可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌及利用其制备乙酰酯酶的方法.pdf

本发明公开了一种可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌，菌株中包括一种可表达乙酰酯酶的重组载体pKK223-3-ybaC，及利用该菌株液态发酵制备乙酰酯酶的方法为：将大肠埃希氏菌JM110（pKK223-3-ybaC）接种于氨苄LB液体培养基中于37℃、150rpm全温振荡培养箱中活化培养3d，吸取200μL菌悬液接种于氨苄LB液体培养基中于37℃、180rpm全温振荡培养箱中进行发酵，37℃过夜培养后加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG，共计发酵5d，将发酵产物1000g，4℃低温离心8min，上清液即为乙酰酯酶粗酶液。本方法所需培养基简单，发酵条件为好氧发酵，易于控制，所制备的乙酰酯酶粗酶液酶活力高，最高可达42.66U/mL，此外，本发明所制备的乙酰酯酶有较高的温度耐受性，最适反应温度为51℃。

1.  一种可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌，其特征在于：该大肠埃希氏菌JM110（pKK223-3-ybaC）的重组载体为pKK223-3-ybaC，表达乙酰酯酶。

2.  根据权利要求1所述的一种可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌，其特征在于：所述重组载体pKK223-3-ybaC的原始表达载体为pKK223-3。

3.  根据权利要求1所述的一种可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌，其特征在于：所述的重组载体pKK223-3-ybaC转入有ybaC基因。

4.  根据权利要求1所述的一种可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌，其特征在于：可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌可在IPTG诱导下好氧发酵制备乙酰酯酶。

5.  根据权利要求1所述的一种可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌，其特征在于：可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌的受体菌为大肠埃希氏菌JM110。

6.  一种权利要求1所述可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌，其是由下述方法获得：
（1）、大肠埃希氏菌RB3菌株总DNA的提取：将大肠埃希氏菌RB3菌株接种于30mL LB液体培养基中，37℃过夜培养，取菌液；采用细菌总DNA快速提取试剂盒提取大肠埃希氏菌RB3基因组DNA；
所述的大肠埃希氏菌RB3菌株为于牛瘤胃液中筛选得到；
所述的LB液体培养基构成如下：酵母浸粉 5g，蛋白胨 10g，氯化钠 10g，加水定容至1000mL；
（2）、ybaC基因的克隆：根据已公开的ybaC序列设计引物，并在上下游引物的5’端分别引入酶切位点EcoRI和PstI；以大肠埃希氏菌RB3总DNA为模板，进行PCR，得到ybaC基因的克隆；
所述的已公开的ybaC序列参照：GenBank KM489072；
所述的引物为：
ybaC-F  5’ -cggaattcatgaagccggaaaacaaattac -3’                               
ybaC-R  5’ -aactgcaggccgcgtatcgctaaagct -3’
（3）、克隆载体pMD18-T-ybaC的构建：将电泳纯化后的PCR产物，按适当比例与线性化的克隆载体pMD18-T混合，使用TaKaRa DNALigation Kit试剂盒进行pMD18-T载体和ybaC基因的连接，连接后转化大肠埃希氏菌JM109，并进行阳性鉴定，将阳性单菌落插入片段测序；
所述的PCR产物纯化是使用DNA切胶回收试剂盒进行切胶回收；
所述的适当比例为ybaC基因与pMD18-T载体物质的量比为10:1；
所述的阳性鉴定是通过对转化后单菌落提质粒，通过电泳条带进行鉴定；
（4）、表达载体pKK223-3-ybaC的构建：使用质粒小量提取试剂盒提取阳性质粒pMD18-T-ybaC，限制酶EcoRI和PstI双酶切后电泳并切胶回收ybaC片段，采用适量配比与已被限制酶EcoRI和PstI双酶切并纯化的表达载体pKK223-3混合，最后使用T₄ DNA连接酶过夜连接；连接后转化大肠埃希氏菌JM110，并进行阳性鉴定，将阳性单菌落插入片段测序；
所述的表达载体pKK223-3的纯化为使用DNA片段回收试剂盒进行纯化回收；
所述的适量配比为ybaC基因与pKK223-3载体物质的量比为10:1；
所述的阳性鉴定是通过对转化后单菌落提质粒并用限制酶EcoRI和PstI双酶切，酶切产物通过电泳条带进行鉴定；
最后获得的表达载体已经成功转入ybaC基因，命名为pKK223-3-ybaC；
最后获得的菌株成功转入ybaC基因，命名为大肠埃希氏菌JM110(pKK223-3-ybaC)。

