小麦育性恢复基因Rf6的分子标记及其获得方法 一、技术领域
本发明小麦育性恢复基因Rf6的分子标记及其获得方法，提供了与T型小麦细胞质雄性不育育性恢复基因Rf6紧密连锁的共显性分子标记，属于作物育种学领域。专用于T型小麦雄性不育育性恢复系种质的创建、选育与鉴定。并可用于克隆恢复基因及其转基因育种。
二、技术背景
细胞质雄性不育(CMS)是一种母性遗传，它不能产生正常有功能的花粉但雌性生殖器官不受影响。位于细胞核内的育性恢复基因Rf可以恢复其育性。研究表明，育性恢复基因一般都为显性。CMS及其育性恢复系统在作物杂交种生产中发挥极大的作用。它一方面去除了手工去雄的繁琐性，另一方面保证了杂交种子的纯度。同时还是研究细胞核与细胞质互相作用的良好材料。杂交种生产的前提条件是具有良好农艺性状及育性恢复能力强的恢复系，所以创建优良的恢复系对杂交育种是至关重要的。虽然在水稻、玉米、油菜等作物中，杂交种生产应用的十分广泛。但是在小麦中，杂交育种发展较为缓慢，其重要原因在于缺乏优良的恢复系。
小麦T型细胞质雄性不育是应用较为广泛与深入的一种。其细胞质来源于提莫菲维小麦。迄今为止已经发现数个T型细胞质雄性不育的育性恢复基因，Rf6就是其中之一。Maetal(1991)利用附加小伞山羊草6U染色体的中国春附加二体与苏三杂交，创建四个可恢复T型细胞质不育系地易位恢复系。同时指出易位系2114在四个易位系中恢复能力最强。将位于小伞山羊草6U染色体上的恢复基因命名为Rf6(Ma.ZQ，Zhao YH，Liu DJ Incorporation ofrestoring gene from Aegilops umbellulata into wheat.Genome 34：727-732)。研究表明，在恢复能力最强的易位系2114中，小伞山羊草6U染色体易位于小麦染色体的片段中包含了恢复基因Rf6。2114具有较强的恢复能力，分别利用难恢复和易恢复的雄性不育系与之进行测交，结果发现恢复基因Rf6的恢复能力分别为82％和93.3％，且外显度高，是较理想的恢复基因。但是采用传统的育种方法利用该基因费时费力，而且由于育性易受环境的影响，表型鉴定有一定难度。因此通过鉴定恢复基因紧密连锁分子标记来辅助育种可以有效解决这一问题。
Ma et al利用RFLP将易位断裂点定在6A染色体的末端(Inheritance andchromosomal location of fertility restoring gene transferred fromAegilops umbellulata Zhuk to Triticum aestivum L Ma et al，Mol GenGenet 1995 247：351-357)。关荣霞等分别找到与Rf6连锁的一个RAPD(小麦T型雄性不育恢复基因的遗传分析及RAPD标记，农业生物技术学报，2001，9(2)：159-162)和两个ISSR(小麦T型细胞质雄性不育恢复基因Rf6的ISSR分析，中国农业科学，2002，35(11)1297-1301)标记，遗传距离为3.4cM，7.9cM和4.9cM。同时报道没有找到紧密连锁的SSR标记，并预测估计是由于图谱不饱和的原因。目前与Rf6连锁的分子标记包括RFLP，RAPD及ISSR，都为显性标记，即不能确定恢复基因是以纯合状态还是以杂合状态存在。而在恢复系的选育过程中需要知道恢复基因的存在状态，才可以方便的开展选育工作。目前还没有紧密连锁的共显性SSR标记报道。并且已知分子标记遗传距离最小的为3.4cM。
本实验所用材料N2114为2114的自交后代，是携带有位于小伞山羊草6U染色体易位片段上的Rf6基因的小麦小伞山羊草易位系，其细胞质为T型细胞质，因此，易位系的育性直接反映了Rf6恢复育性的能力。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是：提供与小麦育性恢复基因Rf6紧密连锁的分子标记，通过检测紧密连锁的分子标记，可以预测Rf6的存在与否及存在状态和小麦植株的育性，在苗期就可鉴定出携有恢复基因以及恢复基因以纯合或杂合状态存在的单株，加快T型小麦细胞质雄性不育恢复系的选育与选择进度。提高鉴定效率，鉴定方便，节约成本。并可用于克隆恢复基因及后续的恢复系品种鉴定。
技术方案
小麦育性恢复基因Rf6的分子标记，其特征在于：
用标记引物MAG218
左端引物序列为AGTCGTGCACCTCCATTTTGG
右端引物序列为CATTGGACATCGGAGACCTGAG
扩增小麦小伞山羊草育性恢复材料或品种DNA，获得的扩增片段为194bp，即为小麦育性恢复基因Rf6的分子标记MAG218标记，此标记片段在小麦小伞山羊草易位系N2114中，位于小伞山羊草6U染色体易位于小麦染色体的片段中，该小伞山羊草6U染色体的易位片段包含了Rf6基因，MAG218标记为共显性分子标记，利用Mapmaker Macintosh V 2.0测得与Rf6基因的遗传距离为1.9cM；
