趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法.pdf

本发明公开了一种趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，包括以下步骤，首先，超声波破碎趋磁细菌细胞壁；然后，蔗糖密度梯度离心，分离磁性颗粒与细胞碎片，用超声波打散与缓冲液洗涤磁性颗粒，以除去磁性颗粒表面所吸附的物质；最后，倾去上清液，加入缓冲液，保存。本发明采取了超声波破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、超声波打散并配合缓冲液洗涤和磁铁吸附回收、电子显微镜观察检测等手段，提纯了趋磁细菌磁性颗粒；纯化后的磁性颗粒，经电子显微镜观察(放大8万倍)发现分散均匀，且外膜完整，经冷冻干燥处理后，最终获得磁性颗粒的回收率可达30－40mg/L培养液。

1、  一种趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，其特征在于：包括以下步骤，
步骤一，超声波破碎趋磁细菌细胞壁；
步骤二，蔗糖密度梯度离心，分离磁性颗粒与细胞碎片；
步骤三，用超声波打散与缓冲液洗涤磁性颗粒，以除去磁性颗粒表面所吸附的物质；
步骤四，倾去上清液，加缓冲液后保存。

2、  根据权利要求1所述的趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，其特征在于：所述步骤一中超声波破碎趋磁细菌的细胞，是在冰浴条件下，使胞内磁性颗粒释放出来，然后通过磁铁吸取收集磁性颗粒。

3、  根据权利要求1所述的趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，其特征在于：所述步骤二中的蔗糖密度梯度离心，将磁性颗粒沉淀悬浮于无菌的70％蔗糖溶液，振荡均匀，在离心管内加入80％蔗糖溶液，将磁性颗粒悬浮液加至80％蔗糖液面之上，采用水平转头，20℃，6000r/min，离心5分钟至15分。

4、  根据权利要求1所述的趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，其特征在于：所述步骤四中，加入10ml 0.2M PB磷酸盐缓冲液(pH7.4)，4℃保存。

5、  根据权利要求1所述的趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，其特征在于：如上所述的趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，可采用多次离心，分批回收磁性颗粒带。

趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法
技术领域
本发明涉及破碎趋磁细菌细胞，提取并纯化纳米磁性颗粒的方法，通过采用超声波破碎、蔗糖密度梯度离心、超声波打散并配合缓冲液洗涤和磁铁吸附等方法，将趋磁细菌细胞内合成的磁性颗粒提取并纯化，属于纳米生物技术研究领域。
背景技术
趋磁细菌的发现与研究丰富了微生物学的研究内容。趋磁细菌(magneto-tactic bacteria)并不是一个分类学上的名词，它是具有趋磁性的一类细菌的总称。目前已知的趋磁细菌共有13种。在最新版的伯杰氏系统细菌学手册中，这些趋磁细菌被分别纳入Magnetospirillum(磁螺菌)和Magnetobacterium(磁杆菌)属中，其中Magnetospirillum属有两个种，即M.magnetotacticum和M.gryphiswaldense(趋磁磁螺菌和格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌)，M.gryphiswaldense为该属的模式种。作为一类新的微生物，为微生物分类学、遗传学、生理学提供了一个新的研究领域。本发明所提到的趋磁细菌的发现和研究对生物磁学和仿生学具有较大的意义。由于生活在地球上的生物总是要受到地磁场的影响，目前发现许多生物，从低等到高等生物，甚至人的大脑细胞中都因存在强磁性物质而表现出一些特殊的生物功能，如信鸽与蜜蜂的导航、鳗鱼和蜗牛的定向等。由于趋磁细菌具有结构简单，在自然界中大量存在等优点，极有可能作为一种模式材料，用来了解高等生物产生这些特殊功能的机理，为仿生学研究提供理论基础，使之能在工程技术上加以模拟和仿制，从而在导航及定向等高新技术领域里加以应用。
趋磁细菌的发现和研究对地质学具有一定的意义。地质学的一个重要研究内容是探索地磁场及铁矿石的形成原因，趋磁细菌的发现和研究将为这一研究领域开辟一条新的思路。有人推测趋磁细菌和铁还原细菌一起参与了海洋沉积物的磁化和矿化过程(Farina，M.，et.al.1990；Lovley，D.R.，et.al.1987；Mann，S.，et.al.1990；Stolz，J.F.，et.al.1986)，海底趋磁细菌磁铁化石的发现和Magnetic vibrio MV-1在厌氧条件下能合成磁性颗粒的现象进一步地支持了这一假说。此外，我国学者在研究沉积物磁性勘查油气法时也发现在绝大多数油田土壤中都存在着趋磁细菌(阎桂林，1997)。
近两年来，天文物理学上有一个重要发现就是在火星陨石(ALH84001)中发现了磁性颗粒(Thomas-Keprta，K.L.，et.al.2001；Friedmann，E.L.，et.al.2001；Scott，E.R.1999；Mckay，D.S.，et.al.1996)。这些颗粒的大小为10-100nm，都是单磁畴晶的，其形态、结构、大小与地球上趋磁细菌形成的磁性颗粒十分相似。科学家由此推测火星上很可能有生命现象存在，并把以上发现作为一个很重要的证据。
在一定条件下，趋磁细菌细胞内合成并积累Fe₃O₄颗粒，它们颗粒大小均匀、一般直径为纳米级(40-50nm)，并具有稳定晶型，如八面立方体，平截六棱柱体，弹头体等(Spring，S.，et al.，1995)。每个磁性颗粒都有脂蛋白膜包被，因此又被称为磁小体(magnetosome)。其外膜为磷脂双分子层，这种双分子层脂膜由外膜、中膜和内膜构成。经化学分析发现，98％的膜成分为脂类，只有2％为蛋白。脂类包括三种：1)中性脂类，2)游离脂肪酸，3)糖脂，硫脂和磷脂。这三种脂类在膜的总脂中所占比例分别为：8％、30％和62％。其中磷脂类的主要成分是磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺。研究证明，这种磷脂双分子层脂膜表面带负电荷，而且随着环境中pH的提高，负电荷电位也逐渐增加。正是由于膜表面负电荷的存在，使磁性颗粒间彼此互相排斥，从而防止了纳米磁性颗粒间最容易发生的团聚现象(Tanaka，T.，et al.，2000)。
趋磁细菌产生的这种纳米磁性颗粒可作为酶载体而用于固定化酶生产；作为抗体载体而用于高灵敏度的免疫检测；作为核酸载体而用于基因转移、基因治疗及作为药物载体而用于靶向治疗等。但由于趋磁细菌的生长对环境要求比较苛刻，人工培养困难，对细菌磁性颗粒的应用尚局限在实验室水平。目前为止，尚未见到有关这种磁性颗粒工业化生产和专门提取纯化的文献报道及专利。除了用于酶载体和抗体载体外，若要将其用于基因治疗和肿瘤的靶向治疗，首先必需获得高纯度的，不含免疫原性物质的和膜完整的磁性颗粒。在其用于酶载体和抗体载体的研究文献中，只有少量涉及这种磁性颗粒提取的内容，其中主要是关于破壁的方法，有以下几种：1)用溶菌酶或NaOH破壁；2)用细胞压榨仪破壁；3)超声波破壁。破壁后采用磁场分离的方法收集磁性颗粒，直接用于对纯度要求不高的酶载体和抗体载体。由于纳米磁性颗粒的吸附性质，上述几种方法都无法除去有免疫原性的一些物质，再者用溶菌酶和NaOH破壁提取的磁性颗粒的膜已被破坏，容易引起团聚。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，采用本发明所述方法得到的纯化磁性颗粒，其分散均匀，外膜完整，回收率高。
