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具有末端修饰的抗原结合分子
相关申请
本申请要求2012年9月13日提交的美国临时申请号61/700,529和 2013年3月15日提交的美国临时申请号61/789,856的优先权，该美国临 时申请号的内容在此以其整体引入作为参考。
背景技术
循环中已存在的抗体可以产生于偶发性或职业性暴露于外来蛋白质， 感染或接种后用抗体作为治疗剂，或由于未知原因。
这些已存在的抗体产生与患者的临床表现不一致的错误结果。由于多 种内源抗体中广范围的亲和力和抗体亲抗原性或二者，干扰可变、复杂和 不可预测。已存在的抗体不仅难以识别，而且清除也有问题。由于抗体所 产生的现象的变异，确定已存在的抗体的干扰的确切机制具有挑战性。已 存在的抗体可以在一些测定中增加读数，但在其他测定中减小结果。已存 在的抗体可以在一些测定中通过非线性来鉴定，但在其他测定中在系列稀 释上显示完美的线性。来自一些抗体的干扰可以通过市售“封闭试剂”来 封闭，但来自其他抗体的干扰则不然。
因此，存在产生与希望的目的靶标结合但与已存在的抗体具有减少的 相互作用或无相互作用的结合分子的需要。
发明概述
本发明基于由存在于健康人志愿者血清中的已存在的抗体识别并产生 已存在的免疫应答的几种人V_H和V_Lκ单结构域支架C端中的新表位 (neoepitope)或新表位样结构的惊人发现。对这些人V_H和V_L单结构域支架 的已存在的免疫应答的鉴定是惊人和意外的发现，因为这些支架源自人来 源，而不是合成文库。因此，人们未预期或预测基于这些人衍生的支架的 已存在的免疫应答。此外，通过氨基酸的添加或缺失修饰V_H或V_Lκ单结 构域支架的C端消除了已存在的免疫应答。
因此，本公开涉及包含C端修饰、N端修饰或C+N端修饰的抗原结 合结构域(ABD)，其中C端修饰、N端修饰或C+N端修饰包括添加或缺失 至少一个氨基酸残基，使得对ABD添加或缺失至少一个氨基酸残基消除 了已存在的免疫应答而不干扰ABD与其靶标的结合，例如，至少一种已 存在的抗体与ABD的相互作用而不干扰ABD与其靶标的结合。
在一方面，本公开涉及包含C端修饰的抗原结合结构域(ABD)，其中 C端修饰包括添加或缺失至少一个氨基酸残基，使得对ABD添加或缺失 至少一个氨基酸残基消除了已存在的免疫应答而不干扰ABD与其靶标的 结合，例如，至少一种已存在的抗体与ABD的相互作用而不干扰ABD与 其靶标的结合。
在一个实施方案中，暴露ABD的C端，使得暴露的C端可用于与已 存在的抗体的相互作用，其中C端修饰减少C端对已存在的抗体的暴露。
在一个实施方案中，C端修饰通过选自以下的机制修饰ABD的C端： 通过改变C端ABD的三维构型使得已存在的抗体不再识别ABD来消除已 存在的抗体的相互作用，改变C端ABD对已存在的抗体的暴露，改变ABD 和已存在的抗体之间的空间位阻，破坏C端中的至少一个构象新表位，及 保护ABD的构架中的至少一个新表位。
在一个实施方案中，ABD选自：单链抗体；纳米抗体；包含IgG或 HSA与其他ABD(如单链Fv、纳米抗体或其他小ABD)的融合的多结构域 抗体；包含单链、scFv、sdAb、Fab、双抗体、scFab或任意其他ABD的 双特异性抗体；或将暴露正常情况下未暴露的N端或C端序列的Fc融合 蛋白。在另一方面，本公开涉及包含C端修饰的抗原结合结构域(ABD)， 其中C端修饰包括缺失至少一个氨基酸残基，使得从ABD缺失至少一个 氨基酸残基消除了已存在的抗体与ABD的相互作用而不干扰ABD与其靶 标的结合。
在一方面，本公开涉及分离的包含C端修饰的单结构域抗体，其中C 端修饰包括添加或缺失至少一个氨基酸残基，使得对单结构域抗体添加或 缺失至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在的抗体与单结构域抗体的 相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合。
