7天后的ICC(×100)，细胞突起向不同方向伸出，相邻ICC突起间有连接；从图4可以看出：培养9天后的ICC(×200)，细胞突起向各方向伸出，与相邻ICC突起及邻近平滑肌细胞间有连接；从图5、6也可以看出：培养9天后ICC细胞间相互联系，突起交织，呈网络状。说明Cajal间质细胞(ICC)的分离、培养效果达到预期的效果。