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1、10申请公布号CN104152473A43申请公布日20141119CN104152473A21申请号201410405272X22申请日20140818C12N15/61200601C12N15/84200601A01H5/0020060171申请人中国烟草总公司郑州烟草研究院地址450001河南省郑州市高新技术产业开发区枫杨街2号72发明人王燃史艳梅魏攀武明珠陈千思罗朝鹏李锋金立锋魏春阳林福呈屈凌波杨军范楷陈霞郑庆霞74专利代理机构郑州优盾知识产权代理有限公司41125代理人郑园张真真54发明名称烟草类胡萝卜素异构酶基因及其应用57摘要本发明公开了一种烟草类胡萝卜素异构酶基因，其碱基序列如。
2、SEQIDNO1所示。在烟草中，本发明克隆了一个类胡萝卜素合成关键基因NTCRTISO，抑制该基因表达可以有效提高烟叶类胡萝卜素含量，并且提高烟株抵御光抑制的能力。本发明揭示了烟草中CRTISO基因在类胡萝卜素合成中的重要功能，对类胡萝卜素组成的调控起着至关重要的作用，寻找了一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，尤其是胡萝卜素，为植物分子改良提供了良好的理论指导。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表2页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表2页附图3页10申请公布号CN104152473ACN104152473A1/1页21一种烟草类胡萝卜素。
3、异构酶基因，其碱基序列如SEQIDNO1所示。2如权利要求1所述的烟草类胡萝卜素异构酶基因的应用，其特征在于所述烟草类胡萝卜素异构酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。3一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，其特征在于通过瞬时表达技术干扰、沉默烟草类胡萝卜素异构酶基因，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。4如权利要求3所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，其特征在于以所述烟草类胡萝卜素基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体中，构建所述烟草类胡萝卜素基因的病毒诱导基因沉默载体和RNAI载体。权利要求书CN104152473A1/5页3烟草类胡萝卜素异构酶基因及其。
4、应用技术领域0001本发明属于植物基因工程领域，具体地，本发明涉及烟草类胡萝卜素合成关键基因异构酶基因NTCRTISO及其应用。特别是涉及类胡萝卜素异构酶CRTISO在类胡萝卜素合成及植物生长发育中的重要作用。背景技术0002类胡萝卜素合成途径在高等植物中扮演重要角色。该途径的中间代谢产物，如胡萝卜素、黄体素等参与植物的光合作用；终产物包括脱落酸、独脚金内酯等，与植物抗氧化和生长发育相关。烟草中的类胡萝卜素属于萜烯类化合物，其含量的高低能够影响烟叶的外观和内在品质，它不仅与调制后烟叶的颜色有关，而且其降解和热裂解产物包含近百种香气物质，与烟叶的香气有密切关系。WEEKS研究发现，在烟叶质量提高。
5、的同时，类胡萝卜素降解物含量明显增加。对胡萝卜素降解产物进行了加香实验，结果表明添加胡萝卜素的降解产物能够丰满烟气，增浓烟香。烟草作为一种重要的模式植物，也为该通路研究提供了良好的材料。1993年，MISAWA等人将细菌八氢番茄红素脱氢酶基因CRTI转入烟草，使其过量表达，结果转基因烟草中胡萝卜素的累积量明显提高。2000年，MANN等人将烟草中胡萝卜素酮酶基因CRT0过表达，使虾青素等酮基类胡萝卜素在烟草中不断累积，最终使花蜜腺的颜色由黄变红。0003CRTISO基因是植物中类胡萝卜素合成的关键基因之一，它催化多反式番茄红素形成多顺式番茄红素，该基因表达量降低能够导致胡萝卜素大量积累。然而烟。
6、草中关于该基因的研究甚少，因此只能从其它植物的CRTISO基因的研究中获取一些有价值的信息。KATO等人发现柑橘中CRTISO基因下调能够使果实中胡萝卜素含量提高，证实了该基因与胡萝卜素的合成代谢相关。陶能国等人克隆了纽荷尔脐橙的CRTISO基因，该基因与拟南芥、番茄和柑橘的CRTISO基因高度相似，可以推测纽荷尔脐橙的CRTISO基因也与胡萝卜素的合成累计有密切关系。0004本发明从普通烟草中克隆CRTISO基因，并对该基因的表达和功能进行研究，旨在揭示该基因在烟草类胡萝卜素合成通路中的作用，试图寻找一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，尤其是胡萝卜素，为选育高含量类胡萝卜素的烟草提供技术支持。。
