一种副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的荧光定量 PCR 检 测试剂盒及其检测方法和应用 【技术领域】
本发明涉及一种试剂盒， 具体地说关于一种副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的 荧光定量 PCR 检测试剂盒及其检测方法和应用。 【背景技术】
副溶血性弧菌 (V.parahaemolyticus) 是兼性厌氧的革兰氏阴性嗜盐菌， 普遍存 在于近海岸海水和海产食物中， 根据致病性可分为致病菌和非致病菌。致病性菌是造成美 国， 日本， 中国以及很多沿海地区腹泻和食物中毒的首要病原菌。 环境中菌株 95％为非致病 菌， 5％为致病菌。我国每年经上海口岸进出口的海产品达 13 万吨， 总值 2.26 亿美元。如 果仅根据副溶血性弧菌的检出作为关口控制标准， 将无法进行正常海产品进出口贸易。因 此需要建立准确鉴定其中 5％致病性副溶血性弧菌的方法作为关口控制海产品质量， 保障 食品安全的检疫技术手段。
致病性副溶血性弧菌的毒力因子目前已知的主要是溶血毒素， 包括耐热性溶血 毒素 (Thermostable direct hemolysin， TDH) 和耐热性溶血毒素相关的溶血毒素 (TDH related-hemolysin， TRH)。TDH 由 tdh 基因编码， 现有检测 TDH 或 tdh 的方法主要有胶乳凝 集试验 (KAP-RPLA)， 酶联免疫吸附试验 (ELISA)， 聚合酶链式反应 (PCR)， tdh DNA 杂交等。 免疫学检测方法无法检测出环境或临床分离的因环境， 代谢改变而暂无 TDH 表达或表达量 较低的致病性副溶血性弧菌 ； 普通 PCR 法及 DNA 杂交法不能测定 tdh 基因的表达量， 因此难 于对致病性进行定量分析。我们希望建立一个可以测定 tdh 基因拷贝水平的实时荧光定量 PCR 反应体系以定量反映副溶血性弧菌的致病能力。以此为依据作为区分致病性和非致病 性副溶血性弧菌的现场检测的一个快速高效的方法。
副溶血性弧菌在我妻氏培养基 (Wagatsuma blood agar) 上 37℃培养 18-24 小时 后菌落周围呈现出的透明 β 溶血环称为神奈川现象 (KanagawaPhenomenon， KP)， 无透明溶 血环或无明显溶血为 KP ， 曾据此将副溶血性弧菌区分为致病性和非致病性菌株， 但神奈川 溶血反应在多种实践环境中反应不典型， 不易判断结果。一些 (16％ )KP 但 TDH+ 的副溶血 性弧菌或 KP 且 TDH 却可检出 tdh 基因的副溶血性弧菌也有致病性。因此 tdh 基因比 KP 反应更适宜作为副溶血性弧菌的致病性标志物。 Nishibuchi 认为 tdh 基因低表达可能是副 溶血性弧菌携带 tdh 基因但 KP 的原因， 定量 tdh 基因的表达水平是对神奈川现象的重要 修正。此外， TRH 作为一种溶血因子， 也被视为副溶血性弧菌主要的致病因子之一， 但是检 出率远小于 TDH 的检出率， 其编码基因 trh 可被纳入为第二个致病性标志基因 ； 不耐热溶血 TLH) 虽然可以表征副溶血性弧菌的种属特异性， 但不是副 毒素 (Thermolabile hemolysin， 溶血性弧菌主要的毒力因子， 因此由该基因表达产物形成的 KP 阳性菌株不代表该菌株的 致病性。
目前， 对于细菌的检测通常使用荧光定量 PCR 技术。所谓实时荧光定量 PCR 技术， 是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量 PCR 技术中， 通常以 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号， 荧光闽值的缺省设置是 6-15 个循环的荧光信号 的标准偏差的 10 倍， 而将每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数设 为 Ct 值。研究表明， 每个模板的 ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷 贝数越多， Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线， 其中横坐标代表起 始拷贝数的对数， 纵坐标代表 Ct 值。因此， 只要获得未知样品的 Ct 值， 即可从标准曲线上 计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量 PCR 扩增过程中在加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针， 目前常用的为 Taqman 荧光探针， 该探针为寡核苷酸， 两端分别标记一个报告荧光基团和一 个淬灭荧光基团。探针完整时， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， 故检测不到荧 光； 在 PCR 扩增过程中， Taq 酶的 5’ -3 外切酶活性将探针酶切降解， 使报告荧光基团和淬灭 荧光基团分离， 从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每个循环过程结束检测一次荧光强 度， 反应结束后， 便可得到一条工作曲线。
