用于液体转移控制的染料组合物.pdf

发明内容

本发明的一个方面是用于组合物比率控制的试剂盒，所述试剂盒包括

a)具有第一亲和基团的第一染料，所述第一染料可被第一激发光激发而发出辐射或转移能量至第二染料，以及

b)具有第二亲和基团的第二染料，所述第二染料可被第二激发光激发或被来自第一染料的能量转移激发，

其特征在于，所述第一染料和所述第二染料是如此设置的

-所述第一亲和基团和所述第二亲和基团具有相互结合的亲和力，其中所述染料之间的能量转移是在所述第一亲和基团与所述第二亲和基团结合结合后实现的，以及

-所述第一染料和所述第二染料的混合物在被所述第一激发光或所述第二激发光激发后发出辐射，其中所述辐射是所述第一染料和所述第二染料的组合物比率的量度。

本发明通篇使用的术语“能量转移”用于概述本领域技术人员已知的所有非辐射能量转移。所述能量转移的一个众所周知的实施方式是荧光共振能量转移(FRET)。在此，最初位于其电子激发态的供体生色团，可经过非辐射偶极-偶极耦合转移能量至受体生色团(紧密接近的，通常＜10nm)。

另一种可能的能量转移是光诱导电子转移(PET)。在该过程中，从受激荧光染料的激发态接受电子，或者供给电子到受激荧光染料的激发态，这导致自由基离子对的形成，接着，所形成的自由基离子对经由无辐射电荷重组而返回基态。

取决于所使用的染料类型，本发明通篇所述第一亲和基团和所述第二亲和基团的结合可为可逆的或不可逆的。

本发明通篇，由染料混合物在被激发光激发后发出的辐射可为受激染料本身的辐射或其他染料的辐射，所述其他染料没有被激发光激发但直接被来自最初受激染料的能量转移激发。

术语“染料”用于概述所有类型的吸收光分子，因此包括荧光染料、非荧光染料和猝灭剂分子。

猝灭剂分子能够猝灭荧光染料的荧光，因为它们可被荧光和分散能量例如被热激发。非荧光染料(也被称为暗供体分子(dark donormolecules))为基本上没有荧光发射的染料，不同于传统荧光染料。

此外，对荧光发射具有猝灭性质的芳香或杂芳结构也可用于本发明。这些分子结构能够经由光诱导电子转移(PET)过程从荧光染料吸收能量。杂芳结构的实例是例如简单分子结构如鸟嘌呤、脱氮鸟嘌呤(参见实施例2)或异鸟苷(iso Guanosin)可被加入到亲和基团中。

同样，吲哚衍生物如蛋白质中的色氨酸或被并入脱氧核苷(desoxyribosid)衍生物中的硝基吲哚(nitroindol)为众所周知的具有猝灭性质的化合物。此外，Nitroaromates如2，4-二硝基苯基苯胺衍生物可商购获得作为寡核苷酸(作为亚磷酰胺(phosphoramidte))标记试剂和蛋白质标记(作为NHS酯)，也能够猝灭荧光体。

因此，本发明的另一方面是用于组合物比率控制的试剂盒，所述试剂盒包括

a)具有第一亲和基团的荧光染料，所述第一染料可被第一激发光激发而转移能量至芳香或杂芳结构，以及

b)具有第二亲和基团的芳香或杂芳结构，所述芳香或杂芳结构可被来自所述第一染料的能量转移激发，如此，所述芳香或杂芳结构阻止所述荧光染料的荧光发射，

其特征在于，所述第一染料和所述芳香或杂芳结构是如此设置的

-所述第一亲和基团和所述第二亲和基团具有相互结合的亲和力，其中所述染料和所述芳香或杂芳结构之间的能量转移是在所述第一亲和基团和所述第二亲和基团结合后实现的，以及

-所述第一染料和所述芳香或杂芳结构的混合物在被所述第一激发光激发后发出辐射，其中所述辐射是所述第一染料和所述芳香或杂芳结构的组合物比率的量度。

本发明通篇，可将依照本发明的试剂盒的染料加入到需被混合用于随后反应的组分中，在该情况中，组合物比率控制针对所述组分的组合物。这样的组分是例如试剂、缓冲剂、生物组分或样品。