或者用标记引物gwm88
左端引物序列为CACTACAACTATGCGCTCGC
右端引物序列为TCCATTGGCTTCTCTCTCAA
扩增小麦小伞山羊草育性恢复材料或品种DNA，获得的扩增片段为75bp，即为小麦育性恢复基因Rf6的分子标记gwm88标记，此标记片段在小麦小伞山羊草易位系N2114中，位于小伞山羊草6U染色体易位于小麦染色体的片段中，该小伞山羊草6U染色体的易位片段包含了Rf6基因，gwm88标记为显性分子标记，利用Mapmaker Macintosh V 2.0测得与Rf6基因的遗传距离为1.9cM。
上述小麦育性恢复基因Rf6的分子标记，是通过以下方法获得的：
(一)N2114与苏三F2代的创建与表型鉴定：
(1)小麦小伞山羊草易位系N2114(♀)与小麦品种苏三(♂)进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2群体；
(2)F2代在抽穗期对各单株套袋自交以检测各单株的育性，环境为自然生长条件；
(二)F2代群体的分子标记分析
(3)用SDS法提取F2代群体各单株的DNA，应用简单重复序列标记SSR与BSA结合的方法进行多态性筛选，将完全可育与完全不育F2单株DNA等量混合，构成可育池(F池)与不育池(S池)。
(4)首先用654对SSR引物对N2114，CS，苏三及F、S池DNA多态性进行初步分析：
PCR反应体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl2 1.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶5单位/微升0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升；
SSR反应体系为DNA 94℃预变性3min后，94℃变性1min，60℃退火
1min，72℃延伸展1min，循环35次，最后72℃延伸10min；
(5)在PTC-225扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果：
选择在亲本间和F2代群体的F、S池间扩增出相同有多态型的引物为与Rf6连锁的候选分子标记5对，将这5对分子标记在F2代群体单株中扩增获取群体各单株的基因型资料；
(三)分子标记获得
根据连锁交换规律，利用扩增获得的F2代群体各单株基因型资料与田间鉴定获得的对应各单株的育性资料构建5对分子标记与N2114恢复基因Rf6的连锁图，所用软件为Mapmaker Macintosh V 2.0，获得了与Rf6最为紧密连锁的分子标记MAG218标记和gwm88标记，利用Mapmaker Macintosh V 2.0测得与Rf6基因的遗传距离为1.9cM。
有益效果
1.本发明在国际上首次获得了与恢复基因Rf6紧密连锁的分子标记。小麦基因组巨大，是水稻基因组的40倍，是小麦遗传育种研究的障碍。本发明利用654个SSR标记首次找到与恢复基因Rf6紧密连锁的分子标记MAG218标记和gwm88标记，为恢复基因Rf6快速准确地转入栽培小麦中应用取得了突破。可用于T型细胞质雄性不育恢复系的选育工作，使恢复基因快速准确地转入栽培小麦中。可加快恢复基因Rf6在杂种小麦育种中的利用，MAG218标记和gwm88标记在所有已知分子标记中与Rf6连锁最为紧密，遗传距离最小为1.9cM，同时MAG218也是唯一的共显性分子标记。
2.鉴定方便。SSR标记为共显性，具有检测方便、扩增稳定、简便等优点。用MAG218标记检测育性恢复基因Rf6，可以确定Rf6的存在与否以及存在状态，并预测小麦植株的育性，进而快速筛选携有Rf6的植株并用于恢复系的选育。同时利用分子标记进行实验室检测可以避免环境对品种的影响。
3.提高恢复系的选择鉴定效率，节约成本。在传统恢复系的选育中，首先要将具有恢复基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对后代群体单株与不育系测交以鉴定其育性恢复能力。因此需要进行大量杂交，育性的鉴定还必须等到下一代。另外，育性表型鉴定易受环境的影响，表型鉴定有一定的误差。因此恢复系选育不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测与恢复基因Rf6紧密连锁的分子标记，可以将与不育系测交和育性恢复力鉴定的工作减少到最低限度，并且在苗期就可鉴定出携有恢复基因Rf6的单株并确定其以纯合或杂合状态存在，从而淘汰非目标植株。因此，利用恢复基因Rf6的分子标记MAG218标记和gwm88标记进行选择，不仅节约育种成本同时大大提高恢复系的选择效率。
