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用于在狗中治疗淋巴瘤的伊达比星
    本发明涉及伊达比星(idarubicin)用于治疗犬类癌症的用途。具体地，本发明涉及伊达比星用于治疗犬类淋巴瘤的用途。

    【发明背景】

    20％到25％的狗在其生命中会发生癌症，存活10年或更久的狗有50％发生癌症的可能性。即便如此，目前没有批准用于治疗犬癌症的药物。

    狗中最普遍的癌症是淋巴瘤。针对犬淋巴瘤的化学疗法包括蒽环类药剂多柔比星的标示外(off-label)使用。然而，多柔比星的使用通常受限于兽医肿瘤医师，因为其必须通过缓慢的静脉输注来施用。该施用伴随着发生外渗导致严重组织毒性的风险，和患者发生变应性反应导致休克的风险。限制多柔比星剂量的副作用通常是中性白细胞减少。多柔比星的长期使用受限于其引起心脏毒性的倾向和药物抗性的发生。

    因此，对用于治疗犬类淋巴瘤的其他化学疗法存在持续的需求。优选地，这类疗法应当允许更便利的施用途径，使得施用可以由非专业人士进行。更不容易发生抗性的疗法会是尤其有价值的，例如能够在已经对多柔比星发生抗性的动物中使用的疗法。优选的疗法应当是不与其他化学治疗药剂具有不良相互作用的，尤其优选的是与其他药剂组合使用时提供协同效果的药剂。

    伊达比星(I)是被批准用于人化学疗法中的蒽环类药剂，并且可以通过静脉和口服两种途径施用给人类患者。注射用伊达比星可作为通用药物获得和以名称获得。口服配制物在欧洲以名称Zavedos出售。其(特别是在口服施用后)被代谢为伊达比星醇(II)，所述伊达比星醇也是有效的细胞毒性剂。

    

    伊达比星在猫中的效果已被简要研究(Moore等，J.Am.Vet.Med.Assoc.1995，206(10)，1550-1554)。尚未报道伊达比星在狗中的治疗性用途或药物代谢动力学。我们目前发现，伊达比星尤其适用于治疗犬类淋巴瘤。其可以便利地口服施用，并且口服的生物利用度不受饲喂的不利影响。其对已发生多柔比星抗性的肿瘤也有活性。

    【发明内容】

    本发明第一方面提供了在狗中治疗淋巴瘤的方法，包括对需要这类治疗的狗施用治疗有效量的伊达比星或其药学可接受的盐。

    本发明在另一方面中提供了多柔比星或其药学可接受的盐用于制造用于在狗中治疗淋巴瘤的药物的用途。

    本发明的另一方面提供了用于在狗中治疗淋巴瘤的药物组合物，其包含伊达比星或其药学可接受的盐和药学可接受的载体。

    发明详述

    本发明一般涉及伊达比星(I)用于在狗中治疗淋巴瘤的用途。伊达比星的这种用途允许可能等于或优于目前使用的方案的治疗效果。口服施用的可能性更加便利并提供改进的安全性。

    在本文中使用时：

    ·术语“治疗”包括姑息治疗(抑制疾病发展)、治愈治疗(诱导平息)和预防治疗(维持平息)，和在疾病复发的情况下的抢救治疗；

    ·术语“狗”包括驯养狗的所有品种和变种，以及属于动物园收集或圈养繁殖程序部分的非驯养物种(例如狼和狐狸)。

    伊达比星可以以游离碱形式使用，或者以药学可接受的盐形式使用。在本文中使用时，“药学可接受的”包括“兽医可接受的”。药学可接受的伊达比星盐包括其酸加成盐。

    合适的酸加成盐由形成无毒盐的酸形成。例如包括乙酸盐、天冬酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐(gluceptate)、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、六氟磷酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴化物/溴化物、氢碘化物/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐(naphthylate)、2-萘磺酸盐、烟酸盐(nicotinate)、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、巴莫酸盐(pamoate)、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、糖二酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。

    一种尤其优选的盐是伊达比星盐酸盐。

    以固体形式使用伊达比星时，预期可使用任何合适的固体形式。因此，本发明不限于任何具体的溶剂化形式或未溶剂化形式，或者任何具体的多晶型形式。

    适用于本发明目的的伊达比星可得自Tecoland Corporation，NervianoMedical Sciences(意大利)、Pfizer Cork(爱尔兰)或TPM AntibioticosS.p.A(意大利)。或者可以根据EP337665及其中参考文献中公开的方法制备伊达比星。适用于本发明目的的伊达比星盐酸盐可得自Transo-pharm。

    用于本发明的伊达比星一般应以适合受试狗的期望施用途径的方式配制。配制物可包含一种或多种药学可接受的赋形剂，如本领域所公知。

    在一个优选的实施方案中，口服施用伊达比星。适用于口服施用的配制物包括固体和液体配制物。

    固体配制物包括片剂、调味片剂、含微粒的胶囊、液体或粉末；锭剂(包括填充液体的锭剂)、咀嚼剂；多微粒剂和纳米微粒剂；凝胶、固溶体、脂质体、薄膜(包括粘膜-粘附性薄膜)、栓剂、喷雾和液体配制物。