本发明的再一方面是用于组合物比率控制的试剂盒，其包括

a)包含具有第一亲和基团的第一染料的第一组分，所述第一染料可被激发光激发而发出辐射或转移能量至另一组分，以及

b)包含具有第二亲和基团的第二染料的第二组分，所述第二染料可被辐射激发或来自所述第一染料的能量转移激发，

其特征在于，所述第一组分和所述第二组分将以预定的组合物比率组合，

其中所述组合物比率是可经由测量所述染料在被激发光激发后发出的辐射控制的，以及

其中所述第一亲和基团和所述第二亲和基团被设计为可互相结合，其中所述染料之间的能量转移是在所述第一亲和基团和所述第二亲和基团结合后实现的。

依照本发明的这样的试剂盒概述了所有种类的、含复数种在进行某一生产过程或分析试验之前需被混合的组分的试剂盒。当然，这样的试剂盒具有至少两种组分，每一种组分包含某一染料，然而所述组分是例如试剂、缓冲剂或生物化合物。

本发明的又一方面是具有取决于光发射的组合物比率的染料组合物，所述染料组合物包括

a)具有第一亲和基团的第一染料，所述第一染料可被激发光激发而发出辐射或转移能量至另一组分，以及

b)具有第二亲和基团的第二染料，所述第二染料可被辐射激发或来自所述第一染料的能量转移激发，

其特征在于，所述第一染料和所述第二染料是如此提供的

-所述第一亲和基团和所述第二亲和基团具有相互结合的亲和力，其中所述染料之间的能量转移是在所述第一亲和基团和所述第二亲和基团结合后实现的，以及

-染料组合物在被激发光激发后发出的辐射是所述第一染料和所述第二染料的组合物比率的量度。

本发明的再一方面是使用依照本发明的试剂盒检验两种组分组合物比率的方法，所述方法包括下列步骤

a)混合两种组分，其中第一组分包含具有所述第一亲和基团的第一染料，第二组分包含具有所述第二亲和基因的第二染料，

b)在用激发光激发后，在这样的条件下进行第一辐射测量，在该条件下所述第一染料和所述第二染料未经由所述亲和基团结合，

c)在用激发光激发后，在这样的条件下进行第二辐射测量，在该条件下所述第一染料和所述第二染料经由所述亲和基团结合，以及

d)比较步骤b)和步骤c)中的两次辐射测量以检验所述两种组分的组合物比率。

上述方法描述了关于混合两种组分的要点，但本领域的技术人员将理解该方法也可用于更多组分。例如，可使用包含第三染料的第三组分，所述第三染料需具有与第一染料和第二染料相比不同的辐射波长。如果需检验四种组分的比率，则可使用依照本发明的两种试剂盒，如此，第一染料和第二染料具有相互结合的亲和力，然而第三染料只具有与第四染料结合的亲和力。

如果依照本发明方法的该实施方式是顺着步骤a)-d)的进展而进行的，则染料需在混合之后以结合的状态以及的非结合状态存在，因此，两种各个亲和基团的结合必然是可逆的。

本发明的又一方面是使用依照本发明的试剂盒检验两种组分的组合物比率的方法，所述方法包括下列步骤

a)混合两种组分，其中第一组分包含具有所述第一亲和基团的第一染料，第二组分包含具有所述第二亲和基团的第二染料，

b)在用激发光激发后，在这样的条件下进行第一辐射测量，在该条件下所述第一染料和所述第二染料是结合的，所述第一荧光测量是应用所述第二染料特异性的激发波长并测量所述第二染料的发射强度而进行的，以及

