抗绿脓杆菌卵黄免疫球蛋白的产品及其应用 本发明涉及一种具有抗体活性的卵黄免疫球蛋白产品及其应用，特别是一种抗绿脓杆菌的抗体产品及应用。
绿脓杆菌属假单胞菌属，可引起全身各部位的感染，继发性感染尤为常见，是一种对人体健康危害较大的菌类。当人体因各种原因造成免疫系统机能下降时，绿脓杆菌易侵入人体，引起多种疾病或加重病人原有病症。当前虽然有某些抗生素对其有一定作用，但该菌易产生耐药性而使其失效。
本发明的目的在于提供一种具有抗体活性的抗绿脓杆菌卵黄免疫球蛋白(抗-PA IgY)的产品，并应用它们配制保健品和生物制剂，用于防治绿脓杆菌原发病和继发性感染以及用于绿脓杆菌检测诊断试剂。
本发明的目的是这样实现的：
具有抗体活性的抗绿脓杆菌卵黄免疫球蛋白(抗-PA IgY)的产品。该产品可以从以下步骤所获得：制备绿脓杆菌抗原，将绿脓杆菌抗原免疫母家禽，然后收集其所产禽卵，再从禽卵中提取卵黄免疫球蛋白。
在选择母家禽品种时可选母鸡，母鸡喂养方便且饲养成本较低。
为有效制备绿脓杆菌抗原可采用下述步骤：先从病人病灶中分离得到绿脓杆菌，继而先将其接种于普通营养肉汤培养基小管内，再分别接种于大豆酶解液培养基内培养，培养温度为37℃，收集培养液即得抗原。
从卵黄中提取卵黄免疫球蛋白，采用水稀释法较优越。此法不采用有机浸提剂，成本低，是一种无污染的提取方法。其步骤为：从禽蛋中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，静置过夜，离心取上清液，浓缩，冷冻干燥，得到卵黄免疫球蛋白。
本发明所提供的抗-PA IgY产品是由绿脓杆菌抗原免疫产卵家禽而得的，具有很强的特异性，对防治绿脓杆菌引起的原发病和继发病有良好地效果，而且免疫球蛋白类制品能增强人体免疫机能，与此相对比，绿脓杆菌易产生耐药性而使得抗生素失效。本发明采用家禽所产禽卵为载体，安全而无毒。家禽特别是母鸡易饲养和管理，便于产业化。
下面结合实施例详细说明本发明。
实施例1：具有抗体活性的抗绿脓杆菌卵黄免疫球蛋白(抗-PA IgY)的产品，可以从以下步骤所获得：制备绿脓杆菌抗原，将绿脓杆菌抗原免疫母家禽，然后收集其所产禽卵，再从禽卵中提取卵黄免疫球蛋白。
实施例2：用绿脓杆菌抗原免疫母鸡，其余步骤采用实施例1的方法。
实施例3：从病人病灶中分离得到绿脓杆菌，继而先将其接种于普通营养肉汤培养基小管内，再分别接种于大豆酶解液培养基内培养，培养温度为37℃，收集培养液即得绿脓杆菌抗原。
实施例4：从绿脓杆菌抗原免疫后的家禽所产的禽蛋中收集蛋黄，以蒸馏水稀释，静置过夜，离心取上清液，浓缩、冷冻干燥，得到卵黄免疫球蛋白(抗-PAIgY)。
实施例5：取实施例1-4提供的任何一种抗-PA IgY产品，将其稀释，分别进行间接血凝试验，单、双向琼脂扩散试验：
间接血凝试验：将抗-PA IgY稀释液加入间凝板小孔中，再加入0.5％绿脓杆菌致敏鞣酸血球一滴，然后置板于血凝微量振荡器，振摇五分钟，37℃、30分钟。可见孔中呈卷边状沉淀，即强阳性结果。
单向琼脂扩散：取抗-PA IgY稀释液注入培养器，再向其中加入2％进口琼脂液9ml，充分混匀，冷却后打孔，加入煮沸失活绿脓杆菌液，37℃、24小时后观察结果。结果可见各孔周围均形成沉淀圈。
双向琼脂扩散：在1.5％进口琼脂板上打梅花形孔。中间孔滴加抗-PA IgY稀释液，周边孔分别加入不同浓度的煮沸失活绿脓杆菌液，以及大肠杆菌灭活菌液，金黄色葡萄球菌灭活菌液，37℃、48小时后观察结果。结果可见抗-PA IgY孔与绿脓杆菌孔之间形成清晰沉淀线；而大肠杆菌孔，金黄色葡萄球菌孔与抗-PA IgY孔之间没有沉淀线。
以上结果表明了抗-PA IgY具有特异性抗绿脓杆菌作用和较高的抗体活性。同时也表明抗-PA IgY可作为绿脓杆菌的检测诊断试剂。实施例6：由于抗-PA IgY对绿脓杆菌的特异性作用和较高的抗体活性，它可用于防治绿脓杆菌原发病和继发病，将实施例1-4所提供的任何一种抗-PA IgY产品用于防治绿脓杆菌引起的呼吸道感染，肺炎，中耳炎，角膜炎，尿道炎，心内膜炎，胃肠炎，败血症以及烧伤和创伤的绿脓杆菌继发性感染。实施例7：由抗-PA IgY产品组成的用于防治绿脓杆菌原发病和继发性感染的保健品和生物制剂。实施例8：含有抗-PA IgY的产品用于防治绿脓杆菌原发病和继发性感染的保健品和生物制剂。实施例9：应用抗-PA IgY产品制备防治绿脓杆菌原发病和继发性感染的保健品和生物制剂。实施例10：将抗-PA IgY用于防治门脉高压所致的肠道细菌易位，增强人体免疫机能。
