活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊及其制备方法 本发明涉及生物化学领域，更详细地是活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊及其制备方法。
双歧杆菌是人体肠道的主要有益菌群。这些有益菌不仅在防治肠道菌群失调症和其它老年病上有独特作用，而且在抑制致病菌的生长与入侵、改善消化功能、提供营养、降低血清胆固醇、提高机体免疫力、抗肿瘤等作用都是公认的。双歧杆菌制品，正是利用双歧杆菌这种人体自身优势生理细菌制成活菌制剂，再经口服回归人体原来的生境(肠道)中，达到调节或维持机体正常生理功能的制品，又称为微生态制剂。医学界普遍认为，通过微生态制剂来调节人体消化道的功能，是发展保健功能性食品中最重要最有前景的部分。随着对双歧杆菌有益于人体健康研究的不断积累，随着现代人追求健康饮食需求的不断扩大，各种利用活性双歧杆菌的功能性食品或医用微生态制剂相继推出并日渐普及。目前国外已有70种以上的产品问世，其中大多数为乳制品。在日本，双歧杆菌制品占总酸乳量的三分之一。日本健康食品协会将含双歧杆菌的功能食品列为健康食品，并指明双歧杆菌可用于产妇食品及幼儿特殊营养食品中。在欧洲，双歧杆菌制品也已成为发酵乳制品中发展最快的部分。我国从90年代初开始将双歧杆菌用于各种健康食品中，如三株口服液、双歧天宝口服液等，也将双歧冻干菌粉作为药用微生态制剂用于治疗肠道疾病，如丽珠肠乐等。
医用或保健用微生态制剂所使用的双歧杆菌菌种有；婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌等。国内现有微生态制剂均采用单一种双歧杆菌，如“回春生”、“丽珠肠乐”是使用单一的青春双歧杆菌，也有用单一种双歧杆菌再与其它乳酸杆菌配合的制剂，如“培菲康”(两歧双歧杆菌、粪链球菌和乳酸杆菌)、“三株口服液”等。
现有微生态制剂的一般生产工艺过程包括：
——种子培养：将经过选育纯化的双歧杆菌菌种，按其生长条件要求(营养、pH、温度、厌氧等)，进行逐级扩大培养，先制成种子液；
——发酵培养：将种子液接入经灭菌冷却的发酵罐培养基中，进行厌氧发酵培养，使双歧杆菌大量增殖；
——离心集菌：待发酵液中的菌体生长量达高峰时(对数生长期未期)，在无杂菌感染条件下，高速离心收集湿菌体；
——菌体冻干：在湿菌体中加入冻干保护剂，移入冻干机中进行冷冻真空干燥，成为冻干菌粉(含活性菌)；
——制成制剂：冻干菌粉可添加入大量辅料，压成片剂或分装入硬胶囊中，成为治疗型或保健型微生态制剂。
液态微生态制剂则是在发酵培养后，不离心收集活菌体，而直接进行灌装，成为瓶装或杯装活菌制剂，需低温贮存销售。
双歧杆菌虽具有前述独特的保健功效，但它最突出的缺点是：
1、对营养条件要求高，对氧极为敏感，对低pH值耐性差，容易失活。双歧杆菌液体制剂在几天内活菌数就会下降一个数量级，冻干菌粉在一般贮存温度下也只能保存几个月。有人分析了国内外15种徵生态制剂中的活菌存活数，在属于冻干粉(粉剂、片剂、硬胶囊剂)的样品中，有的存放6个月后存活率已低至0.4％，水剂型产品存放2个月，存活率则降到0.2％，最低为0.01％。
2、此外，双歧杆菌要能够对人体产生有益作用，首先它必需安全通过胃环境(pH1.5-3.0)，以大量的存活菌数到达肠道并定殖于肠粘膜上，但由于胃酸的杀菌作用，双歧杆菌的活菌数在此过程中也会大幅度下降。据报道，口服冻干双歧菌粉，在胃中的存活率仅为百万分之一左右，存活率极低。由于双歧杆菌不耐受强酸性环境，在经口服通过人体消化道时，绝大部分受胃酸、胆汁酸地作用而失活，仅剩下极少量活性菌到达肠道。因此，虽持续超量服用活菌制剂，也难以对人体起到理想的疗效和保健作用。
