一种白色念珠菌热休克蛋白90表位与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白及其用途.pdf

本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域。利用基因工程技术，将白色念珠菌热休克蛋白90表位基因片段(LKVIRK)插入到整合有丝状噬菌体主要外壳蛋白基因的载体中，构建成新的重组载体。在宿主菌中，表位基因产物被分泌到细胞外，并组装于噬菌体外壳蛋白中，形成杂合蛋白。1〕杂合蛋白可以作为一种抗原与患系统性白色念珠菌感染者血清中的抗体产生免疫应答。2〕杂合蛋白在小鼠体产生了较好的体液免疫和细胞免疫。3〕杂合蛋白在白色念珠菌感染模型鼠的免疫保护和预防实验中表现出保护作用。所以，这种杂合蛋白可以用来制备诊断、预防和治疗系统性白色念珠菌感染的药品。

1、  一种白色念珠菌热休克蛋白90表位与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白，其特征在于将白色念珠菌热休克蛋白90表位(LKVIRK)展示于丝状噬菌体主要外壳蛋白表面，形成的杂合蛋白，此蛋白的氨基酸结构序列为：
Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu
1               5                   10                  15
Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Leu Lys Val Ile Arg Lys
            20                  25                  30
Ser Asn Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala Ser Ala
        35                  40                  45
Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly
    50                  55                  60
Ala Thr Ile Gly Ile Lys Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser
65                  70                  75                  80

2、  如权利要求1所述的白色念珠菌热休克蛋白90表位与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白，其特征是这种杂合蛋白的核苷酸序列为：
atg aaa aag tct tta gtc ctc aaa gcc tcc gta gcc gtt gct acc ctc         48
gtt ccg atg ctg tct ttc gcc gcg gag ggt ctg aaa gtt atc aga aaa         96
tcg aac gat cct gca aaa gcg gcc ttt gac tcc ctg caa gcc tca gcg        144
acc gaa tat atc ggt tat gcg tgg gcg atg gtt gtt gtc att gtc ggc        192
gca act atc ggt atc aag ctg ttt aag aaa ttc acc tcg aaa gca agc        240

3.  白色念珠菌热休克蛋白90表位与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白作为制备检测系统性白色念珠菌感染的待检者血清中抗体的药品中的用途。

4.  白色念珠菌热休克蛋白90表位与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白作为制备治疗和预防系统性白色念珠菌感染的药品中的用途。