c)在用激发光激发后，在这样的条件下进行第二辐射测量，在该条件下所述第一染料和所述第二染料是结合的，所述第二荧光测量是应用所述第一染料特异性的激发波长并测量所述第二染料的发射强度而进行的，以及

d)比较步骤b)和步骤c)中的两次辐射测量以检验所述两种组分的组合物比率。

在依照本发明的该方法中，两次辐射测量是在染料经由它们的亲和基团相互结合的情况下进行的。当然，在此可能但不必要的是，两种各个亲和基团的结合可为可逆的。

如之前所述，芳香或杂芳结构也可用于替代染料，因此，本发明的另一方面是使用依照本发明的试剂盒检验两种组分组合物比率的方法，所述方法包括下列步骤

a)混合两种组分，其中第一组分包含具有所述第一亲和基团的荧光染料，第二组分包含具有所述第二亲和基团的芳香或杂芳结构，

b)在用激发光激发后，在这样的条件下进行第一辐射测量，在该条件下所述荧光染料和所述芳香或杂芳结构未经由所述亲和基团相互结合，所述第一辐射测量是应用所述荧光染料特异性的激发波长并测量所述荧光染料的发射强度而进行的，

c)在用激发光激发后，在这样的条件下进行第二辐射测量，在该条件下所述荧光染料和所述芳香或杂芳结构经由所述亲和基团相互结合，所述第二辐射测量是应用所述荧光染料特异性的激发波长并测量所述荧光染料的发射强度而进行的，以及

d)比较步骤b)和步骤c)中的两次辐射测量以检验所述两种组分的组合物比率。

发明详述

本发明的一个方面是用于组合物比率控制的试剂盒，所述试剂盒包括

a)具有第一亲和基团的第一染料，所述第一染料可被第一激发光激发而发出辐射或转移能量至第二染料，以及

b)具有第二亲和基团的第二染料，所述第二染料可被第二激发光激发或来自第一染料的能量转移激发，

其特征在于，所述第一染料和所述第二染料是如此设置的

-所述第一亲和基团和所述第二亲和基团具有相互结合的亲和力，其中所述染料之间的能量转移是在所述第一亲和基团与所述第二亲和基团结合结合后实现的，以及

-所述第一染料和所述第二染料的混合物在被所述第一激发光或所述第二激发光激发发出辐射，其中所述辐射是所述第一染料和所述第二染料的组合物比率的量度。

下面描述了许多优选的亲和基团，它们均适用于依照本发明的试剂盒。如图1所说明的，含其亲和基团的染料均被设计为染料经由亲和基团而相互直接结合。当然，本申请通篇，亲和基团的相互结合必须被理解为相互直接的或特异性的结合，因此，亲和基团经由第三分子的间接结合不是本发明的一部分。

依照本发明的优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述第一亲和基团是生物素基团，所述第二亲和基团是抗生蛋白链菌素(streptavidin)基团。

依照本发明的另一优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述第一亲和基团是地高辛配基(digoxigenin)基团，所述第二亲和基团是抗-地高辛配基抗体。

依照本发明的再一优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述第一亲和基团是凝集素(lectine)，所述第二亲和基团是糖。

依照本发明的另一优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述第一亲和基团是抗体，所述第二亲和基团是半抗原。

依照本发明的又一优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述第一亲和基团是第一寡核苷酸，所述第二亲和基团是与所述第一寡核苷酸互补的第二寡核苷酸。

优选使用寡核苷酸作为亲和基团，因为易于通过调节溶液温度至高于或低于各个杂交体(hybrid)的解链温度而在这些分子的结合状态和非结合状态之间切换。

本发明通篇，术语寡核苷酸被用于包括DNA、RNA以及寡核苷酸类似物，因而，唯一的要求(prerequest)是这样的类似物仍然能够相互形成稳定的双链体(duplex)。这样的寡核苷酸类似物可容许(compromise)不同的修饰(modifications)。