7、发明内容0005本发明根据番茄和马铃薯的前番茄红素异构酶基因序列通过同源克隆的方式，从栽培烟草红花大金元体内克隆获得CRTISO基因序列，对其进行了表达模式分析。利用烟草脆裂病毒TOBACCORATTLEVIRUS,TRV诱导基因沉默注射本氏烟草，结果表明CRTISO的表达抑制可以提高烟叶类胡萝卜素含量，并且提高了烟株的光合作用能力。该研究结果能够为利用基因工程技术培育优良品种提供理论依据和基因资源。0006本发明的技术方案是一种烟草类胡萝卜素异构酶基因，其碱基序列如SEQIDNO1所示。说明书CN104152473A2/5页40007所述的烟草类胡萝卜素异构酶基因的应用，所述烟草类胡萝卜素异。
8、构酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。0008一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过瞬时表达技术干扰、沉默烟草类胡萝卜素异构酶基因，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。0009所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草类胡萝卜素基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体中，构建所述烟草类胡萝卜素基因的病毒诱导基因沉默载体和RNAI载体。0010首先，从普通烟草CDNA中扩增出NTCRTISO编码序列，研究其在烟草不同时期不同器官中的转录水平表达模式，发现该基因主要在烟草叶中表达。利用TRV介导的基因沉默技术研究该基因表达受到抑制后，烟草类胡萝卜素合成通。
9、路基因表达和类胡萝卜素含量变化及光合生理指标的变化。0011在烟草中，我们克隆了一个类胡萝卜素合成关键基因NTCRTISO，抑制该基因表达可以有效提高烟叶类胡萝卜素含量，并且提高烟株抵御光抑制的能力。本发明揭示了烟草中CRTISO基因在类胡萝卜素合成中的重要功能，对类胡萝卜素组成的调控起着至关重要的作用，寻找了一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，尤其是胡萝卜素，为植物分子改良提供了良好的理论指导。附图说明0012图1为四倍体栽培烟草不同时期、STAGE1STAGE4分别为团棵期、旺长期、现蕾期、盛花期的各类器官根R、茎S、叶L5叶位5L，10叶位10L，15叶位15L、花F，中NTCRTISO的。
10、转录表达模式；0013图2氏烟中CRTISO基因的表达抑制表型。CONTROL接种生理盐水对照烟草；TRV接种TRV空载体对照烟草；TRVCRTISO接种携带CRTISO基因片段病毒的烟草；0014图3烟草中定量PCR检测病毒介导的CRTISO基因沉默效果。CONTROL接种生理盐水对照样；TRV接种TRV空载体对照样；TRVCRTISO接种携带CRTISO基因片段病毒样；0015图4烟草中HPLC检测病毒介导的CRTISO基因沉默后烟草植株类萝卜素胡萝卜素、紫黄质、新黄质和黄体素含量及叶绿素A和B的含量。CONTROL接种生理盐水对照样；TRV接种TRV空载体对照样；TRVCRTISO接种携。
11、带CRTISO基因片段病毒样；0016图5A为烟草中病毒介导的CRTISO基因沉默后叶片在低温弱光胁迫条件下FV/FM的变化，FV/FM是指植物叶片光合系统II的最大光化学效率；B为病毒介导的CRTISO基因沉默后叶片在低温弱光胁迫条件下NPQ的变化非光化学耗散。具体实施方式0017一种烟草类胡萝卜素异构酶基因，其碱基序列如SEQIDNO1所示。0018所述的烟草类胡萝卜素异构酶基因的应用，所述烟草类胡萝卜素异构酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。0019一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过瞬时表达技术干扰、沉默烟草类胡萝卜素异构酶基因，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。0020所述的提高烟草。
12、类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草类胡萝卜素基因的特异性核说明书CN104152473A3/5页5苷酸片段作为引导序列，将特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体中，构建所述烟草类胡萝卜素基因的病毒诱导基因沉默载体和RNAI载体。00211、NTCRTISO基因的同源克隆以及表达模式分析0022根据番茄和马铃薯的前番茄红素异构酶基因序列通过同源克隆的方式，从栽培烟草红花大金元CDNA中PCR扩增CRTISO基因序列，回收目的片段，TA连接，转化大肠杆菌DH5感受态，37培养，菌落PCR鉴定得到阳性克隆。阳性质粒提取，最后进行质粒酶切鉴定和测序得到普通烟草NTCRTISO编码区全长序列。获得。