4.可用于克隆恢复基因Rf6研究。图位克隆恢复基因Rf6的前提在于获得与Rf6紧密连锁的分子标记。MAG218标记和gwm88标记是目前与Rf6最紧密连锁的分子标记。
四、附图说明
图1 MAG218标记和gwm88标记与T型细胞质雄性不育育性恢复基因Rf6的遗传连锁图，左边为染色体遗传连锁图，标记间的图距已用数据标出。rf为Rf6基因。
图2 MAG218扩增带型N2114，cs，su3为亲本，u为小伞山羊草。1-20为可育株，21-28为不育株。箭头所指为194bp特异扩增条带。
图3 gwm88扩增带型
N2114，cs，su3为亲本，u为小伞山羊草，17，65，15，18，59，20，86，87，92，95为不育株，其余为可育株。箭头所指为75bp特异扩增条带。
五、具体实施方式
N2114为2114的自交5代后代，经测交鉴定，是携带有位于小伞山羊草6U染色体易位片段上的Rf6基因的小麦小伞山羊草易位系，其细胞质为T型细胞质，因此，易位系的育性直接反映了Rf6恢复育性的能力。通过将Rf6的供体亲本N2114与小麦品种或称受体亲本杂交，对后代进行自交或回交，同时利用分子标记MAG218标记和gwm88标记选择含有Rf6的单株，就可以选育出含有恢复基因Rf6但遗传背景不同的雄性不育育性恢复系。在恢复系的选育过程中，由于采用了分子标记，对杂交中母本的细胞质无特殊要求。在传统选育方法中，如果细胞质是来源于普通小麦，从表型上我们就很难知道哪些单株携有恢复基因Rf6以及恢复基因存在状态。另外，在优质恢复系选育中常常需要将多个恢复基因转入到同一品系中，因而需要有特异的标记来追踪各个恢复基因。因此分子标记MAG218标记和gwm88标记的应用，可以大大节省恢复系选育的时间和劳力，并加强预测的准确性。MAG218标记和gwm88标记是当前最好的可用于Rf6分子标记辅助选择的分子标记。由于MAG218标记和gwm88标记与Rf6的紧密连锁关系，以该标记为路标，可以进行Rf6的精细定位或通过染色体步移法接近Rf6基因，从而为育性恢复基因Rf6的克隆打下基础。
(一)N2114与苏三F2代的创建与表型鉴定：
(1)小麦小伞山羊草易位系N2114(♀)与小麦品种苏三(♂)进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2群体。
(2)F2代群体植株种在南京农业大学校内试验田。由于群体内各单株的细胞质来自N2114，为T型细胞质，因此，各单株的育性直接反映了育性被恢复的情况。在抽穗期对各单株套袋自交以检测各单株的育性。环境为自然生长条件。
(3)F2代可育单株套袋自交所得种子为F3家系。随机从F3家系中任选10个家系，每个家系任选15粒种子种于田间。每个家系分别观察育性分离比。结果见表1。
(二)F2代群体的分子标记分析
(1)用SDS法(Ma and Sorrells，1995)提取F2代群体各单株的DNA，应用简单重复序列标记SSR与BSA(Bulk segregant analysis，Michelmore R W，Paran I，Kesseli R V.Identification of markers linked to diseaseresistance genes by bulked segregant analysis：a rapid method todetect markers in specific genomic region by using segregatingpopulations.Proc Natl Acad Sci USA，1991，88：9828-9832.)结合的方法进行多态性筛选。将6株完全可育与6株完全不育F2单株DNA等量混合，构成可育池(F池)与不育池(S池)。
(2)首先用654对SSR引物对N2114，CS(中国春，常规育种材料，见Ma.ZQ，Zhao YH，Liu DJ Incorporation of restoring gene from Aegilopsumbellulata into wheat.Genome 34：727-732)，苏三及F、S池DNA多态性进行初步分析。PCR反应体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgC121.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶(5单位/微升)0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升。SSR反应体系为DNA 94℃预变性3min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸展1min，循环35次，最后72℃延伸10min。在PTC-225扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(100ml聚丙烯酰胺溶液中含7.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。在亲本间和F2代群体的F、S池间扩增出相同有多态型的引物为与Rf6连锁的候选标记。共得到5对这样的标记，MAG218标记和gwm88标记就在其中(图2，图3)。将这5对分子标记在F2代群体单株中扩增获取群体各单株的基因型资料。