中国专利文献 CN101038254 公开了 “一种检测曲霉菌荧光定量 PCR 试剂盒” ， 该试 剂盒能快速准确地检测出常见的多种致病曲霉菌， 用于临床诊断侵袭性曲霉菌感染具有很 好的敏感度和特异度。中国专利文献 CN1680597 公开了 “一种用于定量检测丙型肝炎病毒 (HCV) 的荧光定量 PCR 试剂盒” 。但是， 关于副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的荧光定量 PCR 检测试剂盒和检测方法未见报道。 【发明内容】 本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的荧光定量 PCR 检测试剂盒。
本发明的再一的目的是， 提供一种副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的荧光定量 PCR 检测方法。
本发明的另一的目的是， 提供副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的荧光定量 PCR 检测试剂盒的用途。
为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是 ： 一种副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的荧光定量 PCR 检测试剂盒， 包括 dNTP 混合物、 PCR 反应液、 探针、 扩增引物，
所述探针的序列为 5’ -FAM-TGACA TCCTA CATGA CTGTG AAC-ECL I PSE-3’ (见 SEQ ID NO ： 1 所示 )
所述扩增引物， 正向序列为 5’ -CGAAG ATGTT TATGG TCAAT C-3’ ( 见 SEQ ID NO ： 2 所示 )， 反向序列为 5’ -ACCGC TGCCA TTGTA TAGTC T-3’ ( 见 SEQ ID NO ： 3 所示 )。
所 述 探 针 5’ -FAM-TGACA TCCTA CATGA CTGTG AAC-ECLIPSE-3’ 的 位 置 在 517-541bp 处， 所述扩增引物， 正向序列 5’ -CGAAG ATGTT TATGG TCAAT C-3’的位置在 467-487bp 处， 反向序列 5’ -ACCGC TGCCA TTGTA TAGTC T-3’ 的位置在 571-551bp 处
为实现上述第二个目的， 本发明采取的技术方案是 ： 一种副溶血性弧菌致病性标 志基因 tdh 的荧光定量 PCR 检测方法， 包括以下步骤 ：
(a)、 细菌复苏
(b)、 副溶血性弧菌 OD600 值的测定和相差显微镜下绝对计数
(c)、 细菌基因组 DNA 的定量提取
(d)、 引物和探针设计
(e)、 tdh 基因扩增
(f)、 定量 tdh 基因标准 DNA 模板的制备
(g)、 实时荧光定量 PCR 反应。
所 述， 步 骤 (d) 中 的 探 针 序 列 为 5’ -FAM-TGACA TCCTA CATGA CTGTGAAC-ECLIPSE-3’ ( 见 SEQ ID NO ： 1 所示 )
所述扩增引物， 正向序列为 5’ -CGAAG ATGTT TATGG TCAAT C-3’ ( 见 SEQ ID NO ： 2 所示 )， 反向序列为 5’ -ACCGC TGCCA TTGTA TAGTC T-3’ ( 见 SEQ ID NO ： 3 所不 )。
所 述 探 针 5’ -FAM-TGACA TCCTA CATGA CTGTG AAC-ECLIPSE-3’ 的 位 置 在 517-541bp 处， 所述扩增引物， 正向序列 5’ -CGAAG ATGTT TATGG TCAAT C-3’的位置在 467-487bp 处， 反向序列 5’ -ACCGC TGCCA TTGTA TAGTC T-3’ 的位置在 571-551bp 处。
为实现上述第三个目的， 本发明采取的技术方案是 ：
副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的荧光定量 PCR 检测试剂盒在制备检测致病副 溶血性弧菌性疾病药物中的应用。