本发明所述趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，包括以下步骤：
步骤一，超声波破碎趋磁细菌细胞壁；
步骤二，蔗糖密度梯度离心，分离磁性颗粒与细胞碎片；
步骤三，用超声波打散与缓冲液洗涤磁性颗粒，以除去磁性颗粒表面所吸附的物质；
步骤四，倾去上清液，加缓冲液后保存。
如上所述的趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，所述步骤一中，超声波破碎趋磁细菌的细胞，是在冰浴条件下，使胞内磁性颗粒释放出来，然后通过磁铁吸取收集磁性颗粒。
如上所述的趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，所述步骤二中的蔗糖密度梯度离心，将磁性颗粒沉淀悬浮于无菌的70％蔗糖溶液，振荡均匀，在离心管内加入80％蔗糖溶液，将磁性颗粒悬浮液加至80％蔗糖液面之上，采用水平转头，20℃，6000r/min，离心5分钟至15分钟。
如上所述的趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，所述步骤四中加入10ml 0.2M PB磷酸盐缓冲液(pH7.4)，4℃保存。
如上所述的趋磁细菌纳米磁性颗粒的提取和纯化方法，可采用多次离心，分批回收磁性颗粒带。
本发明采取了超声波破碎、蔗糖密度梯度离心、超声波打散并配合缓冲液洗涤和磁铁吸附回收、电子显微镜观察检测等手段，提纯了趋磁细菌磁性颗粒；并将纯化后的磁性颗粒分别采用能谱、紫外-可见分光光度计、蒽酮法等方法进行检测，都没有检测到杂质。纯化后的磁性颗粒，经电子显微镜观察(放大8万倍)发现分散均匀，且外膜完整。经冷冻干燥处理后，最终获得磁性颗粒的回收率可达30-40mg/L培养液。
具体实施方式
以下通过实施例更具体地说明本发明。本发明所述方法地步骤详细说明如下：
1)超声波破碎趋磁细菌细胞壁
在冰浴条件下，超声波破碎趋磁细菌的细胞，使胞内磁性颗粒释放出来，然后通过磁铁吸取收集磁性颗粒。
2)蔗糖密度梯度离心，分离磁性颗粒与细胞碎片
由于磁性颗粒内含有Fe₃O₄晶体，因此需要提高蔗糖的浓度。选择了70％和80％两个浓度的蔗糖溶液作为离心介质，每次离心的条件为：20℃，6000r/min，离心5分钟。如上样量较大时，可选择增加离心次数的方法，分批回收磁性颗粒带。
3)用超声波打散与缓冲液洗涤磁性颗粒，以除去磁性颗粒表面所吸附的物质
细菌纳米磁性颗粒小，易吸附其他物质，因此在破壁后，尚有部分细胞碎片粘附在磁性颗粒表面。这些碎片必须去除。实验表明，超声波打散洗涤法，能够有效地将这些磁性颗粒表面所吸附的物质除去。在洗涤过程中也发现，随着洗涤次数的增多，悬浮液中的颗粒肉眼可见度逐渐降低，直至完全分散，悬浮液呈透明状态。
4)倾去上清液，加入10ml 0.2M PB磷酸盐缓冲液(pH7.4)，4℃保存。
实施例：
例1：细胞破碎和磁铁吸附回收磁性颗粒
培养液于4℃，5000r/min离心30min，去掉上清液，将细胞沉淀转移至一烧杯，加入10mM HEPES通用缓冲液(pH7.4，先灭菌)，振荡悬浮，置冰浴中进行超声波破碎细胞；烧杯底部固定一块磁铁(约2000guass)，静置20-30min，或更长时间(视样品量而定)，待磁性颗粒全部聚集在烧杯底部形成大量黑色沉淀后，去上清液，就可以进行下一步处理了。
例2：蔗糖密度梯度离心分离趋磁螺菌的磁性颗粒与细胞碎片
磁铁吸附完毕，去上清液，将磁性颗粒沉淀悬浮于无菌的70％蔗糖溶液，振荡均匀。在离心管内先加入80％蔗糖溶液，将磁性颗粒悬浮液加至80％蔗糖液面之上，采用水平转头，20℃，6000r/min，离心5分钟至15分钟。如果样品较多，每离心5分钟后，可先将磁性颗粒带吸出，再离心5分钟，依此类推。
例3：超声波打散与缓冲液洗涤多次，达到纯化磁性颗粒的目的
将聚集在2种浓度蔗糖界面的磁性颗粒带吸出，置一干净容器内，加入10mMHEPES通用缓冲液(pH7.4)，冰浴条件下，超声波打散，目的是将粘附在磁性颗粒表面的细胞碎片去除，经磁铁吸附，使磁性颗粒聚集底部，去上层溶液，加入新鲜缓冲液，超声波击打，此过程反复15次以上。洗涤完毕，将磁性颗粒悬浮于无菌的PB磷酸盐缓冲液，4℃保存。
例4：紫外-可见分光光度计、蒽酮法、能谱、电子显微镜检测磁颗
采用紫外-可见分光光度计检测悬浮磁性颗粒的溶液，结果见表1。
蛋白质、DNA和RNA分别在280nm、260nm和230nm处有最大吸收峰，由表1.可以看出上清液在此3处波长的吸光值均已低至接近于零，这说明在该上清液中蛋白质、DNA和RNA的含量已低至无法检测，磁性颗粒悬液不含蛋白和核酸。
表1.紫外分光光度法测定上清液中蛋白、核酸含量的实验结果