在一个实施方案中，暴露单结构域抗体的C端，使得暴露的C端可用 于与已存在的抗体的相互作用，其中C端修饰减少C端对已存在的抗体的 暴露。
在一个实施方案中，C端修饰通过选自以下的机制修饰单结构域抗体 的C端：通过改变C端单结构域抗体的三维构型使得已存在的抗体不再识 别单结构域抗体来消除已存在的抗体的相互作用，改变C端单结构域抗体 对已存在的抗体的暴露，改变单结构域抗体和已存在的抗体之间的空间位 阻，破坏C端中的至少一个构象新表位，及保护单结构域抗体的构架中的 至少一个新表位。
在一个实施方案中，单结构域抗体包含选自SEQ ID NO:8、SEQ ID  NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO: 13的人V_H构架支架。在一个实施方案中，氨基酸残基选自天然存在的氨 基酸或非天然存在的氨基酸。在一个实施方案中，C端修饰包括至少一个 氨基酸残基的缺失。在一个实施方案中，C端修饰进一步包括从单结构域 抗体的C端缺失至少一个附加氨基酸残基。在一个实施方案中，C端修饰 进一步包括从单结构域抗体的C端缺失至少两个附加氨基酸残基。在一个 实施方案中，C端修饰包括从单结构域抗体的C端缺失一个氨基酸至三个 氨基酸。在一个实施方案中，C端修饰包括缺失选自Arg、Arg-Thr、 Arg-Thr-Val、Gly-Gln和Gly-Gln-Pro的氨基酸序列。
在一个实施方案中，单结构域抗体是人V_L构架支架，且C端修饰包 括至少一个氨基酸残基的添加或缺失，其中人V_L是κ轻链，其中κ轻链 的C端以通过Kabat编号确定的107位的Lys氨基酸残基结束。在一个实 施方案中，单结构域抗体是选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的人V_L构架支架。在一个实施方案中，氨基酸残基选自天然存在的氨基酸或非天 然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，C端修饰进一步包括对单结构 域抗体的C端添加或缺失至少一个附加氨基酸残基。在一个实施方案中， C端修饰进一步包括对单结构域抗体的C端添加或缺失至少两个附加氨基 酸残基。在一个实施方案中，C端修饰包括从V_L VEIK C端序列缺失一个 氨基酸至三个氨基酸。在一个实施方案中，C端修饰包括对V_L序列VEIK 添加一个氨基酸至三个氨基酸，其中附加的氨基酸选自天然或非天然氨基 酸残基。在一个实施方案中，C端修饰包括添加选自Arg、Arg-Thr、 Arg-Thr-Val、Arg-Thr-Val-Ala和Arg-Thr-Val-Ala-Ala的氨基酸序列。
在一个实施方案中，与不含C端修饰的单结构域抗体相比，C端修饰 使已存在的抗体应答消除至少约10％。
在一个实施方案中，本公开涉及编码含有C端修饰的V_H单结构域抗 体组合物的核酸，其中C端修饰包括添加或缺失至少一个氨基酸残基，使 得从单结构域抗体添加或缺失至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在 的抗体与单结构域抗体的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结 合；包含该核酸的表达载体；及包含该表达载体的宿主细胞或生物体。
在一个实施方案中，本公开涉及编码分离的含有C端修饰的V_L单结 构域抗体的核酸，其中C端修饰包括添加或缺失至少一个氨基酸残基，使 得对单结构域抗体添加或缺失至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在 的抗体与单结构域抗体的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结 合，其中V_L是κ轻链，其中κ轻链的C端以通过Kabat编号确定的107 位的Lys氨基酸残基结束；包含该核酸的表达载体；及包含该表达载体的 宿主细胞或生物体。