副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的荧光定量 PCR 检测试剂盒在出入境海产品的 检疫质量控制中的应用。
本发明优点在于 ： 本发明建立了快速检测副溶血性弧菌 tdh 基因的 real-time PCR 方法， 可做为副溶血性弧菌致病性评判体系的方法之一， 用于对出入境海产品的检疫质 量控制。试验中我们建立了用副溶血性弧菌 OD600 值计算菌群绝对数量浓度的公式， 可替代 繁琐的显微镜下计数法， 简化了定量时间。 根据 real-time PCR 的定量结果与绝对计数可计 算得到菌群中 tdh 基因的平均拷贝水平， 可反映菌体中 TDH 的可能表达水平。测定的 17 株 试验菌中其 tdh 拷贝水平各不相同， 对判断各菌株的致病性有潜在参考价值， 可作为我国 出入境检验检疫标准的基本数据。本发明的引物、 探针以及检测结果， 可以为荧光定量 PCR 检测试剂盒的开发提供可靠的依据。 【附图说明】
图 1. 菌 液 OD600 值 与 显 微 镜 下 绝 对 计 数 值 的 相 关 性， 注： 对应方程为 ： y＝ 2.0452x+6.2845， R2 ＝ 0.6128， R ＝ 0.7828(P ＜ 0.001)， y： 显微镜下绝对计数 log 值 ( 个 /ml)， x： OD600 值。数据来源于 43 株不同的副溶血性弧菌的菌液测定值。
图 2.PCR 扩增副溶血性弧菌 tdh 基因结果， 1： 分子量标记 (D2000， 天根生化科技 有限公司， 北京 ) ； 2： 空白对照 ； 3： tdh- 菌株的阴性扩增结果 ； 4： tdh+ 菌株的阳性扩增结 果。
图 3A. 标 准 定 量 tdh 基 因 DNA 模 板 (101-107 拷 贝 /μl) 实 时 定 量 PCR 扩 增 * 曲 线， 1-7 分 别 代 表 标 准 定 量 tdh 基 因 DNA 模 板 107-101 拷 贝 /μl， Taqman 探 针 采 用 FAM(6-fluoresein) 标记， 所用仪器为 iCycler iQ(Bio-Rad)， 测定通道为 FAM 490nm。
图 3B.tdh 基 因 起 始 拷 贝 数 的 对 数 值 与 Ct 值 的 标 准 曲 线， 对应的方程为 y ＝ -3.144logx+43.229， R ＝ 0.997， (P ＜ 0.001)， y： Ct 值， x： 模板 DNA 起始拷贝数 (10n 拷 贝数 /μl)。【具体实施方式】
下面结合附图对本发明提供的一种副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的荧光定 量 PCR 检测试剂盒及其检测方法和应用的具体实施方式作详细说明。
实施例 1
副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的荧光定量 PCR 检测方法
1. 材料
1.1 菌株来源
副溶血性弧菌 ： 2006 年 11 月至 2007 年 9 月之间分别从上海市金山区， 浦东新区和 舟山渔场的食物中毒和胃肠炎腹泻患者， 水产品及陆地环境水， 养殖用水样本中分离得到， 由上海市出入境检验检疫局提供。将腹泻患者分离的副溶血性弧菌视为临床来源菌株， 水 产品和水样分离的菌株视为环境来源菌株。
1.2 材料和试剂
1. 硫代硫酸盐 - 枸橼酸盐 - 胆汁酸盐 - 蔗糖琼脂粉 (TCBS)( 上海市疾病预防控制 中心试剂研究中心提供 )
2.LB 液体培养基 (Sigma 公司 ) 3.UNIQ-10 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒 ( 上海生工生物工程技术服务有限公司) 4.dNTP， 10×Ex 缓冲液 ( 含 MgCl2)， ExTaq 热启动酶 (TAKRA TaqTM， 宝生物工程有 限公司， 大连 )
5. 引物合成 ( 上海生工生物工程技术服务有限公司 )
6. 探针合成 ( 上海生工生物工程技术服务有限公司 )
7. 琼脂糖粉
8.UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒 ( 上海生工生物工程技术服务有限公司 )
1.3 仪器
1. 血细胞计数板
2. 相差显微镜 ： ECLIPSE TS100( 尼康公司 )
3.Thermo436 型落地式恒温摇床 (Thermo Fisher Scientific 公司 )
4.Eppendorf BioPhotometer 紫外分光仪 (Eppendorf 公司 )
5.PCR 仪 ： MyCycler(Bio-Rad 公司 )
6. 实时荧光定量 PCR 仪 ： iCycleriQ(Bio-Rad 公司 )
2. 方法
2.1 细菌复苏