3、另一方面，现有的微生态制剂，一般均要求在低温下保存和销售，常温下货架期太短，产品在常温下销售和消费过程中活菌含量迅速下降，商品货架期短，极大地影响该类产品的生产、销售和应用。
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺点，提供一种活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊，使其能耐受强胃酸环境，并能在常温下长时间储存，有效地保护双歧杆菌的活性。
本发明的目的还在于提供一种活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊的制备方法。
本发明的活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊包括囊心物和囊衣液，囊心物是短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)三种双歧杆菌(简称双歧联株菌，下同)的活菌粉微粒，囊衣液是复合肠溶性材料，通过流化喷雾法制得；
短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)三种双歧杆菌的活菌数比例为1～3∶1～2∶1～2；
复合肠溶性材料是(按重量/体积计)：
漂白虫胶 10～30％
羧甲基纤维素钠 1～3％
硬酯酸镁 1～5％
溶剂是80～85％乙醇；
或者是((按重量/体积计)：
邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP) 5～20％
邻苯二甲酸二乙酯 2～5％、
司盘(Span)80 1～3％，
采用酒精∶丙酮=50％∶50％混合溶剂；
或者是
邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP) 5～20％
邻苯二甲酸二甲酯 1～5％
司盘(Span)80 0.5～2％
硬脂酸 0.5～3％
采用酒精∶丙酮=70％∶30％为混合溶剂；
囊心物和囊衣液的用量比例为2～3∶1～1.5(重量/体积)。
流化喷雾法微型包囊技术的原理是：作为囊心的微粒(活性菌粉微粒)，在通入压缩无菌热空气的流化床中，呈翻滚流体状态。由喷嘴喷射出的囊衣液呈细雾状，与菌粉微粒接触，在表面均匀成膜并迅速被热气流所干燥。经一定时间后，逐渐形成一定厚度的囊衣，从而完成菌粉心材微粒的包囊。
流化喷雾微型包囊法一般在囊心物不耐受较强烈的理化因素的情况下应用，如当囊心物为微生物细胞或生物大分子(如酶类、活性蛋白质等)时应用。
本发明的活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊的制备方法包括：
(1)双歧杆菌二级种子培养：将短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌一级种子液分别接种于培养基中，在厌氧条件下静置于36℃～39℃下培养14～18小时，分别得到三种菌的二级种子液。
所用培养基可以是现有的和通用的培养基，发明人提供一种特别适合本发明的培养基，其组成如下(重量/体积)：
酵母浸出膏 0.3～0.8％
胰蛋白胨 0.3～0.8％
蛋白胨 0.8～1.2％
大豆蛋白胨 0.2～0.5％
L-半胱氨酸 0.02～0.1％
可溶性淀粉 0.03～0.08％
无水葡萄糖 0.8～1.2％
牛肝浸液 10～20％
低聚果糖 0.5～1.2％
乳糖 0.2～0.5％
吐温80 0.1～0.2％
溶液A 0.5～1.0％
溶液B 0.3～0.6％
PH 7.0～7.5