在另一方面，本公开涉及包含含有C端修饰的单结构域抗体的药物组 合物，其中C端修饰包括添加或缺失至少一个氨基酸残基，使得对单结构 域抗体添加或缺失至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在的抗体与单 结构域抗体的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合。
在另一方面，本公开涉及在个体中消除已存在的免疫应答的方法，其 包括：施用含有C端修饰的单结构域抗体，其中C端修饰包括添加或缺失 至少一个氨基酸残基，使得对单结构域抗体添加或缺失至少一个氨基酸残 基消除了至少一种已存在的抗体与单结构域抗体的相互作用而不干扰单结 构域抗体与其靶标的结合。
在另一方面，本公开涉及在具有已存在的抗单结构域抗体的抗体的个 体中改善对单结构域抗体的应答的方法，其包括：施用含有C端修饰的单 结构域抗体，其中C端修饰包括添加或缺失至少一个氨基酸残基，使得对 单结构域抗体添加或缺失至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在的抗 体与单结构域抗体的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合。
在另一方面，本公开涉及用单结构域抗体预测已存在的抗体是否将产 生已存在的免疫应答的方法，其包括：使单结构域抗体与人样品接触；测 定已存在的抗体(如果存在于人样品中)是否结合单结构域支架；通过缺失 至少一个氨基酸残基来修饰单结构域抗体的C端区域，使得C端修饰消除 了已存在的抗体与单结构域抗体的相互作用。在一个实施方案中，人样品 选自血液和血清。
附图简述
图1显示抗体中可以产生导致对已存在的抗体的应答的暴露C端的切 割位置(位置A、B、C)；
图2A-2B显示可以包含暴露的C端的抗体的实例。2A是单克隆抗体 和Fab-(Fab)和Fv-片段(Fv)和单链抗体(scFv)；2B是单结构域抗体(VH和 VL)；
图3显示对三种人单结构域V_H支架和三种人V_L支架的已存在的应 答；
图4用具有多种C端氨基酸添加的VH-HVHP426单结构域支架显示 人血清中已存在的应答；
图5用具有多种C端氨基酸添加的VH-HVHP420单结构域支架显示 人血清中已存在的应答；
图6用具有多种C端氨基酸添加的VH-HVHM81单结构域支架显示 人血清中已存在的应答；
图7用具有多种C端氨基酸添加的VH稳定的S-S VH-HVHP421S单 结构域支架显示人血清中已存在的应答；
图8用具有多种C端氨基酸添加的VH稳定的S-S VH-HVHP430S 单结构域支架显示人血清中已存在的应答；
图9用具有多种C端氨基酸添加的VH稳定的S-S VH-HVHP426S 单结构域支架显示人血清中已存在的应答；
图10用具有多种C端氨基酸添加的VL-HVLP335单结构域支架显示 人血清中的应答；
图11用具有多种C端氨基酸添加的VL-HVLP325单结构域支架显示 人血清中的应答；
图12用具有多种C端氨基酸添加的VL-HVLP351单结构域支架显示 人血清中的应答；
图13用具有多种C端氨基酸添加的VL稳定的S-S HVLP3103S单结 构域支架显示人血清中的应答；
图14用具有多种C端氨基酸添加的VL稳定的S-S HVLP325S单结 构域支架显示人血清中的应答；
图15用具有多种C端氨基酸添加的VL稳定的S-S HVLP351S单结 构域支架显示人血清中的应答；
图16用具有C端氨基酸缺失的VL-VL稳定的S-S单结构域支架 HVLP335、HVLP3103S和HVLP325显示人血清中的应答；
图17用具有C端氨基酸缺失的VL-VL稳定的S-S单结构域支架 HVLP325S、HVLP351和HVLP351S显示人血清中的应答；