取 43 株副溶血性弧菌的保存菌株在硫代硫酸盐 - 枸橼酸盐 - 胆汁酸盐 - 蔗糖琼 脂 (Thiosulfate Citrate Bile Sucrose Agar， TCBS) 平板划线， 37℃培养 18-24 小时。
2.2 副溶血性弧菌 OD600 值的测定和相差显微镜下绝对计数
挑取适量在 TCBS 平板上形成的副溶血性弧菌菌落， 接种于 LB 液体培养基。37℃ 震荡培养， 使细菌处于对数生长期。 以空白 LB 液调零， 测定菌液 OD600 值。 菌液经适度稀释， 使用血细胞计数板在相差显微镜下进行绝对计数。
2.3 细菌基因组 DNA 的定量提取
将 2ml 已测定 OD600 值的菌液离心取沉淀物， 混于 200μlTE 溶液 (10mM Tris· Cl， 1mM EDTA， pH8.0)， 使用 UNIQ-10 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒 ( 上海生工生物工程技术 服务有限公司 ) 依照操作说明提取细菌基因组 DNA。 简述为依次加入 400μl 裂解液和 3μl 蛋白酶 K 溶液， 裂解细菌释放基因组 DNA， 离心， 取上清液加入 UNIQ-10 吸附柱， 使用洗涤液 去除杂质， 用 ddH2O 洗脱， 获得 30-50μl 细菌基因组 DNA， 浓度约为 0.02-0.05μg/μl。
2.4 引物和探针设计
tdh 基因的普通聚合酶链式反应 (PCR) 扩增引物根据 Lynch T， LivingstoneS， Buenaventura E， et al.Vibrio parahaemolyticus disruption ofepithelial cell tight junctions occurs independently of toxinproduction.Infect Immun JT -Infection and immunity， 2005， 73(3) ： 1275-83( 副溶血性弧菌裂解上皮细胞紧密连接的作用不依赖 于毒素产生， 《感染与免疫》 ， 2005， 73(3) ： 1275-83) 合成。 tdh 基因的位置依据 GenBank 号为 M10069 的基因序列， 正向引物为 5’ -CCATC TGTCC CTTTT CCTGC C-3’ ( 位置在 330-350bp 处 )， 反 向 引 物 为 5’ -CCACT ACCAC TCTCA TATGC-3’ ( 位 置 在 754-735bp 处 )。tdh 保 守 序 列 来 源 于 17 条 已 报 道 的 序 列 的 Consensus 序 列 (GenBank 序 列 号 分 别 为 M10069， M55316， AY044107-AY044114， S76724， S67841， S67850 和 X54340-X54343)， 根据保守区域 设计 TaqMan 探针， 序列为 5’ -FAM-TGACA TCCTA CATGA CTGTG AAC-ECLIPSE-3’ ( 位置在 517-541bp 处 )。 因上述扩增 tdh 基因的引物与探针组合不能有效进行实时荧光定量 PCR 反 应， 因此使用 primer premier 5.0 软件另行设计实时荧光定量 PCR 适用的扩增引物， 正向 序列为 5’ -CGAAG ATGTT TATGG TCAAT C-3’ ( 位置在 467-487bp 处 )， 反向序列为 5’ -ACCGC TGCCA TTGTA TAGTC T-3’ ( 位置在 571-551bp 处 )， 目的片段长度为 105bp。
2.5tdh 基因扩增
使用的扩增引物为 ： 正向引物 5’ -CCATC TGTCC CTTTT CCTGC C-3’ ， 反向引物 5’ -CCACT ACCAC TCTCA TATGC-3’ 。PCR 条件为 50μl 反应体系， 模板使用 4μl 细菌基因 组 DNA， 20μM 正反向引物各 1μl， 4μl 2.5mM dNTP， 5μl10× 缓冲液 ( 含 MgCl2)， 0.25μl TM 5U/μl rTaq 酶 (TAKRA Taq ， 宝生物工程有限公司， 大连 )， ddH2O 补足体积。 扩增条件为起 始 94℃变性 4 分钟 ； 之后反应 30 个循环 (94℃ 30 秒 ； 55℃ 30 秒 ； 72℃ 1 分钟 ) ； 终末 72℃ 延伸 5 分钟。以 ddH2O 做空白对照。产物取 5μl 作琼脂糖凝胶电泳 (0.8％， 5V/cm， 40 分 钟 )。
2.6 定量 tdh 基因标准 DNA 模板的制备