其中溶液A的组成(重量/体积)是：K2HPO4 8～12％、KH2PO4 8～12％溶液B的组成(重量/体积)是：FeSO4 0.1～0.4％、MgSO4·7H2O、0.2～0.5％MnSO4·H2O 0.1～0.2％、NaCl 0.1～0.3％；
(2)双歧联菌株发酵培养：发酵培养基起始pH为7.0～7.6，先接入两歧双歧杆菌和青春双歧杆菌二级种子液，2-3小时后再接入短双歧杆菌二级种子液，发酵温度36℃～39℃，发酵时间14～20小时，发酵过程缓慢通入混合气体(氮气∶二氧化碳∶氢气=85∶10∶5)，维持罐压0.1kg/cm2以上，得成熟发酵液；
所用发酵培养基配方可以是现有的或通用的培养基，本发明人提供特别适合本发明的发酵培养基组成如下(重量/体积)：
酵母抽提液 0.8～1.2％
胰蛋白胨 0.4～0.8％
大豆酶解液 1.5～2.5％
葡萄糖 1.5～2.5％
低聚果糖 0.3～0.7％
牛肝浸出液 4～6％
牛肉膏 0.3～0.6％
NaCl 0.2～0.4％
K2HPO4 0.1～0.2％
PH 7.2～7.4
(3)离心集菌与冻干：发酵液于管式高速(4000转/分)离心机离心收集湿菌体，加入复合冻干保护剂，于冻干机冷冻(-40℃～-50℃)干燥约48～60小时，得冻干菌块；
冻干保护剂是现有技术在制备活性冻干菌粉时通用的，发明人经过探索性试验发现以下配方的冻干保护剂特别适合本发明(重量份)：
海藻糖 0.1～0.15
脱脂奶粉 2～2.5
乳糖 3～4
低聚果糖 1～1.5
麦芽糊精 4～5
可溶淀粉 4～5
维生素C钠 0.05～0.06
(4)流化喷雾微型包囊：上述冻干菌块磨成细粉后，先于包衣锅中以30％～50％低聚果糖液啧雾造粒(60～100目)，50℃～55℃热风干燥。再以菌粉微粒为囊心物，以复合肠溶性材料为囊衣液，在下列条件下进行微型包囊：菌粉粒(囊心)量100～500克，无菌空气压力2～6kg/cm2，热空气温度40～60℃，空气流量：流化床为0.8～1.5m3/min，喷嘴为0.1～0.5m3/min，囊衣液流量50～100ml/h，包囊时间1～3小时，制成40～100目的活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、采用三种不同的双歧杆菌组成联菌株，使制剂更适合于不同年龄的人服用，扩大了产品的适应范围并增加其有效性；
2、冻干菌粉经流化啧雾的微型包囊法制成耐酸肠溶性微囊，使微囊中的活性菌能顺利通过胃酸进入肠道发挥其保健功效；
3、由于活性菌包封于微囊中，受外界环境因子(氧气、温度)的影响小，故存活时间较长，使产品在常温下保存期大大延长。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1．双歧联菌株混合培养
以50升发酵罐(定容40升)中试为例
(1)二级种子培养：
培养基配方：酵母浸出膏20g、胰蛋白胨20g、蛋白胨40g、大豆蛋白胨12g、L-半胱氨酸2g、可溶性淀粉4g、无水葡萄糖40g、牛肝浸液600g、低聚果糖40g、乳糖12g、吐温80 4g、溶液A 40g、溶液B 20g、加水定容4升，调pH 7.2～7.5，于120℃下灭菌15分钟。
其中溶液A配方：K2HPO410g、KH2PO410g、加纯水至100g；
溶液B配方：FeSO40.2g、MgSO4·7H2O 0.4g、MnSO4·H2O 0.15g、NaCl0.2g、加纯水至100g；
培养条件：短双歧杆菌和青春双歧杆菌各1升，分别接入100mL一级种子；两歧双歧杆菌1.5升，接入150mL一级种子，置于38℃厌氧条件下培养16小时。
(2)混合发酵培养：
培养基(40升)组成：酵母抽提液0.4kg、胰蛋白胨0.2kg、大豆酶解液0.8kg、葡萄糖0.8kg、低聚果糖0.2kg、牛肝浸出液2kg、牛肉膏0.2kg、NaCl 0.12kg、K2HPO4 0.08kg、调PH7.2～7.4，1kg/cm2灭菌10分钟。