13、的NTCRTISO编码区CDS全长序列1716BP，共编码571个氨基酸。该基因序列已经上传至NCBI，GENBANKKJ909512。并且对该基因在普通烟草体内的时空表达模式进行了分析。采集栽培烟草的各个时期团棵期、旺长期、现蕾期、盛花期的各类器官根、茎、叶5叶位，10叶位，15叶位、花，样品，并提取它们的总RNA，反转录成为CDNA。定量PCRBIORAD,USA分析NTCRTISO时空表达模式。如附图1中所示，NTCRTISO在叶中稳定表达，在现蕾期表达量较高，且多表达在中部叶中表达水平10叶位15叶位5叶位花茎根。0023具体步骤如下所述0024所用引物为CRTISOF5ATGGCGT。
14、TGAGGTTTCAACCTTTTTC3和CRTISOR5TCATATCCCTACAGCATCAAGAAGCTG3。作为模板的CDNA来自栽培烟草红花大金元旺长期幼叶片RNA提取按照QIAGEN公司RNA提取试剂盒说明书进行。按照REVERSETRANSCRIPTIONSYSTEM试剂盒说明书，以OLIGODT18TAKARA公司为引物合成CDNA第一链。首先以CDNA为模板PCR扩增反应体系及条件如下反应体系为50L，模板2L，引物各25L10M，DNTPS10M4L，BUFFER10，MG2PLUS5L，TAQ酶北京全式金生物技术有限公司05L，灭菌水335L。其反应参数94预变性3MIN。
15、，94变性30S，60退火30S，72延伸90S，35个循环；最后72延伸10MIN。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶提取试剂盒GELEXTRACTIONKIT，购自QIAGEN公司从琼脂糖凝胶上纯化目标CRTISOCDS片段方法参照试剂盒说明书，用EPPENDORF公司BIOPHOTOMETER测定浓度后用于连接或存20备用。纯化的CRTISOCDS片段与PMD19T载体TAKARA公司，氨苄霉素抗性连接SOLUTIONILIGASE，TAKARA公司，按照试剂盒说明书操作，热激转化4290S入大肠杆菌DH5TAKARA公司。从得到的克隆转化子中用菌落PCR引物为上述扩增引物鉴定阳性克隆。
16、，提取阳性克隆质粒NTCRTISOT小提质粒试剂盒，QIAGEN公司，方法参照试剂盒说明书进行。阳性质粒送生工生物工程上海股份有限公司测序。0025表达模式分析所用烟草器官样品均在云南大田采样，所用的引物为CRTISOQF/RCRTISOQF5CGTGTACACCGAGAATATGATG3和CRTISOQR5GTAGGCGAGAGTCAAGCACTC3。采用26SRNA作为内参。PCR扩增反应条件95预变性3MIN；9520S,6020S,40个循环。反应体系1LCDNA，10LSYBRGREEN购自QIAGEN公司，上下游引物各1L10M，补DDH2O至20L。00262、本氏烟草中，下调C。
17、RTISO基因表达提高类胡萝卜素含量并增强植物抵御光抑制能力0027类胡萝卜素对烟草的香味品质有重要的贡献，为了研究如何增加烟草中类胡萝卜素含量，我们采用了一种快速可靠的方法，利用烟草脆裂病毒介导的烟草内源基因沉默，在本氏烟中下调了CRTISO基因的表达，在CRTISO基因表达抑制的情况下，烟草中类胡萝卜素说明书CN104152473A4/5页6含量发生显著变化，同时在正常生长条件和胁迫条件下的光合系统效率也随之变化。0028烟草脆裂病毒载体感染能力强，病毒症状轻，空载体侵染与对照植株生长发育无明显差异。TRVCRTISO混合阳性菌株接种本氏烟草后，如图2所示，农杆菌侵染35天后，与空白对照和。
18、阴性对照相比，侵染TRVCRTISO的烟草叶片产生黄色斑块，表明CRTISO基因被沉默后产生了较明显的表型。采用荧光定量PCR对烟株新叶中CRTISO基因进行表达量分析，发现CRTISOMRNA转录水平显著降低，只有对照植株的15甚至更低，说明TRVVIGS系统沉默本氏烟草的CRTISO基因效果是显著的图3。对CRTISO基因表达受到抑制的植株进行类胡萝卜素代谢物分析，胡萝卜素、紫黄质、新黄质和叶黄素含量都上升图4，这一发现将有助于通过基因工程手段培育高含量类胡萝卜素，尤其是胡萝卜素的烟株，提高烟草的香味品质。0029类胡萝卜素在植物的光合作用过程中承担着重要的角色。本发明考察了CRTISO基。