    液体配制物包括悬浮液、溶液、糖浆和酏剂。这类配制物可以在软胶囊或硬胶囊中用作填充剂，并典型地包含载体，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素，或合适的油，和一种或多种乳化剂和/或悬浮剂。也可以通过将例如来自于囊剂的固体重建来制备液体配制物。

    对于片剂剂型而言，取决于剂量，药物可占剂型的1重量％到80重量％，更典型地占剂型的5重量％到60重量％。除药物之外，片剂一般还含有崩解剂。崩解剂的例子包括淀粉乙醇酸钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、微晶纤维素、低级烷基取代的羟丙基纤维素、淀粉、预胶化的淀粉和藻酸钠。通常崩解剂会占剂型的1重量％到25重量％，优选5重量％到20重量％。

    通常使用粘合剂赋予片剂配制物粘合特性。合适的粘合剂包括微晶纤维素、明胶、聚乙二醇、天然和合成的胶质、聚乙烯吡咯烷酮、预胶化的淀粉、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。片剂也可含有稀释剂，例如乳糖(一水合物、喷雾干燥的一水合物、无水等等)、甘露醇、木糖醇、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、微晶纤维素、淀粉和磷酸氢钙二水合物。

    片剂也可任选地包含表面活性剂例如十二烷基硫酸钠和聚山梨酯80，和助流剂例如二氧化硅和滑石。存在时，表面活性剂可占片剂的0.2重量％到5重量％，助流剂可占片剂的0.2重量％到1重量％。

    片剂通常还含有润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酰延胡索酸钠、和硬脂酸镁与十二烷基硫酸钠的混合物。润滑剂通常占片剂的0.25重量％到10重量％，优选地0.5重量％到3重量％。

    其他可能的成分包括抗氧化剂、着色剂、调味剂、防腐剂和遮味剂。

    可以用例如硬明胶或软明胶制造胶囊。明胶可以与例如染料(例如氧化铁红)或遮光剂(例如二氧化钛)混合。可以用例如粉末填充胶囊，所述粉末包含活性剂和赋形剂，例如崩解剂、润滑剂和结构基质。

    用于胶囊配制物的合适填充物的例子是粉末，所述粉末由伊达比星盐酸盐(5重量％)、微晶纤维素(93重量％)和棕榈酰硬脂酸甘油脂(2重量％)组成。1kg该混合物足够用于10,000粒胶囊，每粒胶囊含有5mg伊达比星盐酸盐。

    在一个替代性的实施方案中，肠胃外施用伊达比星，即直接进入血流中，直接进入肿瘤中(肿瘤内)，或进入内部器官中。肠胃外施用的合适手段包括静脉内、动脉内和血管内施用。

    肠胃外配制物典型地是水性溶液，其可含有赋形剂例如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选地缓冲至3到9的pH)，但是对一些应用而言，它们可能更适合被配制为无菌非水性溶液，或配制为要与合适载剂(例如无菌、无热原的水)组合使用的干燥形式。

    可以使用本领域技术人员公知的标准制药技术，容易地实现(例如通过冷冻干燥)在无菌条件下制备肠胃外配制物。

    可以根据本发明使用伊达比星治疗犬类淋巴瘤。

    要施用的伊达比星的剂量应由兽医考虑狗的大小、疾病的进展和任何其它相关因素来决定。典型地，伊达比星的剂量在口服给予体重少于15kg的狗时可在0.4和1.0mg/kg之间，口服给予体重大于或等于15kg的狗时在9和25mg/平方米之间。提供0.5mg、1mg、5mg、10mg和25mg剂量的单位剂型(片剂或胶囊)允许便利地治疗大部分品种的狗。

    给药可以以合适的间隔重复，例如每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次，直至实现期望的结果。可能有节律地进行伊达比星给药，其中给予小的每日剂量，从而诱导抗血管生成效应或限制疾病发展。

    对静脉内施用而言剂量会更低，例如0.03和3mg/kg之间、0.05和1.5mg/kg之间或0.1和1mg/kg之间。

    实施例1-在客户拥有的患有淋巴瘤的狗(体重大于或等于15kg)中测定PF-00929868-01(伊达比星)的最大耐受口服剂量(MTD)和剂量限制性毒性(DLT)的研究

    用12.5mg/m²剂量的口服伊达比星的单次治疗对患有淋巴瘤且体重大于或等于15kg的三只狗进行治疗。该剂量在3周的时间段内被良好耐受。

    实施例2-在犬淋巴瘤活检和淋巴瘤细胞系中对淋巴组织增生进行伊达比星的体外评价

    比较应答伊达比星和多柔比星的各自IC₅₀的抗增殖数值。该研究使用体外测定法，所述体外测定法用使用标准组织培养技术维持许多代的已建立的细胞系和离体衍生的犬淋巴瘤细胞进行。结节组织得自MSU兽医诊所的犬类淋巴瘤患者。在接收结节组织的24小时内或从冷冻细胞系原种传到第10代之前进行测定。