发酵条件控制：培养基起始pH7.4，先接入两歧双歧杆菌二级种子液1.5升、青春双歧杆菌二级种子液1.0升，培养两小时后再接入短双歧杆菌二级种子液1.0升，总接种量约10％。发酵温度37℃～38℃，发酵时间18小时，发酵过程缓慢通入混合气体(氮气∶二氧化碳∶氢气=85∶10∶5)，维持罐压0.1kg/cm2以上。发酵培养变化过程列于表1：
表1发酵时间h 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18PH值OD值活菌数6.7 6.3 6.1 5.8 5.3 5.1 4.7 4.4 4.2 4.00.15 0.16 0.21 0.27 0.33 0.40 0.44 0.47 0.49 0.50 2.2×109
2．离心集菌与冻干
发酵液于管式高速(4000转/分)离心机离心收集菌体，得湿菌体为250克，加入复合冻干保护剂2Kg(配方为：海藻糖100g、脱脂奶粉2Kg、乳糖3Kg、低聚果糖1Kg、麦芽糊精4Kg、可溶淀粉4Kg、维生素C钠50g)，直接于冻干机冷冻(-40℃)干燥50小时，得冻干菌块2.1公斤
3．流化喷雾法微型包囊
上述冻干菌块磨成细粉后，先于包衣锅中以40％低聚果糖液啧雾造粒(60～100目)，50℃～55℃热风干燥。再以菌粉微粒为囊心物，以复合肠溶性材料为囊衣液，采用流化喷雾的徵型包囊法，在瑞典NIRO-AEROMATIC LTD生产的微囊化装置上进行微型包囊。
复合肠溶性囊衣液的配方为：漂白虫胶200g、羧甲基纤维素钠20g、硬酯酸镁20g，溶于80％乙醇并定容至1000mL。
流化喷雾的徵型包囊法控制条件为；菌粉微粒(囊心)量300克，无菌空气压力3～4kg/cm2，热空气温度50～55℃，空气流量：流化床为1.0m3/min，啧嘴为0.2m3/min，囊衣液流量70～80ml/h，包囊时间2小时，制成40～80目的活性双歧联菌株微囊。
4．微生态制剂的制备：
(1)乳片剂：以乳粉300g、白糖400g、麦芽糊精100g、低聚果糖和低聚异麦芽糖(双歧促生因子)各50g、硬酯酸镁10g为原料，加入100g的活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊，压制成异型乳片剂，成为新型高效的微生态制剂。
(2)软胶囊剂：将微囊100g与两种低聚糖各50g混入1升无菌植物油中，制成混悬液(浓度为20％)。以活菌微囊混悬液为心材，在自动旋转轧囊机中采用模压制法制成软胶囊微生态制剂。
(3)硬胶囊剂：将微囊与两种低聚糖按1∶1∶1混合后，灌注于硬胶囊中即成为硬胶囊微生态制剂。
(4)混饮口服液；发酵液于管式高速离心机离心，分别收集菌体和离心清液。菌体按上述方法制成微囊，再压成速溶片或装入硬胶囊中。取离心清液1升，加入糖类(白糖100g、低聚果糖100g)调配成口服液，灌装(50mL/瓶)灭菌。饮用时，即时混入活菌微囊(速溶片或硬胶囊)则成为微生态混饮口服液。
下面用实验数据证明本发明创造与现有技术相比所具有的优点和效果：
(1)含活性菌微囊的耐酸肠溶试验
双歧杆菌的最大缺点是不耐氧不耐酸，在较大的酸性条件下很容易失活。据报导，口服冻干菌粉，在胃中的存活率仅为百万分之一左右，存活率极低。采用微型包囊的目的，一方面是隔绝氧气，延长活菌存活期，另一方面是保护活性菌免受胃酸的杀害而顺利进入肠道发挥作用。故必须对活性微囊进行耐酸肠溶的考察试验。
将上述制备的微囊和末经包囊的冻干菌粉在人工胃液(pH1.5～1.8、37℃、搅拌)中分别处理2小时和4小时，结果列于表2：