图18用具有C端氨基酸缺失的VH-VH稳定的S-S单结构域支架 HVHP426、HVHP426S和HVHP420显示人血清中的应答；
图19用具有C端氨基酸缺失的VH-VH稳定的S-S单结构域支架 HVHM81、HVHP421S和HVHP430S显示人血清中的应答；
图20用具有C端氨基酸添加或缺失的VL单结构域支架显示人血清 中的应答；和
图21显示单结构域抗体的带状示意图(ribbon diagram)。
发明详述
为了提供对说明书和权利要求的清楚理解，下文方便地提供以下定义。
本文所用的术语“抗原结合结构域”或“ABD”指结合抗原的具有暴 露的C端的蛋白质或蛋白质的片段。ABD的实例包括但不限于C端暴露 的抗体、单结构域抗体、C端暴露的抗体可变区(例如V_H或V_L)、C端暴 露的单链抗体片段(scFv)，C端暴露的单链双抗体、至少一个C端暴露 的Fab片段、至少一个C端暴露的F(ab)₂片段、至少一个C端暴露的包 含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段、至少一个C端暴 露的由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段及至少一个C端暴露的 dAb片段。ABD包括但不限于单链抗体，纳米抗体，包含IgG或HSA与 其他ABD(如单链Fv、纳米抗体或其他小ABD)的融合的多结构域抗体， 包含单链、scFv、sdAb、Fab、双抗体、scFab或任意其他ABD的双特异 性抗体，或将暴露正常情况下不暴露的N端或C端序列的Fc融合蛋白。 本文所用的术语“C端修饰”指在其暴露的C端具有修饰的ABD(例如单 结构域抗体)，该修饰改变C端的结构，使得已存在的抗体不再与ABD(例 如单结构域抗体)的修饰C端相互作用。该改变可以是向ABD(例如单结构 域抗体)的C端添加至少一个氨基酸残基，或从ABD(例如单结构域抗体) 的C端缺失至少一个氨基酸残基。向ABD的C端添加至少一个氨基酸残 基掩盖或封闭了暴露的C端，通过掩盖新表位使得已存在的抗体不再与掩 盖或封闭的C端相互作用，使得它不再可用于与已存在的抗体相互作用。 从ABD的C端缺失至少一个氨基酸残基通过改变可用于与已存在的抗体 相互作用的新表位来修饰C端。由于它涉及缺失至少一个氨基酸残基，术 语“C端修饰”明确涉及从未修饰的V_H构架缺失至少一个氨基酸，且特 别排除来自ABD的恒定区的任意氨基酸。
本文所用的术语“N端修饰”指在其暴露的N端具有修饰的ABD(例 如单结构域抗体)，该修饰改变了N端的结构，使得已存在的抗体不再与 ABD(例如单结构域抗体)的修饰N端相互作用。该改变可以是向ABD(例 如单结构域抗体)的N端添加至少一个氨基酸残基，或从ABD(例如单结构 域抗体)的N端缺失至少一个氨基酸残基。向ABD的N端添加至少一个氨 基酸残基掩盖或封闭了暴露的N端，通过掩盖新表位使得已存在的抗体不 再与掩盖或封闭的N端相互作用，使得它不再可用于与已存在的抗体相互 作用。从ABD的N端缺失至少一个氨基酸残基通过改变可用于与已存在 的抗体相互作用的新表位来修饰N端。
本文所用的术语“C+N端修饰”指在其暴露的C+N端具有修饰的 ABD(例如单结构域抗体)，该修饰改变了C+N端的结构，使得已存在的抗 体不再与ABD(例如单结构域抗体)的修饰的C+N端相互作用。该改变可 以是向ABD(例如单结构域抗体)的C+N两端都添加至少一个氨基酸残基， 或从ABD(例如单结构域抗体)的C+N两端都缺失至少一个氨基酸残基。 向ABD的C+N两端都添加至少一个氨基酸残基掩盖或封闭了暴露的C+N 端，通过掩盖新表位使得已存在的抗体不再与掩盖或封闭的C+N端相互 作用，使得它不再可用于与已存在的抗体相互作用。从ABD的C+N两端 缺失至少一个氨基酸残基通过改变可用于与已存在的抗体相互作用的新表 位来修饰C+N端。另外，可以对ABD的每一端进行不同的修饰。例如， ABD的C端可以添加至少一个氨基酸残基来修饰，而ABD的N端可以缺 失至少一个氨基酸残基来修饰。备选地，ABD的N端可以添加至少一个 氨基酸残基来修饰，而ABD的C端可以缺失至少一个氨基酸残基来修饰。