一类类似物是在核苷碱基(nucleobase)上有取代基的天然核苷酸dA、dG、dC、dT、dU的衍生物。实例是：

5-取代的嘧啶，诸如5-甲基-dC、5-氨基烯丙基-dU或-dC、5-(氨乙基-3-丙烯基亚胺)-dU、5-丙炔基-dU或-dC、5卤代-dU和dC，

N4取代的胞苷，例如N4-乙基-dC，

N取代的嘌呤，例如N6-乙基-dA、N2-乙基-dG，

8取代的嘌呤，例如8-[(6-氨基)-己-1-基]-8-氨基-dG或dA，8卤代-dA或-dG、8-烷基dG或dA，或

2取代的dA，诸如2氨基-dA。

一类类似物是在核糖部分有取代基的天然核苷酸dA、dG、dC、dT、dU的衍生物。实例是：

2’甲氧基、2’氟代、2’甲基硒基dU，2’烯丙氧基、4’甲基dU、dT、dU、dA、dG。

另一类是这样的类似物，其中其他核苷碱基(非标准的)而不是标准碱基A、G、C、T、U连接于脱氧核糖部分或连接于标准碱基连接于糖类似物的地方，或两种的组合，其中其他核糖碱基而不是标准碱基连接于糖类似物。

非标准糖连接于脱氧核糖的实例是：5-硝基吲哚-脱氧核糖、3硝基吡咯-脱氧核糖、7-脱氮-dG和-dA、-dI、-dX、7-脱氮-8-氮杂-dG和dA、-dI、-dX、8-氮杂-dA、-dG、-dI、-dX、d间型霉素(Formycin)、假-dU。假-异-dC、4-硫-dT、6-硫-dG、2-硫-dT、异-dG、5-甲基-异-dC、5，6-二氢-5-氮杂-dC、亚乙烯基-dA、pyrollo-dC。

糖类似物选自：木糖、2’，4’桥连核糖(bridged Ribose)如2′-O，4′-C亚甲基(称作LNA的低聚物)或2′-O，4′-C乙烯(称作ENA的低聚物)、L-2脱氧核糖、己糖醇(称作HNA的低聚物)、环己烯(称作CeNA的低聚物)、阿卓糖醇(称作ANA的低聚糖)、三环核糖类似物(C3′和C5′原子通过乙烯桥连接稠和成环丙烷环)(称作三环DNA的低聚物)、丙三醇(glycerin)(称作GNA的低聚物)、吡喃型葡萄糖(称作同源DNA的低聚物)、carbaribose(具有环戊烷代替四氢呋喃亚单位)和吗啉(称作吗啉代DNA的低聚物)。

这样的核苷酸类似物可进一步地衍生，例如7-炔丙基-7-脱氮G或5-氨基烯丙基-己糖醇-U、2’-氟-d(L)-核糖。

另一类类似物是寡核苷酸，其中核苷酸间的磷酸桥被修饰为如硫代磷酸酯(phosphorthioate)-、甲基膦酸酯-或氨基磷酸酯寡核苷酸。

另一类寡核苷酸容许含肽键的主链，众所周知的实例为PNA。PNA的主链由通过肽键连接的重复N-(2-氨乙基)-甘氨酸单位组成。

如果使用依照本发明的取决于染料混合物光发射的比率检验用于随后PCR扩增的组分比率，则特别优选使用L-核苷酸用作亲和基团。这样的具有L-构型的糖代替D-构型的天然核苷酸的L-核苷酸，仍然提供了它们的杂交性质，但聚合酶不再识别这些分子。当然，这样的L-核苷酸仍可用作亲和基团，而不潜在地影响PCR反应。

上述对L-核苷酸而言相同的正交影响可使用GNAs、同源DNA和容许正交碱基对的寡核苷酸(如异dG和异dC)而达到。

依照本发明的一种更优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述寡核苷酸由L-核苷酸组成。

本发明通篇，可使用染料的复数种组合，下面描述了一些不限制本发明范围的适宜组合。所述第一染料(I)和所述第二染料(II)的不同组合在图1中进行了说明，其中图1a包括需要所述染料以非结合状态(左)以及结合状态(右)存在的实施方式，其中图1b包括需要所述染料只以结合状态存在的实施方式。