表2样品处理前活菌数(个/克)处理2h活菌数 (个/克)存活率(％)处理4h活菌数(个/克)存活率(％)微囊A微囊B菌粉 1.6×109 2.4×109 1.3×1010 1.4×109 1.3×109 2.0×10492.256.31.6×10-7 7.2×108 6.3×108 3.5×103 45.0 26.4 2.7×10-8
冻干菌粉在人工胃液中处理2小时和4小时后存活率极低，分别不到千万分之二和亿分之三。而囊衣较厚的微囊A，在人工胃液中处理2小时后，存活率仍高达92％。微囊B由于包囊衣较薄，或有的包得不够均匀，故偏低些，但实际存活的菌数仍在同一数量级(109)，意味着每口服1克微囊，大约有十亿个活菌可安全通过胃酸进入肠道。
上述微囊同时用人工肠液(pH6.8、37℃、搅拌)处理，结果列于下表3：
表3样品人工肠液处理时间(min)0 5 10 15 20崩解前活菌数(个/克)崩解后活菌数(个/克)崩解率(％)微囊A(透光率％)微囊B(透光率％)100 87 80 76 70100 78 70 68 68 1.6×109 2.4×109 1.3×109 2.3×109 82.4 95.3
微囊B在15分钟内崩解完全，崩解率为95％，肠溶性良好；而微囊A因囊衣较厚，崩解时间也仅约为20分钟。
(2)含活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊的保存稳定性试验
按常规加速试验法，若将产品置37℃～40℃、相对湿度75％条件下放置3个月后，所测得的考察项目指标仍在所要求的范围内，则此产品可暂定有效期为2年。珠海丽珠集团规定，将丽珠肠乐硬胶囊在恒温37℃、相对湿度60～65％条件下储存3个月，若存活率在10％以上，则相当于在室温下可储存1年以上。
参照丽珠肠乐的指标，将样品置37℃、内盛饱和NaCl溶液的密闭容器中(相对湿度约70％)，对上述微囊进行保存稳定性考察，结果如表4：
表4样品 加速试验(37℃、RH70％)0个月活菌数 3个月活菌数 存活率％ 常温留样观察12个月活菌数 存活率％微囊A微囊B菌粉1.6×109 3.9×108 24.42.4×109 3.6×108 15.21.3×1010 6.6×103 5.1×10-7 5.0×108 31.2 4.2×108 17.4 1.1×104 8.7×10-6
经37℃、RH70％的常规加速试验和常温留样观察，结果表明含活性菌微
分装3瓶(2瓶1升，1瓶1.5升)，于120℃，1kg/cm2压力下灭菌10分钟，冷却后依次接入短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌1升、1.5升、1升三种双歧杆菌一级种液，接种量约10％，于38℃厌氧条件下培养16小时。
配制发酵培养基40L，配方为：酵母抽提液0.48kg、胰蛋白胨0.32Kg、大豆酶解液1kg、葡萄糖1kg、低聚果糖0.28kg、牛肝浸出液2.4kg、牛肉膏0.24kg、NaCl 0.16kg、K2HPO4 0.08kg、调PH7.4。
移入50升发酵罐中，夹层通汽升温至100℃，直冲至120℃，保持5分钟，降温至约40℃，先接入上述两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌二级种子液，两小时后再接入短双歧杆菌二级种液，发酵温度控制在37～38℃，发酵过程缓慢通入混合气体(氮气∶二氧化碳∶氢气=85∶10∶5)，维持罐压0.1kg/cm2以上。发酵时间18小时。
发酵液于管式高速离心机离心收集菌体，得湿菌体为250克、加入复合冻干保护剂2公斤后，直接于冻干机冷冻真空干燥48小时，得冻干菌块2.3公斤。冻干保护剂的配方为：海藻糖150g、脱脂奶粉2.5Kg、乳糖4Kg、低聚果糖1.5Kg、麦芽糊精5Kg、可溶淀粉5Kg、维生素C钠60g。