本文所用的术语“免疫原性”指起因于在施用ABD(例如单结构域抗 体)前已经存在的已存在抗体的免疫原性。起因于已存在的抗体的免疫原性 降低了ABD(例如单结构域抗体)的疗效。这种免疫原性的程度可以通过 ELISA测定来测定，且可以表示为包含可测量的量的已存在的抗体的人血 清的百分比。ABD(例如单结构域抗体)和具有修饰(如C端修饰)的相应 ABD(例如单结构域抗体)之间免疫原性的降低可以通过将包含针对具有C 端修饰的ABD(例如单结构域抗体)的已存在抗体的血清样品的百分比与包 含针对已存在的最初ABD(例如单结构域抗体)的抗体的血清样品的百分比 相比较来测量。具有C端修饰的ABD(例如单结构域抗体)的阳性血清样品 的较低数目或百分比指示具有C端修饰的ABD(例如单结构域抗体)的免疫 原性的降低。可以以单个血清样品为基础应用的更灵敏的测量利用竞争 ELISA设置。在这种竞争ELISA中，具有C端修饰的ABD(例如单结构 域抗体)与最初的ABD(例如单结构域抗体)竞争结合测试血清中已存在的 抗体。具有C端修饰的ABD(例如单结构域抗体)与最初的ABD(例如单结 构域抗体)竞争的能力越低，免疫原性的降低越成功。
本文所用的术语“单结构域抗体”或“sdAb”指包含人抗体重链的可 变区(V_HH)的单链抗体的类型。SdAb是由单个单体可变抗体结构域组成的 抗体片段。它们衍生自例如源自人类的重链抗体，其仅由两个抗体重链组 成，无轻链。sdAb具有仅12-15kDa的分子量，比单克隆抗体(mAb)(例如 具有两条重蛋白质链和两条轻链的IgG抗体(150-160kDa))小得多。
SdAb可以源自任意物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、羊驼、山 羊、兔、牛。sdAb可以是已知为缺乏轻链的重链抗体的天然存在的免疫球 蛋白的修饰形式。这类免疫球蛋白公开于WO2006/099747、 WO2009/079793和WO2012/100343中。为了清晰的原因，源自天然缺乏 轻链的重链抗体的可变结构域在本文中称为V_HH或sdAb，以将它与四链 免疫球蛋白的常规V_H区分开。
本文所用的术语“已存在的抗体”指个体的血清中的干扰抗体，该抗 体并非由于施用ABD(例如单结构域抗体)而诱导，而是在施用ABD(例如 单结构域抗体)之前就存在于个体中。已存在的抗体可以产生于偶发性或职 业性暴露于外来蛋白质。这些已存在的抗体与ABD(例如单结构域抗体)的 暴露C端相互作用，降低ABD(例如单结构域抗体)的疗效。
本文所用的术语“已存在的免疫应答”指个体的血清中的干扰免疫应 答分子，该分子并非由于施用ABD(例如单结构域抗体)而诱导，而是在施 用ABD(例如单结构域抗体)之前就存在于个体中。已存在的免疫应答可以 产生于偶发性或职业性暴露于外来蛋白质，且包括免疫应答分子，如炎症 分子(例如IgG、IgM、IgA、IgE、TNF、类风湿因子等)。这些已存在的 免疫应答分子与ABD(例如单结构域抗体)暴露的C端相互作用，并降低 ABD(例如单结构域抗体)的治疗效果。
本公开的多种方面在以下章节和子章节中更详细地描述。
抗原结合结构域