依照本发明的优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述第一染料是荧光染料，所述第二染料是猝灭剂分子，所述猝灭剂分子在结合亲和基团后被来自所述荧光染料的能量转移激活，如此，所述猝灭剂分子阻止所述荧光染料的荧光发射。

该猝灭实施方式的一种特别情况是所谓的自猝灭装置，其中所述荧光染料和所述猝灭剂分子是相同的分子，一个荧光染料被另一个猝灭。这种自猝灭经由染料-染料相互作用而发生，所述染料-染料相互作用是通过使荧光分子紧密接近例如通过增加染料浓度超过某一限度而诱导的。大多数的荧光染料提供这种自猝灭性质，特别是若丹明(Rhodamines)、Bora diazaindacenes(称作Bodipy-染料)、酞菁(Cyanines)、荧光素或噁嗪类。

因此，依照本发明的另一优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述荧光染料和所述猝灭剂分子是相同的分子。

在本发明的该实施方式中，荧光染料将被具有适宜波长(ExλI)的激发光激发，并将监测所述荧光染料(EmλI)的荧光发射(图1a/ii)。如果荧光染料和猝灭剂分子未相互结合，则将监测荧光发射(EmλI)，该发射的强度是荧光染料量的量度。如果荧光染料和猝灭剂分子相互结合，则荧光发射将被猝灭剂分子猝灭。当然，荧光发射(EmλI)将被降低，强度降低是猝灭剂分子的量的量度。

依照本发明的另一优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述第一染料是第一荧光染料，所述第二染料是第二荧光染料，所述第二荧光染料在较所述第一荧光染料更长的波长处有最大激发，其中所述第二荧光染料可在结合亲和基团后被来自所述荧光染料的能量转移激发，如此，所述第二荧光染料发射荧光的波长不同于所述第一荧光染料的波长。

在该实施方式中，使用了两种具有不同激发波长的荧光染料。在结合的亲和基团的情况中，使用第一荧光染料的特异性激发(ExλI，几乎不直接激发第二荧光染料)，发生能量转移至第二荧光染料，如此，第二荧光染料的特异性荧光发射(EmλII)变得可检测(图1a/i)。另一方面，基于ExλI的激发、采用非结合亲和基团，没有特异性于第二荧光染料的荧光发射(EmλII)变得可检测，但只有使用ExλII作为激发，EmλII才变得可检测。当然，该荧光发射将成为第一荧光染料和第二荧光染料比率的量度。

依照本发明的另一优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述第一染料是非荧光染料，所述第二染料是荧光染料，所述荧光染料可在结合亲和基团后被来自所述非荧光染料的能量转移激发，如此，所述荧光染料发出荧光。

该实施方式与之前所述采用两种荧光染料的实施方式相似，只是被其特异性激发(ExλI)激发的非荧光染料其自身基本上不发出特异性的荧光发射。本发明通篇所用的术语--非荧光染料类似于US2007/0077588中的描述，即非荧光染料是基本上没有荧光发射的染料，不同于经由荧光发出其大部分能量的传统荧光染料。只有在结合的亲和基团的情况中，第二荧光特异性的荧光发射(EmλII)才变得可检测，如果在使用其特异性的激发波长(ExλI，几乎没有第二荧光染料的直接激发)特异性激发第一非荧光染料后，发生能量转移至第二荧光而发出第二荧光染料特异性的荧光发射(EmλII，图1a/iii)。在非结合的亲和基团的情况中，在ExλI激发后，没有第二荧光染料特异性的荧光发射变得可检测，但只有使用ExλII作为激发，EmλII才变得可检测。当然，该荧光发射将成为非荧光染料和荧光染料比率的量度。这样的非荧光染料也可被指定为暗供体分子。