冻干菌块磨成细粉后，于包衣锅中以40％低聚果糖液啧雾造粒，热风干燥。以菌粉颗粒为囊心物，以复合囊材(漂白虫胶150g、羧甲基纤维素钠15g、硬酯酸20g，85％乙醇1升)做为包衣液，采用流化喷雾的徵型包囊法，在瑞典NIRO-AEROMATIC LTD生产的微囊化装置上进行微型包囊。控制条件为；菌粒(囊心)量400克，无菌空气压力4kg/cm2，热空气温度45～50℃，空气流量：流化床为1.5m3/min，啧嘴为0.4m3/min，囊衣液流量100mL/h，包囊时间2小时，制成60～80目的活性双歧联菌株微囊。
以乳粉3kg、白糖4kg、麦芽糊精1kg、低聚果糖和低聚异麦芽糖各0.5kg、硬酯酸镁0.1kg为原料，加入1kg的活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊，压制成异型乳片剂，成为新型高效的微生态制剂。
实施例3：制备活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊制剂(混饮口服液)
种子培养与实施例1同。发酵培养基(40升)配方改为：干酵母抽提液0.4kg、大豆蛋白胨0.2Kg、大豆酶解液1kg、口服葡萄糖1Kg、低聚果糖0.4Kg、牛肝浸出液1kg、NaCl0.12Kg、K2HPO4 80g、调PH7.5，其他发酵条件同实施例1。
发酵液于管式高速离心机离心，分别收集菌体和离心清液，得湿菌体200克、离心清液30L。菌体加入复合活菌保护剂1.6Kg(配方为：海藻糖100g、脱脂奶粉2Kg、乳糖3Kg、低聚果糖1Kg、麦芽糊精4Kg、可溶淀粉4Kg、维生素C钠50g)，冷冻真空干燥52小时，得冻干菌块1.7kg，按实施例1所述方法制成微囊，再压成速溶片或装入硬胶囊中。离心清液则加入糖类(白糖3kg、低聚果糖3kg)调配成口服液，灌装(50mL/瓶)灭菌。饮用时，即时混入活菌微囊，则成微生态混饮口服液。
实施例4：制备活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊制剂(硬胶囊剂)。
按实施例1的方法进行二级种子培养、发酵培养、离心集菌并制成冻干菌粉。
以菌粉微粒为囊心物，以复合囊材为包衣液，采用流化喷雾的微型包囊法，在微囊化装置上进行微型包囊。微囊化控制条件与实施例1同。复合囊材包衣液的配方改为：邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)100g、邻苯二甲酸二乙酯20g、Span 80 10g，酒精∶丙酮=1∶1混合溶剂1升。制得60～100目的耐酸肠溶微囊，将微囊与两种低聚糖(低聚果糖和低聚异麦芽糖)按1∶1∶1混合后，灌注于硬胶囊中，即成为硬胶囊微生态制剂。
实施例5：制备活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊制剂(软胶囊剂)
按实施例1的方法进行二级种子培养、发酵培养、离心集菌并制成冻干菌粉。
以菌粉微粒为囊心物，以复合囊材为包衣液，采用流化喷雾的微型包囊法，在微囊化装置上进行微型包囊。复合囊材包衣液的配方改为：邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)120g、邻苯二甲酸二甲酯15g、Span 80 8g，硬脂酸20g，酒精∶丙酮=70％∶30％混合溶剂1升；微囊化控制条件与实施例1同。制得80～100目的耐酸肠溶微囊，将微囊1kg与两种低聚糖各5kg混入10升无菌植物油中，制成混悬液(浓度约20％)。以活菌微囊混悬液为心材，在自动旋转轧囊机中采用模压制法制成软胶囊微生态制剂。