7.  一种利用权利要求1所述表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌液态发酵制备乙酰酯酶的方法，该方法是：
将大肠埃希氏菌JM110（pKK223-3-ybaC）接种于氨苄LB液体培养基中于37℃、150rpm全温振荡培养箱中活化培养3d，吸取200μL菌悬液接种于氨苄LB液体培养基中于37℃、180rpm全温振荡培养箱中进行发酵，37℃过夜培养后加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG，共计发酵5d，将发酵产物1000g，4℃低温离心8min，上清液即为乙酰酯酶粗酶液；所述的氨苄LB液体培养基构成如下：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，加水定容至1000mL，灭菌后加入终浓度为1.0mmol/L的氨苄青霉素。

可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌及利用其制备乙酰酯酶的方法
技术领域
本发明涉及一种可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌属新菌株，特别是利用菌株发酵制备乙酰酯酶的方法。
背景技术
1966年，Robert TL等首次发现了乙酰酯酶，并对其做了相关的分析，从此乙酰酯酶进入了科研领域。乙酰酯酶共有319个氨基酸残基，控制大肠埃希氏菌乙酰酯酶表达的基因是ybaC基因，共960bp，已有部分产乙酰酯酶大肠埃希氏菌ybaC基因被测序，不同亚种间序列差异不明显。乙酰酯酶是木聚糖降解酶系中重要的组成部分，在木聚糖的降解过程中发挥着重要作用。研究发现，木聚糖的降解是由木聚糖降解酶系完成的，其构成酶主要有β-1,4-内切木聚糖酶（EC3.2.1.8）、β-D-木糖苷酶（EC3.2.1.37）、α-L-阿拉伯糖苷酶（EC3.2.1.55）、α-D-葡萄糖醛酸酶（EC3.2.1.21）、阿魏酸酯酶（EC3.1.1.73）、乙酰木聚糖酯酶(EC3.1.1.72)和乙酰酯酶（EC3.1.1.6）。其中，乙酰酯酶在木聚糖的侧链水解过程中发挥着巨大作用，乙酰酯酶通过降解木聚糖侧链降低了主链的空间位阻效应，从而加速了木聚糖的整体降解。
目前已发现少量大肠埃希氏菌菌株可以分泌乙酰酯酶，Shigenori K. 等人1998年在大肠埃希氏菌中发现了乙酰酯酶并通过实验定位了大肠埃希氏菌中乙酰酯酶的基因，命名为ybaC基因。此后又围绕乙酰酯酶的基因工程研究逐步展开，随后又有若干产乙酰酯酶的工程菌诞生，2012年Shigenori K.等又通过人工诱变地方法成功的增强了乙酰酯酶的表达，同年陈静等在牛的瘤胃液中成功筛选出了产乙酰酯酶的菌种分别是RB1和RB3，二者均有较高的产乙酰酯酶能力。
国际上，将乙酰酯酶划分为碳水化合物酯酶家族(CE family)的一员，目前CE 家族共有17个成员，参与多聚糖降解的酶主要包括CE1-7家族、CE16家族和CE17家族。CE1-7家族的各种酶均属于乙酰木聚糖酯酶，而CE16家族为乙酰酯酶，CE17家族成员酶为乙酰半乳葡甘露聚糖酯酶。由于乙酰酯酶在降解乙酰基团方面的特殊作用，使得其在造纸、生物质利用、饲料加工等领域有着广泛的应用前景。目前主要靠液态发酵的方法生产乙酰酯酶，但由于菌种来源不同，其产酶工艺主要存在三大问题。首先，已报道的菌株产酶能力低下，不能达到生产需求；其次，由于大部分的产乙酰酯酶菌株只适应于厌氧发酵，培养基也相对复杂，增大了发酵难度，提高产酶成本；最后，大多数菌株发酵周期较长，不适合大规模工业生产。曹阳春等人报道的真菌Neocallimastix frontalis乙酰酯酶酶活力最高为0.165U/mL，Bacillus pumilus培养于添加了玉米芯粉的液体培养基上，其产酶能力最高为0.11U/mL，Candida guilliermondii在玉米芯粉为碳源的液态培养基中发酵，其产酶酶活力可达0.28U/mL，大肠埃希氏菌RB3菌株，以玉米秸秆粉作碳源，在40℃，pH为8.0的环境中发酵4d，其产酶能力最大可达0.59U/mL，杨舒文等人通过对大肠埃希氏菌RB3菌株进行产酶优化，使其粗酶液的最大酶活力可达到0.96U/mL。