使用 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒 ( 上海生工生物工程技术服务有限公司 ) 依 据说明书将电泳分离的 tdh 基因扩增片段从琼脂糖凝胶中回收。用 ddH2O 以 10 拷贝为量 级从 107copies/μl 依次稀释至 101copies/μl。
2.7 实时荧光定量 PCR 反应
使用的扩增引物为 ： 正向序列 5’ -CGAAG ATGTT TATGG TCAAT C-3’ ， 反向序列 5’ -ACCGC TGCCA TTGTA TAGTC T-3’ 。25μl 反应体系检测了 17 株经普通 PCR 筛出的 tdh+ 副溶血性弧菌。模板 2μl， 分别为 tdh 基因标准 DNA 模板 (101-107copies/μl) 和待测的 副溶血性弧菌基因组 DNA。tdh 基因标准 DNA 模板各拷贝梯度均平行 5 个复管作为定量基 准， 3μM 正反向 tdh 基因荧光定量 PCR 引物各 2μl， 6μM TaqMan 探针 2μl， 2.5μl 2.5mMdNTP， 2.5μl 10×Ex 缓冲液 ( 含 MgCl2)， 5U/μl ExTaq 热启动酶 0.2μl(TAKRA TaqTM， 宝 生物工程有限公司， 大连 )， ddH2O 补足体系。反应条件为开始一个循环 95℃预变性 3 分 30 秒， 接着 40 个循环 (95℃ 30 秒 ； 52℃ 45 秒 )， 52℃采集荧光。荧光采集通道为 FAM， 490nm。 ddH2O 作为空白对照。
2.8 统计分析
使用 Office Excel 整理数据并绘制细菌 OD600 值与菌液绝对计数值的标准曲线。
3. 实验结果
3.1 副溶血性弧菌的培养及计数
43 株处于对数生长期的副溶血性弧菌株 OD600 值在 0.138-0.694 之间， 相应的显 6 7 微镜下菌液的绝对计数值为 10 -10 个 /ml。两者的线性关系为 y ＝ 2.0452x+6.2845(r ＝ 0.7828， P ＜ 0.001)( 图 1)。按此计算式可根据 OD600 值推算出待测副溶血性弧菌菌液的绝 对计数值。
3.2tdh 基因的扩增
使用普通 PCR 方法对腹泻患者， 水产品和水样三种来源分离的副溶血性弧菌 (n ＝ + 172) 扩增 tdh 基因， 共有 91 株为 tdh 菌， 水样中无 tdh+ 株。91 株 tdh+ 株均扩增出长度为 425bp 的目的片段， 位置在 330-754bp 处 ( 图 2)。 3.3 实时荧光定量 PCR 反应结果
17 株 tdh+ 副溶血性弧菌定量 tdh 基因拷贝水平。5 个复管的 tdh 基因标准 DNA 浓 度测定的重复性符合要求 ( 图 3A)。空白对照在 40 个循环内不能检测到 Ct 值， 显示该反应 1 7 的检测灵敏度小于 10 个拷贝 /μl。其拷贝数 (10 -10 拷贝 /μl) 的对数与 Ct 值呈线性 关系 y ＝ -3.144logx+43.229(R ＝ 0.997， P ＜ 0.001)( 图 3B)。从 17 株试验菌的定量结 果可看出， 根据待测菌株的 Ct 值可计算 tdh 基因的拷贝数， 与待测菌液的绝对计数值比较 可计算 tdh 基因的群体拷贝水平 ( 表 1)。
表 1. 十七株 tdh+ 副溶血性弧菌的 tdh 基因平均拷贝浓度
需要说明的是 ： 本发明尝试用经典文献报道的做常规 PCR 的引物对建立实时荧 光定量 PGR 反应， 这样有助于历史实验数据的对比。但由于 real-time PCR 反应对扩增区 域有一定的二级结构要求， 我们用这些引物未能建立理想的实时荧光定量 PCR 体系。因此 修改的反应条件为采用 467-571bp 的扩增区段， 和 517-541bp 的正向 TaqMan 探针。之前 Blackstone 曾采用 real-time PCR TaqMan 探针法检测牡蛎中致病性副溶血性弧菌的 tdhS 基因， 使用针对 tdhS 基因 (GenBank 序列号 D90101) 的高度特异 TaqMan 探针。Kp+ 的副溶 血性弧菌具有 tdh1( 或 tdhS) 和 tdh2( 或 tdhA) 两种类型的基因。tdh2( 或 tdhA) 为优势 表达 ( ＞ 90％ )， 由 tdh1( 或 tdhS) 表达的 TDH 为 TDH 总量的 0.5-9.4％。因此 Blackstone 的方法检出的 tdhS 基因可能无法反映 TDH 的总表达水平。我们设计的 TaqMan 探针源于 17 种 tdh 基因来源， 高度保守， 可同时检出 tdh1 和 tdh2。Linda 曾采用多重实时荧光定量 PCR 法检测副溶血性弧菌的 ORF8， tlh， tdh 和 trh 基因， 其中关于 tdh 基因的检测反映其 417-645bp 区间的 234bp 扩增片段， 探针位置在 590-612bp 处， 除该反应的引物设计同样源 于单一序列以外， 在反应参数上也逊于本发明的条件 ( 扩增长度 105bp)， 反应效率特异性 都较低。