如之前所述，依照本发明的试剂盒的染料可被加入到需要被混合用于随后反应的组分中，在这种情况中，组合物比率控制是指所述反应组分的组合物。当然，所述反应组分可能是依照本发明的试剂盒的一部分。

依照本发明的一种优选试剂盒进一步包括第一反应组分。

为了使用所述试剂盒的染料用于所述反应组分和样品(不是该试剂盒一部分)的组合物比率控制，必需向所述样品中加入一种染料，其他染料需要在所述反应组分的范围之内。本发明通篇，含染料的反应组分可以至少两种不同的方式提供。

在依照本发明的一种更优选试剂盒中，所述第一反应组分包括所述第一染料。

在依照本发明的另一更优选试剂盒中，所述第一染料可在使用所述第一反应组分之前加入到所述第一反应组分中。

依照本发明的另一优选试剂盒进一步包括第二反应组分，所述第二反应组分任选地包括所述第二染料。

本领域的技术人员将理解，包括染料和反应组分的许多不同试剂盒落于本发明的范围之内，下面列出了几种那些试剂盒作为实例。

依照本发明的一种优选试剂盒是PCR试剂盒，其中所述第一反应组分是包括所述第一染料的主混合物，所述第二反应组分是包括待加入到样品中的所述第二染料的缓冲溶液，所述样品包括待扩增的靶。备选地，第一反应组分或第二反应组分可为所述PCR要求的检测混合物。

依照本发明的另一优选试剂盒是样品配制试剂盒，其中所述第一反应组分是包括所述第一染料的裂解/结合缓冲液，所述第二反应组分是包括所述第二染料的磁性小珠溶液。备选地，第一反应组分或第二反应组分是包括待加入到样品溶液中的所述第二染料的缓冲溶液。

依照本发明的另一优选试剂盒是免疫试验试剂盒，其中所述第一反应组分是包括所述第一染料的特异性抗体，所述第二反应组分是包括所述第二染料的用于检测的抗体缀合物。备选地，第一反应组分或第二反应组分是包括待加入到样品溶液中的所述第二染料的缓冲溶液。

如之前所述，某些分子结构(如芳香或杂芳结构)也可用作本发明的猝灭化合物，只要它们具有猝灭荧光发射的性质(参见实施例2)。

因此，依照本发明的另一实施方式是用于组合物比率控制的试剂盒，所述试剂盒包括

a)具有第一亲和基团的荧光染料，所述第一染料可被第一激发光激发而转移能量至芳香或杂芳结构，以及

b)具有第二亲和基团的芳香或杂芳结构，所述芳香或杂芳结构可被来自第一染料的能量转移激发，如此，所述芳香或杂芳结构阻止所述荧光染料的荧光发射，

其特征在于，所述第一染料和所述芳香或杂芳结构是如此设置的

-所述第一亲和基团和所述第二亲和基团具有相互结合的亲和力，其中所述染料和所述芳香或杂芳结构之间的能量转移是在所述第一亲和基团和所述第二亲和基团结合后实现的，以及

-所述第一染料和所述芳香或杂芳结构的混合物在所述第一激发光激发后而发出辐射，其中所述辐射是所述第一染料和所述芳香或杂芳结构的组合物比率的量度。

依照本发明的一种优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述第一亲和基团是第一寡核苷酸，所述第二亲和基团是与所述第一寡核苷酸互补的第二寡核苷酸。

依照本发明的另一优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述寡核苷酸由L-核苷酸组成。

依照本发明的再一优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述杂芳结构是包括鸟嘌呤、脱氮鸟嘌呤、异鸟嘌呤或7脱氮异鸟嘌呤的结构。依照本发明的一种更优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中所述杂芳结构是含鸟嘌呤或7-脱氮鸟嘌呤作为核苷碱基的结构。依照本发明的一种还更优选试剂盒是这样一种试剂盒，其中超过一种的核苷酸是与同源低聚寡核苷酸例如(dG)3(在寡核苷酸序列文本中也写作GGG)或(7-脱氮dG)3组合的。备选地，硝基吲哚脱氧核糖核苷(众所周知的通用碱基)或其同源低聚物可用作猝灭化合物。