以上的菌株为已报道的产酶能力较高的菌株，但大都由于产酶能力的低下、产酶条件的苛刻等问题影响乙酰酯酶的工业生产，因此采用合理的方法获得更适于发酵产酶的菌株，开发一种发酵产乙酰酯酶的新方法，将更具有实际价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌，该大肠埃希氏埃希氏菌是乙酰酯酶的高产重组菌株，其所产酶的酶活力显著高于已公开的其它菌株，且所产酶具有更高的温度耐受性。
本发明的另一个目的是提供一种利用该菌株液态发酵制备乙酰酯酶的方法。
本发明之可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌，其重组载体为pKK223-3-ybaC，表达乙酰酯酶。
所述重组载体pKK223-3-ybaC的原始表达载体为pKK223-3。
所述的重组载体pKK223-3-ybaC转入有ybaC基因。
可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌可在IPTG诱导下好氧发酵制备乙酰酯酶。
可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌的受体菌为大肠埃希氏菌JM110。
本发明之可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌的获得方法如下：
1、大肠埃希氏菌RB3菌株总DNA的提取：将大肠埃希氏菌RB3菌株接种于30mL LB液体培养基中，37℃过夜培养，取菌液。采用鼎国昌盛生物公司细菌总DNA快速提取试剂盒提取大肠埃希氏菌RB3基因组DNA。
所述的大肠埃希氏菌RB3菌株为于牛瘤胃液中筛选得到，大肠埃希氏菌RB3菌株在CN 102719370 A中已经公开。
所述的LB液体培养基构成如下：酵母浸粉 5g，蛋白胨 10g，氯化钠 10g，加水定容至1000mL。
2、ybaC基因的克隆：根据已报道的ybaC序列设计引物，并在上下游引物的5’端分别引入酶切位点EcoRI和PstI。以大肠埃希氏菌RB3总DNA为模板，进行PCR，得到ybaC基因的克隆。
所述的已报道的ybaC序列参照：GenBank KM489072。
所述的引物为：
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ybaC-R  5’ -aactgcaggccgcgtatcgctaaagct -3’
3、克隆载体pMD18-T-ybaC的构建：将电泳纯化后的PCR产物，按适当比例与线性化的克隆载体pMD18-T混合，使用试剂盒（TaKaRa DNALigation Kit，大连宝生物公司）进行pMD18-T载体和ybaC基因的连接，连接后转化大肠埃希氏菌JM109，并进行阳性鉴定，将阳性单菌落插入片段测序。
所述的PCR产物纯化是使用鼎国昌盛生物公司的DNA切胶回收试剂盒进行切胶回收。
所述的适当比例为ybaC基因与pMD18-T载体物质的量比为10:1。
所述的阳性鉴定是通过对转化后单菌落提质粒，通过电泳条带进行鉴定。
所述的测序由金维智生物科技有限公司完成。
 4、表达载体pKK223-3-ybaC的构建：使用质粒小量提取试剂盒（鼎国昌盛生物公司）提取阳性质粒pMD18-T-ybaC，限制酶EcoRI和PstI（大连宝生物公司）双酶切后电泳并切胶回收ybaC片段，采用适量配比与已被限制酶EcoRI和PstI双酶切并纯化的表达载体pKK223-3混合，最后使用T₄ DNA连接酶（大连宝生物公司）过夜连接。连接后转化大肠埃希氏菌JM110，并进行阳性鉴定，将阳性单菌落插入片段测序。
所述的表达载体pKK223-3购自上海北诺生物科技有限公司。
所述的表达载体pKK223-3的纯化为使用DNA片段回收试剂盒（鼎国昌盛生物公司）进行纯化回收。
所述的适量配比为ybaC基因与pKK223-3载体物质的量比为10:1。