实施例 2
一种副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的荧光定量 PCR 检测试剂盒
本发明试剂盒包含 ： 细胞裂解液 I、 细胞裂解液 II、 RNA 洗涤缓冲液 I、 RNA 洗涤缓 冲液 II、 无 RNA 酶的水、 RNA 分离柱、 反转录缓冲液、 逆转录酶储存液、 dNTP 混合物、 PCR 反 应液、 探针、 标准品、 对照品。以上各种溶液均为水溶液。
(1)、 细胞裂解液 I 包含 ： 0.1mol/l Tris-HCI( 三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸， pH7.6， 25℃ )、 0.1mol/l 氯化钠、 0.05mol/l 氯化镁、 水。
(2)、 细胞裂解液 II 包含 ： 3mol/l 异硫氰酸胍、 2mol/l 盐酸胍、 0.3mol/l 醋酸钠 (pH5.2)、 0.2％ (W/V)SDS( 十二烷基硫酸钠 )、 水。
(3)、 RNA 洗涤缓冲液 I 包含 ： 0.2mol/l 醋酸钠 (pH5.2)、 0.1mol/l 氯酸钠、 0.1mol/ LTris-HCl(pH7.5)
(4)、 RNA 洗涤缓冲液 II 包含 ： 1.2mol/l 柠檬酸钠、 0.5mol/l Tris-HCl(pH7.5， 25℃ )、 水。
(5)、 无 RNA 酶的水制备方法为向去离子水加入 DEPC( 焦碳酸二乙酯 )， 至终浓度为 室温放置备用。 0.05％ (V/V)， 室温 (22-25℃ ) 放置 10-12 小时后， 121℃， 20min 高压，
(6)、 RNA 分离柱是一种硅胶柱， 可以特异性结合 RNA， 并可用水洗脱 RNA， 达到分离 纯化 RNA 的目的。
(7)、 反转录缓冲液包含 ： 9.1umol/l oligo(dT)12-18、 3.6U/u1Rnaselnhibitor、 72.7mmol/l DTT( 二 硫 苏 糖 醇 )、 182mmol/lTri s-HCl(pH8.3， 25 ℃ )、 273mmol/lKCI、 11mmol/l MgC12。
(8)、 逆转录酶储存液包含 ： 20mmol/l Tris-HCl(pH 7.5， 25℃ )、 100mmol/lNaCl、 0.1mmol/l EDTA、 1.0mmol/l DTT、 50％ (V/V) 甘油、 0.0l％ (V/V)Nonidetp-40、 200U/ul 逆 转录酶 (M-MLV)、 水。
(9)、 dNTP 混合物包含 ： dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP， 为其钠盐 - 水溶液 pH7.0-7.5， 四 种 dNTP 浓度均为 10mmol/l。如 dATP 为脱氧腺苷三磷酸， 其钠盐为磷酸上的三个氢中的一 个或两个被钠取代， 便形成了钠盐 ； 其它几种也是如此。即 dNTP 是以钠盐形式存在的。
(10)、 PCR 反 应 液 包 含 ： 18.5mmol/l Tris-HCI(pH8.3， 25 ℃ )、 2.78mmol MgC12、 92.6mmol/L KCL、 引物、 dNTP 混合物、 水。
检测用引物序列分别为 ：
正向序列为 5’ -CGAAG ATGTT TATGG TCAAT C-3’ ， ( 见 SEQ ID NO ： 2 所示 )
反向序列为 5’ -ACCGC TGCCA TTGTA TAGTC T-3’ ( 见 SEQ ID NO ： 3 所示 )
(11)、 探针荧光标记的探针， 其序列为 ： 5’ -FAM-TGACA TCCTA CATGA CTGTG AAC-ECLIPSE-3’ ( 见 SEQID NO ： l 所示 )。
(12)、 对照品分为阳性对照品与阴性对照品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明方法的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市公共卫生临床中心
<120> 一种副溶血性弧菌致病性标志基因 tdh 的荧光定量 PCR 检测试剂盒及其检 测方
法和应用
<130>/
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>1
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<210>2
<211>21
<212>DNA
<213> 人工序列
<400>2
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