本发明的再一方面是使用依照本发明的试剂盒检验两种组分的组合物比率的方法，所述方法包括下列步骤

a)混合两种组分，其中第一组分包含具有所述第一亲和基团的第一染料，第二组分包含具有所述第二亲和基团的第二染料，

b)在用激发光激发后，在这样的条件下进行第一辐射测量，在该条件下所述第一染料和所述第二染料未经由所述亲和基团结合，

c)在用激发光激发后，在这样的条件下进行第二辐射测量，在该条件下所述第一染料和所述第二染料经由所述亲和基团结合，以及

d)比较步骤b)和步骤c)中的两次辐射测量以检验所述两种组分的组合物比率。

为了进行检验依照本发明的两种组分组合物比率方法的该实施方式，有必要测量两种染料以结合状态以及非结合状态存在的辐射，如果所述方法的步骤是顺着上面步骤a)-d)的进展而进行的，则必要的是两种亲和基团的结合是可逆的。取决于所使用的亲和基团，本领域的技术人员将知道允许或阻止该结合的操作。

如之前所述关于本发明试剂盒的实施方式，亲和基团均被设计为经由它们的亲和基团的特异性结合而实现染料相互之间的直接结合(参见图1)。此外，本领域的技术人员将理解，亲和基团相互之间的这种特异性结合对进行本发明的方法而言是必要的，因为否则，染料的某一部分可能结合于组分的其他成分，如此，它们将不可再用于比率控制测量，这将产生假结果。当然，本发明的亲和基团被如此设计以至于没有组分的其他成分的干扰，但只有相互之间的特异性结合发生。因此，本领域的技术人员将理解，所述第一染料和所述第二染料必须经由所述亲和基团而相互特异地结合，如果达到正确的条件。在依照本发明的另一优选方法中，步骤b)中所述第一辐射测量是在组合物参数下进行的，如此阻止了所述第一亲和基团和所述第二亲和基团之间的结合。

本发明通篇，可调节的组合物参数为例如温度、pH或组合物的摩尔浓度。在使用寡核苷酸作为亲和基团的优选实施方式中，该结合可通过调节组合物温度而被触发，如此温度高于或低于各个杂交体的解链温度。