一种白色念珠菌热休克蛋白90表位与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白及其用途
技术领域
本专利属于生物工程中的DNA重组技术领域。
背景技术
白色念珠菌是一种最常见的条件致病菌，其深层(系统)感染，即系统性白色念珠菌感染危及病人的生命，在使用抗真菌药物进行治疗的情况下，死亡率仍很高。白色念珠菌感染近二十多年来一直处于临床真菌感染的第一位。研究报道表明，艾滋病、癌症、肝病晚期和大量应用抗菌素的患者均易感染白色念珠菌，是被称为免疫系统薄弱病人的一个共同致死原因之一。目前，由于缺乏有效的诊断试剂和治疗药物，系统性白色念珠菌感染仍然威胁着人类的健康。
系统性白色念珠菌感染没有明显的临床特征，使临床医生无法在早期发现。目前，主要的诊断方法是利用血培养，这种方法不仅费时，操作繁琐，而且灵敏性低。在治疗方面，主要采用抗真菌药物治疗，抗真菌药物不仅价钱贵，而且具有很大的副作用，如容易引起肾功能衰竭等。免疫疗法被认为是治疗真菌感染的有效途径。
发明内容
本发明的目的是确立一种能够用于制备系统白色念珠菌感染临床检测，治疗和预防的药物的生物制品。
采用噬菌体展示技术，将一种白色念珠菌热休克蛋白90的抗原表位基因重组到一种整合有噬菌体主要外壳蛋白基因的表达质粒中，形成重组载体。利用CaCl₂法将重组载体导入大肠杆菌TG1宿主细胞中。外源基因在宿主细胞内表达，与噬菌体外壳蛋白一起组装而形成一种杂合蛋白，并随噬菌体分泌到细胞外。利用生物化学方法提取和纯化展示有表位的杂合蛋白。
本发明的杂合蛋白是含有白色念珠菌热休克蛋白90表位(LKVIRK)的丝状噬菌体基因8杂合外壳蛋白。这种杂合蛋白基因的核苷酸序列为：
atg aaa aag tct tta gtc ctc aaa gcc tcc gta gcc gtt gct acc ctc    48
gtt ccg atg ctg tct ttc gcc gcg gag ggt ctg aaa gtt atc aga aaa    96
tcg aac gat cct gca aaa gcg gcc ttt gac tcc ctg caa gcc tca gcg    144
acc gaa tat atc ggt tat gcg tgg gcg atg gtt gtt gtc att gtc ggc    192
gca act atc ggt atc aag ctg ttt aag aaa ttc acc tcg aaa gca agc    240
这种杂合蛋白的氨基酸序列为：
Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu
1               5                   10                  15
Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Leu Lys Val Ile Arg Lys
            20                  25                  30
Ser Asn Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala Ser Ala
        35                  40                  45
Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly
    50                  55                  60
Ala Thr Ile Gly Ile Lys Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser
65                  70                  75                  80
这种杂合蛋白的制备包括以下步骤：
第一步，合成表位基因
该基因为编码白色念珠菌热休克蛋白90的一种表位(IKVIRK)的基因。可以利用商业公司的DNA合成仪进行合成。
第二步，构建重组载体
原始质粒为已公开质粒pfd8SHS(一种整合有丝状噬菌体主要外壳蛋白基因的表达性载体)[分子科学学报，2000：16(3)184-186]。用两种限制性内切酶处理原始质粒，然后将人工合成的寡核苷酸片段插入到经酶处理的质粒载体，获得重组载体pfd8C。
第三步，将重组载体转入宿主细胞。宿主细胞为带有F因子的大肠菌株TG1菌株。获得的转化体为新的工程菌株，TG1C。
第四步，制备杂合蛋白。培养工程菌株，经过离心、沉淀等步骤可获得该发明的杂合蛋白。
1.作为制备检测系统性白色念珠菌感染的新生物制品
酶联免疫检测表明，杂合蛋白可以作为一种抗原与患系统性白色念珠菌感染者血清中的抗体产生免疫应答。检测阳性率达到90％以上。
2.作为制备治疗和预防系统性白色念珠菌感染药物的新生物制品，用于系统性白色念珠菌感染的免疫治疗。
杂合蛋白在小鼠体产生了较好的体液免疫和细胞免疫：
1]用ELISA和Western blot方法检测了免疫后小鼠血清中抗体的变化和特异性。结果表明：杂合蛋白刺激小鼠产生了抗白色念珠菌热休克蛋白90表位的特异性抗体。
2]用³H-TdR掺入法和流式细胞仪检测表明杂合蛋白免疫小鼠体内的细胞免疫变化。结果表明，NK细胞的杀伤活性、胸腺细胞自然增生能力和淋巴细胞转化能力均得到明显增强，并增强了胸腺、脾和外周血中CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞的表达。
3]杂合蛋白在白色念珠菌模型鼠的免疫预防和治疗试验中表现出较好的作用：实验表明：杂合蛋白能够推迟感染的发生时间，推迟时间达5-7天。提高了小鼠的存活率，存活率提高了约30％
具体实施方式：
1.表位基因的合成：
利用商业生物公司的DNA合成仪进行表位基因片段。该基因的核苷酸序列为：
5’-CTG AAA GTT ATC AGA AAA-3’
2.重组载体的构建
利用质粒pfd8SHS为原始质粒，进行重组载体的构建。
1)利用限制性内切酶处理原始质粒pfd8SHS。
2)将酶切后的载体与人工合成的外源DNA片段按摩尔浓度1∶3混合。
3)10μL混合液加入0.5μL T₄ DNA连接酶和1μL缓冲液。在15-20℃条件下过夜，获得重组载体(pfd8C)。
3.制备感受态细胞
将TG1细胞培养于LB培养基上，37℃培养16-20小时。挑选单菌落接种于2ml LB液培养基中，37℃培养过夜。培养液转入100ml新鲜LB培养液中，37℃培养5小时。5000rpm离心15分钟，放入42-43℃水浴中90秒，然后迅速转入冰水浴中10分钟。用8ml预冷的0.1mol/L CaCl₂悬浮沉淀，获感受态细胞。
4.重组载体转化宿主细胞
取浓度约为150μg/mL的重组载体DNA溶液1.25μL；加入100μl的感受态细胞，置于碎冰中15分钟；加入600μl LB培养液，置于37℃恒温条件培养1小时；10000rpm离心5分钟；弃上清，将剩余部分涂于含氨苄青霉素的LB培养基表面，37℃恒温箱中培养过夜。选在培养平面生长的单菌落，进行扩大培养和低温保存(-70℃)。
5.杂合蛋白的制备
取冻存的转化细胞在LB平板上划线培养，过夜；选单菌落接种于含氨苄青霉素的3mlLB培养液中，37℃培养过夜；将培养液转入80-100ml LB培养液中继续培养，37℃培养30分钟；离心10分钟；沉淀用培养液重新悬浮，37℃培养数小时；离心20分钟，弃上清，用TE液悬浮沉淀；离心20分钟，取上清，并加入20％聚乙二醇和2.5mol/L氯化钠。冷环境中放置数小时，离心10分钟；弃上清，用TE液悬浮沉淀，获得有外源多肽展示的丝状噬菌体杂合外壳蛋白。
7.制备的杂合蛋白的检测
采用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳法进行蛋白的纯度检测
将待测蛋白样品在沸水中处理3-5分钟。按常规方法进行电泳。电泳后，用硝酸银染色法对胶板进行染色。如果杂合蛋白表达成功，胶板上出现两条带。上方带为杂合蛋白带，下方为野生型丝状噬菌体外壳蛋白带。
8.免疫学实验
1〕抗体检测试验
利用酶联免疫方法，以杂合蛋白作为抗原进行患系统性白色念珠菌感染者血清中地抗体的检测。
酶标板以每孔0.5-1ug包被抗原。酶标二抗使用辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。按常规方法进行抗体检测。
2〕动物体的体液免疫和细胞免疫试验
选择18-20克C57BL/6J小鼠数十只，雌雄各半，随机分组(实验组及对照组)，进行腹腔注射给药(杂合蛋白)。各组均免疫三次，第一次和第二次免疫间隔时间为14天，第二次和第三次免疫间隔时间为10天，分别在第一次免疫后的2、4、6、8周进行尾部采血，用ELISA方法检测小鼠体内抗体的变化。另一部分实验是在免疫小鼠4周后处死小鼠，利用³H-TdR掺入法和流式细胞仪检测进行各项免疫指标的测定。
3〕动物免疫预防试验
用杂合蛋白免疫小鼠后，于右后肢外侧皮下接种白色念珠菌细胞。在接种后的第10天开始观察，并且每隔3天测量肿瘤体积，计算存活率。
4)动物免疫治疗试验
于右后肢外侧皮下接种白色念珠菌细胞，用杂合蛋白免疫小鼠，共3次。观测各组小鼠的存活率。