所述的阳性鉴定是通过对转化后单菌落提质粒并用限制酶EcoRI和PstI双酶切，酶切产物通过电泳条带进行鉴定。
所述的测序由金维智生物科技有限公司完成。
本发明最后获得的表达载体，由金维智生物科技有限公司测序结果表明已经成功转入ybaC基因，命名为pKK223-3-ybaC。
本发明最后获得的菌株，由金维智生物科技有限公司测序结果表明已经成功转入ybaC基因，命名为大肠埃希氏菌JM110(pKK223-3-ybaC)。
获得的可表达乙酰酯酶的大肠埃希氏菌JM110(pKK223-3-ybaC)已在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为CGMCC 10507，保藏日期为2015年2月2日。
本发明之利用大肠埃希氏菌液态发酵制备乙酰酯酶的方法是：
将大肠埃希氏菌JM110（pKK223-3-ybaC）接种于氨苄LB液体培养基中于37℃、150rpm全温振荡培养箱中活化培养3d，吸取200μL菌悬液接种于氨苄LB液体培养基中于37℃、180rpm全温振荡培养箱中进行发酵，37℃过夜培养后加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG，共计发酵5d，将发酵产物1000g，4℃低温离心8min，上清液即为乙酰酯酶粗酶液。所述的氨苄LB液体培养基构成如下：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，加水定容至1000mL，灭菌后加入终浓度为1.0mmol/L的氨苄青霉素。
通过上述方案所获得的乙酰酯酶最大酶活力可达42.66U/mL，显著高于已报道的其他方法，从而克服了乙酰酯酶产酶活力较低的问题。另外，该方法所需培养基易于配制，所需的发酵条件易于控制，所产乙酰酯酶具有较高的温度耐受性。利于乙酰酯酶工业生产的实施。
本发明具有以下优点：
1、发酵所用菌株为转基因大肠埃希氏菌菌株，产乙酰酯酶酶活力显著高于其它已报道方法，最高可达42.66U/mL。
2、ybaC基因的来源为课题组所筛菌株大肠埃希氏菌RB3，其产酶能力已较高，故基因来源可靠。
3、发酵采用的培养基为LB液体培养基，配制简单，易于操作。
4、采用的发酵方式为好氧发酵，易于控制。
5、本发明所产乙酰酯酶温度耐受性高，最适反应温度为51℃。所产乙酰酯酶在造纸、生物质利用和饲料加工等领域应用前景广阔。
附图说明：
图1为表达载体pKK223-3-ybaC的结构图。
图2为本发明方法制备乙酰酯酶酶活力与发酵时间的动态曲线图。
图3为本发明方法所制备乙酰酯酶酶活力受温度影响曲线图。
图4为本发明方法所制备乙酰酯酶酶活力受pH影响曲线图。
具体实施方式
本发明之生产乙酰酯酶的大肠埃希氏菌的获得方法如下：
1、大肠埃希氏菌RB3菌株总DNA的提取：将大肠埃希氏菌RB3菌株接种于30mL LB液体培养基中，37℃过夜培养，取菌液。采用鼎国昌盛生物公司细菌总DNA快速提取试剂盒提取大肠埃希氏菌RB3基因组DNA。
所述的大肠埃希氏菌RB3菌株为于牛瘤胃液中筛选得到，大肠埃希氏菌RB3菌株在CN 102719370 A中已经公开。
所述的LB液体培养基构成如下：酵母浸粉 5g，蛋白胨 10g，氯化钠 10g，加水定容至1000mL。
2、ybaC基因的克隆：根据已报道的ybaC序列设计引物，并在上下游引物的5’端分别引入酶切位点EcoRI和PstI。以大肠埃希氏菌RB3总DNA为模板，进行PCR，得到ybaC基因的克隆。
所述的已报道的ybaC序列参照：GenBank KM489072。
所述的引物为：
ybaC-F  5’ -cggaattcatgaagccggaaaacaaattac -3’                               
ybaC-R  5’ -aactgcaggccgcgtatcgctaaagct -3’
3、克隆载体pMD18-T-ybaC的构建：将电泳纯化后的PCR产物，按适当比例与线性化的克隆载体pMD18-T混合，使用试剂盒（TaKaRa DNALigation Kit，大连宝生物公司）进行pMD18-T载体和ybaC基因的连接，连接后转化大肠埃希氏菌JM109，并进行阳性鉴定，将阳性单菌落插入片段测序。