备选地，上面步骤a)-d)的进展可被如此改进以至于第一辐射测量是在混合两种组分之前进行的。该实施方式具有这样的优点，即也可使用具有不可逆结合的亲和基团。

在依照本发明的一种优选方法中，步骤b)中所述第一辐射测量是采用所述第一组分在步骤a)中混合两种组分之前进行的。

取决于用于本发明的染料，可使用激发波长和发射波长的几种不同组合。

在依照本发明的再一优选方法中，步骤b)中所述第一辐射测量是应用所述第一染料特异性的激发波长并测量所述第一染料的发射强度而进行的。

可采用只有第一染料以非结合状态存在或两种染料均以非结合状态进行该第一辐射测量。对使用非荧光染料的实施方式而言，没有基于激发的可检测的发射强度。

在依照本发明的一种更优选方法中，没有所述第一染料的发射强度是可测量的，如果所述第一染料是非荧光染料。

备选地，可采用第二荧光染料特异性的激发和发射波长进行第一辐射测量，如果两种染料均以非结合状态存在。

依照本发明的一种优选方法是这样一种方法，其中步骤b)中所述第一辐射测量是应用所述第二染料特异性的激发波长并测量所述第二染料的发射强度而进行的。

此外，有可能采用第一染料特异性的激发波长和第二染料特异性的发射波长进行第一辐射测量，如果两种染料均以非结合状态存在。

取决于第一辐射测量，第二辐射测量是优选改造(adapted)的，如此，在两次测量中测量的是相同的发射波长。

依照本发明的另一优选方法是这样一种方法，其中步骤c)中所述第二辐射测量是应用所述第一染料特异性的激发波长并测量所述第二染料的发射强度而进行的。

依照本法的再一优选方法是这样一种方法，其中步骤c)中所述第二辐射测量是应用所述第二染料特异性的激发波长并测量所述第二染料的发射强度而进行的。

当然，如果第二辐射测量是基于第二染料特异性的波长的，则优选第一辐射测量也基于第二染料特异性的相同波长。该实施方式的染料组合例如染料/染料组合(参见图1a/i)或非荧光染料/染料组合(参见图1a/iii)。

依照本发明的又一优选方法是这样一种方法，其中步骤c)中所述第二辐射测量是应用所述第一染料特异性的激发波长并测量所述第一染料的发射强度而进行的。

当然，如果第一辐射测量是基于第一染料特异性的激发波长的，则优选第二辐射测量也基于第一染料特异性的相同波长。该实施方式的染料组合例如染料/猝灭剂组合(参见图1a/ii)。

本发明的又一方面是检验依照本发明的两种组分的组合物比率的方法，所述方法包括下列步骤

a)混合两种组分，其中第一组分包含具有所述第一亲和基团的第一染料，第二组分包含具有所述第二亲和基团的第二染料，

b)在用激发光激发后，在这样的条件下进行第一辐射测量，在该条件下所述第一染料和所述第二染料是结合的，所述第一荧光测量是应用所述第二染料特异性的激发波长并测量所述第二染料的发射强度而进行的，以及

c)在用激发光激发后，在这样的条件下进行第二辐射测量，在该条件下所述第一染料和所述第二染料是结合的，所述第二荧光测量是应用所述第一染料特异性的激发波长并测量所述第二染料的发射强度而进行的，以及

d)比较步骤b)和步骤c)中的两次辐射测量以检验所述两种组分的组合物比率。

在检验依照本发明的两种组分组合物比率方法的该实施方式中，两次辐射测量是采用亲和基团以结合状态存在而进行的(参见图1b)。因为能量转移只在一个方向上发生，有可能甚至在结合状态下，测量独立于其它染料的染料中的一种。

在依照本发明的一种更优选方法中，具有所述第一亲和基团的所述第一染料和具有所述第二亲和基团的所述第二染料之间的所述结合是可逆的。

因为对两次辐射测量而言，染料均以结合状态存在，因此，有可能但不是必要的，即两种亲和基团之间的结合是不可逆的。

本发明的再一方面是使用依照本发明的试剂盒检验两种组分的组合物比率的方法，所述方法包括下列步骤

a)混合两种组分，其中第一组分包含具有所述第一亲和基团的荧光染料，第二组分包含具有所述第二亲和基团的芳香或杂芳结构，

b)在用激发光激发后，在这样的条件下进行第一辐射测量，在该条件下所述荧光染料和所述芳香或杂芳结构未经由所述亲和基团相互结合，所述第一辐射测量是应用所述荧光染料特异性的激发波长并测量所述荧光染料的发射强度而进行的，

c)在用激发光激发后，在这样的条件下进行第二辐射测量，在该条件下所述荧光染料和所述芳香或杂芳结构经由所述亲和基团相互结合，所述第二辐射测量是应用所述荧光染料特异性的激发波长并测量所述荧光染料的发射强度而进行的，以及

d)比较步骤b)和步骤c)中的两次辐射测量以检验所述两种组分的组合物比率。

依照本发明的一种优选方法是这样一种方法，其中步骤b)中所述第一辐射测量是采用所述第一组分在步骤a)中混合两种组分之前进行的。

依照本发明的另一优选方法是这样一种方法，其中步骤b)中所述第一辐射测量是在组合物参数下进行的，如此阻止了所述第一亲和基团和所述第二亲和基团之间的结合。