(3)根据连锁交换规律，利用扩增获得的F2代群体各单株基因型资料与田间鉴定获得的对应各单株的育性资料构建5对标记与N2114恢复基因Rf6的连锁图，所用软件为Mapmaker Macintosh V 2.0(通用作图软件)。找到了与Rf6最为紧密连锁的分子标记MAG218标记和gwm88标记，它们与Rf6的遗传距离都为1.9cM。MAG218标记为共显性标记，即携带和不携带恢复基因Rf6的单株分别具有不同的特征带型(见图2)。gwm88标记为显性标记(见图3)。
(4)F2代单株套袋自交所得种子为F3家系。
随机从F3家系中任选10个家系，每个家系任选15粒种子种于田间。每个家系分别观察育性分离比，得到的结果见(表2)。即MAG218标记在F2代鉴定为恢复基因纯合的植株，F3代表现全为可育；而鉴定为杂合的植株，F3代发生育性分离(见表1)，验证了MAG218标记在F2代鉴定恢复基因纯合或杂合的植株是正确的，同时也证实了MAG218标记的共显性。
(三)结果与分析：
1.利用Mapmaker Macintosh V 2.0软件对各个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个单株的育性鉴定结果进行连锁分析，获得了MAG218标记和gwm88标记与位于小麦小伞山羊草易位系N2114中恢复基因Rf6的连锁最紧密，遗传距离都为1.9cM(图1).
MAG218标记为：
左端引物序列AGTCGTGCACCTCCATTTTGG
右端引物序列CATTGGACATCGGAGACCTGAG
该标记为共显性分子标记，扩增小麦小伞山羊草育性恢复材料或品种DNA，获得的扩增片段为194bp(表2)
gwm88标记为：
左端引物序列为CACTACAACTATGCGCTCGC
右端引物序列为TCCATTGGCTTCTCTCTCAA
该标记为显性分子标记，在小麦小伞山羊草易位系N2114中特异扩增片段大小为75bp(表2)。
MAG218标记和gwm88标记片段均在小麦小伞山羊草易位系N2114中，位于小伞山羊草6U染色体易位于小麦染色体的片段中，该小伞山羊草6U染色体的易位片段包含了Rf6基因。
2.在F2代利用MAG218标记鉴定为恢复基因纯合的单株，其F3代个体表现全为可育；而鉴定为杂合的单株，其F3代个体发生育性分离(见表1)，证实了MAG218标记的共显性特征，因此该标记可用于恢复基因纯合性的鉴定。
表1 田间观察F3家系育性分离比株系编号MAG218扩 增带型 可育株 不育株 可育/不育 3 Rf/rf 9 6 1.5∶1 19 Rf/rf 11 4 2.8∶1 36 Rf/rf 10 5 2∶1 37 Rf/rf 10 5 2∶1 41 Rf/rf 11 4 2.8∶1 49 Rf/rf 11 4 2.8∶1 72 Rf/Rf 15 0 - 73 Rf/Rf 15 0 - 85 Rf/rf 12 3 4∶1 10 Rf/rf 11 4 2.8∶1
表2标记引物的序列及扩增片段大小
标记 左端引物序列 右端引物序列 片段大小(bp)
MAG218 AGTCGTGCACCTCCATTTTGG CATTGGACATCGGAGACCTGAG 194
gwm88 CACTACAACTATGCGCTCGC TCCATTGGCTTCTCTCTCAA 75
本发明利用654个SSR标记找到与恢复基因Rf6紧密连锁的分子标记MAG218标记和gwm88标记，它们与Rf6之间的遗传距离仅为1.9cM。本发明显示了在将恢复基因快速准确地转入小麦品种的研究中取得的突破。利用分子标记MAG218标记和gwm88标记辅助Rf6恢复系的选育，具有检测方便、稳定、简便等优点。利用MAG218标记，可以确定Rf6的存在与否以及存在状态，并预测小麦植株的育性，进而快速筛选携有Rf6的单株或株系。同时利用分子标记进行实验室检测可以避免环境对育性的影响。通过检测与恢复基因紧密连锁的分子标记，可以在苗期就鉴定出携有恢复基因以及恢复基因以纯合或杂合状态存在的单株，淘汰非目标植株，可节约成本并大大提高恢复系的选择效率。利用紧密连锁的分子标记MAG218标记和gwm88标记，还可以进行Rf6的精细定位或通过染色体步移法接近Rf6基因，从而为育性恢复基因Rf6的克隆打下基础。并可用于Rf6转基因育种及品种的检测鉴定。