所述的PCR产物纯化是使用鼎国昌盛生物公司的DNA切胶回收试剂盒进行切胶回收。
所述的适当比例为ybaC基因与pMD18-T载体物质的量比为10:1。
所述的阳性鉴定是通过对转化后单菌落提质粒，通过电泳条带进行鉴定。
所述的测序由金维智生物科技有限公司完成。
 4、表达载体pKK223-3-ybaC的构建：使用质粒小量提取试剂盒（鼎国昌盛生物公司）提取阳性质粒pMD18-T-ybaC，限制酶EcoRI和PstI（大连宝生物公司）双酶切后电泳并切胶回收ybaC片段，采用适量配比与已被限制酶EcoRI和PstI双酶切并纯化的表达载体pKK223-3混合，最后使用T₄ DNA连接酶（大连宝生物公司）过夜连接。连接后转化大肠埃希氏菌JM110，并进行阳性鉴定，将阳性单菌落插入片段测序。
所述的表达载体pKK223-3购自上海北诺生物科技有限公司。
所述的表达载体pKK223-3的纯化为使用DNA片段回收试剂盒（鼎国昌盛生物公司）进行纯化回收。
所述的适量配比为ybaC基因与pKK223-3载体物质的量比为10:1。
所述的阳性鉴定是通过对转化后单菌落提质粒并用限制酶EcoRI和PstI双酶切，酶切产物通过电泳条带进行鉴定。
所述的测序由金维智生物科技有限公司完成。
本发明最后获得的表达载体，由金维智生物科技有限公司测序结果表明已经成功转入ybaC基因，命名为pKK223-3-ybaC。
本发明最后获得的菌株，由金维智生物科技有限公司测序结果表明已经成功转入ybaC基因，命名为大肠埃希氏菌JM110(pKK223-3-ybaC)。大肠埃希氏菌JM110(pKK223-3-ybaC)的结构如图1所示。
本发明之利用大肠埃希氏菌液态发酵制备乙酰酯酶的方法是：
采用本发明的大肠埃希氏菌JM110(pKK223-3-ybaC)菌株液态发酵制备乙酰酯酶。
制备方法：将大肠埃希氏菌JM110（pKK223-3-ybaC）接种于氨苄LB液体培养基中于37℃、150rpm全温振荡培养箱中活化培养3d，吸取200μL菌悬液接种于氨苄LB液体培养基中于37℃、180rpm全温振荡培养箱中进行发酵，37℃过夜培养后加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG，共计发酵5d，将发酵产物1000g，4℃低温离心8min，上清液即为乙酰酯酶粗酶液。
所述的氨苄LB液体培养基构成如下：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，加水定容至1000mL，灭菌后加入终浓度为1.0mmol/L的氨苄青霉素。
乙酰酯酶酶活力的测定：发酵结束后测定粗酶液中乙酰酯酶酶活力，结果为其酶活力在38.59-42.66U/mL之间。
图2为该方法连续发酵17d粗酶液酶活力动态变化曲线图。可见，菌液乙酰酯酶酶活力发酵初期呈现上升趋势，发酵5d-9d产酶活力较高，而后逐渐下降，最高值出现在第5d，乙酰酯酶酶活力在38.59-42.66U/mL之间，显著高于已报道的其它产酶方法。
本发明的乙酰酯酶酶活力与温度的关系：
图3为本发明乙酰酯酶酶活力在不同温度下的变化曲线图。可见，相比原始菌株大肠埃希氏菌RB3，该酶有着更高的温度耐受性，当反应温度在35℃到51℃之间时，乙酰酯酶酶活力呈上升趋势，51℃后酶活力迅速下降，因此本发明乙酰酯酶最适反应温度为51℃。
本发明乙酰酯酶酶活力与pH关系：
图4为本发明乙酰酯酶酶活力在不同pH条件下的变化曲线图。可见，当pH小于8时，乙酰酯酶酶活力随pH的升高逐渐增大，当pH大于8时，乙酰酯酶酶活力随pH升高逐渐减小，因此本发明乙酰酯酶最适pH条件为8。
乙酰酯酶酶活力测定方法：将粗酶液稀释6倍，底物(2mmol/L对硝基苯乙酯)粗酶液和磷酸钠缓冲液(50 mmol/L，pH=7.0)于39℃温育15 min后，将50μL粗酶液、100μL磷酸钠缓冲液和50μL底物混合，39℃反应30 min，在415nm波长下检测吸光度，根据对硝基苯标准曲线计算乙酰酯酶的酶活力。
酶活单位定义为：1.0mL酶液在1min内将对硝基苯乙酯分解产生1μmol对硝基苯所需的酶量为1 U。