    使用的已建立的细胞系是3132和CI-1，其分别是B细胞和T细胞起源的犬淋巴细胞系。在具有5％CO₂的潮湿培养箱中，于RPMI完全培养基中培养这些细胞。

     材料和方法：

    抗增殖测定：(1)犬淋巴瘤细胞系。3132和CI-1分别是B细胞和T细胞起源的犬淋巴细胞系。在具有5％CO₂的潮湿培养箱中于37℃下，在补充有10％FBS(3132)或20％FBS(CI-1)的RPMI完全培养基(改进的RPMI 1640、10mM Hepes、2mM Glutamax、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和0.25ug/mL两性霉素B)中培养这些细胞。(2)离体犬淋巴瘤结节组织。由密歇根州立大学(MSU)兽医学院的兽医职员切下恶性淋巴结节，置于运输培养基(补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和0.25ug/mL两性霉素的改进的RPMI 1640完全培养基)中。通过切碎成小片并经过组织筛网，在24小时内加工结节。将细胞悬浮液在200xg离心，去除上清液，并在室温下将细胞沉淀物在NH₄Cl(0.15M)中重悬10分钟。通过离心沉淀细胞悬浮液；去除NH₄Cl并用Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤一次，之后重悬于增殖培养基(改进的RPMI完全培养基、1％FBS、50nM 2-巯基乙醇、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和0.25ug/mL两性霉素B)中。然后使细胞悬浮液经过100μm尼龙细胞过滤器(BD-Falcon)并使用血细胞计数器计数。在单独的增殖培养基、补充有0.005％(热失活的、福尔马林固定的Staphylococcus Aureus细胞(SAC)，Calbiochem)和10ng/mL犬IL-2(R&D Systems)的增殖培养基、或补充有125ng/mL刀豆素A(Sigma)和125ng/mL脂多糖(LPS；Calbiochem)的增殖培养基任二培养基中培养细胞。(3)体外抗增殖测定方法。将在上述培养基中培养的细胞以1×10³细胞/孔(淋巴瘤细胞系)或2×10⁵细胞/孔(淋巴结细胞)的密度涂布于96-孔Costar平板(Corning)中，并在具有5％CO₂的潮湿培养箱中于37℃下在不同浓度的测试化合物中暴露至多5天。根据制造商的说明，使用CellTiter水性非放射性细胞增殖测定法(Promega)测定对增殖的影响。通常使用可溶的四唑盐(MTS)和电子偶联剂间接测量增殖。使用Softmax Pro 4.6软件(Molecular Devices)，通过Spectramax平板读数器上490nM处的吸光度监测MTS生物还原成为组织培养基中可溶的甲臜(formazan)产物。使用GraphPad Prism 4.0将数据图示为百分比对照，并使用具有S形剂量应答的非线性回归模型拟合IC₅₀曲线。(4)数据分析：对结节组织而言，通过Prism 4.0(Graphpad Software)以以下方式处理数据。针对未刺激的、刺激的和所有药物治疗(一式三份)计算来自原始光密度值(OD)的均值，并用于下式中：

     (平均药物治疗OD-平均未刺激OD)×100＝％对照

    增殖

    (平均刺激OD-平均未刺激OD)

    对细胞系而言：

     (平均药物治疗OD-平均介质空白OD)×100＝％对照

    增殖

    (平均未处理OD-平均介质空白OD)

    计算后针对每个药物浓度(或标准)对这些值做图，并通过点对点分析计算IC₅₀。对IC₅₀值分析而言，百分比对照值不允许超过100％或低于0％。本文报道了每个淋巴结和细胞系的IC₅₀值。

    多柔比星和伊达比星抗增殖IC₅₀

    

    

    *ND＝未完成

    LPS＝脂多糖

    ConA＝刀豆素A

    SAC＝Staphylococcus Aureus Cowan

    IL 2＝白介素2

    伊达比星(IDA)和多柔比星产生了对犬淋巴瘤结节组织增殖的剂量依赖型抑制。它们还抑制了犬淋巴瘤细胞系的增殖，伊达比星比多柔比星对所有结节和细胞系淋巴瘤(无论是B细胞还是T细胞株系)更为有效和更具细胞毒性。在被诊断为患有化学疗法抗性淋巴瘤的狗的所有结节组织增殖抑制中，伊达比星比多柔比星更加有效。

    尽管本发明在上文参照公开的实施方案进行描述，但是本领域技术人员应当容易了解，详述的特定实验仅用于阐述本发明。应当理解，可以进行多种变更而不偏离本发明的思想。因此，本发明仅由权利要求书限制。