肝硬变患者易于发生主要由肠道细菌引起的自发性菌血症和腹膜炎，门脉高压导致肠壁充血，水肿和肠内细菌过度增殖，促使肠腔内细菌向区域淋巴结或全身循环播散，即细菌易位。实验表明，肠道细菌易位是肝硬变自发性腹膜炎的一个重要早期过程。
以SD大鼠为研究对象，随机分为以下三组：
门脉高压防治组：实验前胃内灌注所配抗-PA IgY2ml，每日一次，连续三天；形成门脉高压模型前24小时经胃灌入绿脓杆菌活菌液108/kg；完成模型8小时后再经胃灌入抗-PA IgY2ml；48小时后1％戊巴比妥麻醉，无菌操作取所需标本备检。
门脉高压组：实验前不作特殊处理，于形成模型前24小时经胃灌入绿脓杆菌活菌液108/kg；完成模型48小时后，1％戊巴比妥麻醉，无菌操作取所需标本备检。
对照组：经胃灌入绿脓杆菌活菌液108/kg,24小时后，分离门静脉但不缩窄，标本采集同门脉高压防治组。
以上三组SD大鼠分别于术后两天取肠系膜淋巴结、门静脉血和心血作细菌培养，对肠道细菌定量培养，光镜下观察肝、回肠病理改变。结果表明：门脉高压组肠系膜淋巴结和门脉血细菌检出率明显升高，但外周血培养为阴性；门脉血内毒素水平显著升高且门体循环内毒素有显著差异，肠内容物内毒素水平明显升高；肠道菌量明显增高；肉眼观察，肝脏表面光滑，色泽红润，质软，回肠扩张，平滑肌松驰，腔内充满液体和气体，肠壁淤血，还可见面部肠粘膜糜烂，出血，光镜下，肝脏轻度浮肿，灶性淋巴细胞浸润，肝小叶结构及肝细胞形态基本完整；回肠病理改变显著，肠上皮细胞坏死脱落，少量炎性细胞浸润，粘膜轻度淤血，出血。门脉高压防治组其肠系膜淋巴结、门脉血细菌检出率明显降低，血及肠内容物内毒素水平显著下降，肠道细菌过度增殖明显受抑，肝、回肠病理改变显著减轻。
由以上试验可见，门脉高压促使肠道细菌和内毒素易位，门脉高压所致肠粘膜屏障功能受损，肠道微生态平衡的破坏和肠源性内毒素血症是细菌易位的重要促发因素，抗-PA IgY能够减轻肠粘膜损伤，维护肠道微生态平衡和降低内毒素水平，具有防治肠道细菌、内毒素易位的作用。实施例11：采用烧伤大鼠绿脓杆菌肠源性感染动物模型，用给烧伤大鼠口服特异性抗-PA IgY的方法，考察其对严重烧伤大鼠肠源性感染的影响。
将健康SD大鼠随机分为对照用的正常组，对照用的烧伤组及抗-PA IgY预防组：
大鼠禁食8小时后，胃管内注入1.5％ NaHCO3 1ml，待一分钟后注入108CFU/ml的绿脓杆菌的菌悬液(1ml/100g)，自由进食。给菌后8小时，氯胺酮肌肉注射(30mg/kg)麻醉下，背部10％ Na2S脱毛。正常组不作任何处理。烧伤组及IgY预防组用100℃不锈钢块接触脱毛区20秒，造成25％TBSA三度烧伤。伤后立即腹腔注射生理盐水(3ml/100g)抗休克，创面立即涂布磺胺嘧啶银霜剂，每24小时一次。IgY组烧伤后立即管饲抗-PA IgY2ml，每12小时重复一次，直到动物处死。烧伤组则管饲等容量生理盐水。动物单笼管理，自由饮水，24小时后自由进食。三组动物均于致伤后24小时及48小时活杀，解剖，进行各项试验：
试验结果表明，烧伤后应用抗-PA IgY预防使门脉血内毒素含量显著下降。烧伤后24小时，48小时两个时相点均可反映出：烧伤组门脉血内毒素含量显著高于正常组( P＜0.01)；IgY组门脉血内毒素含量显著低于烧伤组(P＜0.01)；IgY组门脉血内毒素含量与正常组内毒素含量无差异(P＞0.05)。另外，肠系膜淋巴结细菌培养正常组均为阴性，烧伤组烧伤后24小时，48小时肠系膜淋巴结细菌易位发生率分别为85.7％，80％，与IgY组相比0％,20％,P＜0.01烧伤组与IgY组烧伤后血培养结果经统计分析P＜0.01。
结合形态学观察，表明肠源性感染的严重程度与肠粘膜病理改变基本一致。血中细菌培养阳性表明严重烧伤后可导致脓毒症。由此，试验证明：在此动物模型上，使用抗-PA IgY后血浆内毒素明显下降，肠粘膜淋巴结细菌培养阳性率降低，肠道物理屏障得到保护，从而减少了肠源性感染的发生。抗-PA IgY使用方便，可加入患者饮用水中服用，这是其它肠源性感染防治手段不可比拟的。