19、因对光合系统的重要作用。代谢结果显示叶绿素A和B的含量在CRTISO基因沉默植株中升高，这将有利于植物的光合能力的提高。低温弱光是常见的光抑制的条件，在光抑制条件下，对照植株与CRTISO基因沉默植株PSII最大光化学效率FV/FM都出现显著下降，但CRTISO基因沉默植株下降较为缓慢，说明其光合作用能力增强，烟株表现出出色的抵御光抑制能力图5A。而植物光合系统生理状态另一个重要参数非光化学耗散NPQ反映植株过剩光能耗散的状态，CRTISO基因沉默烟株NPQ在光抑制条件下显著低于对照植株图5B，这可能由于光合作用能力增强，大部分能量用于光合作用，无需通过热耗散途径散发多余的能量。0030具体步。
20、骤如下所述0031构建TRVCRTISO载体所用引物为上游引物CRTISOVIGSF5ATGGTACCGATCTCCTAGCCTTCTTGCTTGC3含KPNI酶切位点；下游引物CRTISOVIGSR5CACTCGAGTGTACTCATTGCTTCGGCGAT3含XHOI酶切位点；以1中测序正确的NTCRTISOT质粒为模版扩增，回收纯化PCR产物，使用KPNI和XHOI酶切PCR回收片段和TRV2病毒载体，回收目的片段并连接，转化细菌DH5，TAKARA公司，菌落PCR鉴定阳性克隆，提质粒得到目的载体酶切验证并测序。测序正确的TRV2CRTISO质粒转化农杆菌，菌落PCR验证阳性后，注射本氏。
21、烟烟草。0032病毒载体接种本氏烟草叶片后35天，提取烟草同叶位叶片的RNA并反转录成CDNA，实时定量PCR分析CRTISO的沉默效果相对于未接种的烟草对照和接种带有空病毒载体的烟草。CRTISO沉默效果检测用引物为1中CRTISOQF/R引物。0033TRV病毒诱导的基因沉默步骤如下00341农杆菌感受态制备挑取农杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENSGV3101利福平RIF抗性，25MG/L，SIGMAGV3101冻存菌菌株购自英国JOHNINNESCENTER，在LB含25MG/LRIF平皿划线28培养12天，将生长良好的单菌落接种于35MLLB含25MG/LRIF液体培。
22、养基中，28振荡培养过夜；吸出05ML菌液接种于50MLLB含25MG/LRIF液体培养基，28振荡培养68小时至OD600为05左右，将菌液转移至50ML离心管，放置冰上30分钟，然后离心收集菌体5,000RPM，10分钟，4；弃去上清，加入1ML冰冷的015M氯化钠溶液轻轻悬浮菌体，再加入约10ML015M氯化钠溶液，使菌体分散均匀，离心收集菌体5,000RPM，10分钟，4；弃去上清，加入1ML冰冷的20MM氯化钙溶液悬浮菌体，将制说明书CN104152473A5/5页7好的感受态细胞以01ML/管分装，在液氮中速冻1分钟后保存在70备用。00352质粒转化农杆菌分别挑取TRV1、TRV。
23、2、TRV2PDS和TRV2CRTISO质粒1L，加入含01ML的农杆菌感受态的EPPENDORF管中，冰上放置30分钟；将含有该质粒的农杆菌感受态放入液氮速冻1分钟，然后37温育5分钟；加入1MLLB液体培养基，28震荡培养3小时；5,000RPM离心1分钟，弃去上清，加入200LLB液体培养基，重悬沉淀；取200L重悬液即转化产物均匀地涂于含25MG/LRIF和50MG/L卡那霉素KANA的LB平板上，28培养23天；挑取适量的转化菌斑PCR鉴定无误后摇菌注射本氏烟烟苗。00363本氏烟草的栽培条件为231，光照16H，黑暗8H，602的相对湿度。00374由于八氢番茄红素去饱和酶基因PD。
24、S具有光保护作用，其沉默后植物出现光漂白现象，因此以PDS基因作为指示基因来监控TRV载体的侵染效率。分别挑取TRV1、TRV2、TRV2PDS和TRV2CRTISO菌落接种至5MLLB培养基50MG/LKAN，25MG/LRIF，28过夜活化。将活化后的菌液分别接入同样的50MLLB培养基中，再加入10MM2N吗啉基乙磺酸MES和20M乙酰丁香酮AS，28过夜培养。低速离心菌液后，用侵染缓冲液10MMMGCL2，10MMMES，200MAS重悬菌体。使用分光光度计在600NM波长下调整OD值至10，室温静置3H后接种。空白对照注射生理盐水，TRV1TRV2TRV作为阴性对照，TRV1TRV2。
25、PDSTRVPDS作为阳性对照，TRV1TRV2CRTISOTRVCRTISO为实验组，各菌液按照11的比例混合，用无针头的无菌注射器注入烟草的下位叶片中。0038试剂配制方法00391LB液体培养基1L10G胰蛋白胨，10GNACL，5G酵母提取物，加入1L蒸馏水溶解，高温高压灭菌。004021M2N吗啉基乙磺酸MES储备液DDH2O溶解，过滤灭菌，20储存备用。00413200MM乙酰丁香酮AS储备液二甲基亚砜DSMO溶解，20储存备用。00424侵染缓冲液10MMMGCL2，10MMMES，200MAS。说明书CN104152473A1/2页800010002序列表CN104152473A2/2页9序列表CN104152473A1/3页10图1图2说明书附图CN104152473A102/3页11图3图4说明书附图CN104152473A113/3页12图5说明书附图CN104152473A12。