在一方面，本公开涉及分离的包含C端修饰的抗原结合结构域(ABD)， 其中该C端修饰包括添加或缺失至少一个氨基酸残基，使得对ABD添加 或缺失至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在的抗体与ABD的相互 作用而不干扰ABD与其靶标的结合。在另一方面，本公开涉及包含C端 修饰的抗原结合结构域(ABD)，其中该C端修饰包括缺失至少一个氨基酸 残基，使得从ABD缺失至少一个氨基酸残基消除了已存在的抗体与ABD 的相互作用而不干扰ABD与其靶标的结合。在另一方面，本发明涉及包 含C端修饰的抗原结合结构域(ABD)，其中该C端修饰包括缺失至少一个 氨基酸残基至至少三个氨基酸残基，使得从ABD缺失至少一个氨基酸残 基消除了已存在的抗体与ABD的相互作用而不干扰ABD与其靶标的结 合。在另一方面，本公开涉及分离的包含N端修饰的抗原结合结构域 (ABD)，其中该N端修饰包括添加或缺失至少一个氨基酸残基，使得对ABD 添加或缺失至少一个氨基酸残基消除了已存在的抗体与ABD的相互作用 而不干扰ABD与其靶标的结合。在另一方面，本公开涉及分离的包含C+N 端修饰的抗原结合结构域(ABD)，其中该C+N端修饰包括添加或缺失至少 一个氨基酸残基，使得对ABD添加或缺失至少一个氨基酸残基消除了已 存在的抗体与ABD的相互作用而不干扰ABD与其靶标的结合。
ABD的实例包括但不限于：C端、N端或C+N端暴露的抗体、单链 抗体；C端、N端或C+N端暴露的抗体可变区(例如V_H或V_L)；C端、N 端或C+N端暴露的单链抗体片段(scFv)；C端、N端或C+N端暴露的单 链双抗体；至少一个C端、N端或C+N端暴露的Fab片段；至少一个C 端、N端或C+N端暴露的F(ab)₂片段；至少一个C端、N端或C+N端暴 露的包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；至少一个 C端、N端或C+N端暴露的由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段； 至少一个C端、N端或C+N端暴露的dAb片段。ABD包括但不限于单链 抗体，纳米抗体，包含IgG或HSA与其他ABD(如单链Fv、纳米抗体或 其他小ABD)的融合的多结构域抗体，包含单链、scFv、sdAb、Fab、双抗 体、scFab或任意其他ABD的双特异性抗体，或将暴露正常情况下不暴露 的N端或C端序列的Fc融合蛋白。
ABD具有互补决定区(CDR)连同至多四个构架区(FR)形成抗原结合 部位。V_H或V_L可变结构域的CDR在本文中称为CDR1、CDR2和CDR3。 V_H或V_L可变结构域的FR在本文中称为FR1、FR2、FR3和FR4。FR为 可变结构域提供结构完整性，并确保免疫球蛋白折叠的保留。存在用于鉴 定互补决定区的多种方案，最常见的两种是Kabat等(1991)根据V_H和/或 V_L结构域的抗原结合区的序列变异性确定“互补决定区”(CDR)的那些。 (见Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest.US Department of Health and Human Services,US Public Health Service, Bethesda,MD)。可变结构域(V_H或V_L)中的大多数序列变异性存在于CDR/ 环中；CDR/环外侧区域成为构架区(FR)。可以用IMGT国际数据库(见例 如www.imgt.org；Lefranc等,(1999)Nucleic Acids Research,27,209-212 (1999)；Ruiz等,(2000)Nucleic Acids Research,28,219-221；Lefranc,(2001) Nucleic Acids Research,29,207-209；Lefranc,(2003)Nucleic Acids Res.,31, 307-310；Lefranc等,(2004)In Silico Biol.,5,0006[Epub],5,45-60(2005)； Lefranc等,(2005)Nucleic Acids Res.,33,D593-D597)确定ABD的FR和 CDR。
人V_H或V_L结构域可以获自人Ig重链或轻链序列(Holliger和Hudson, (2005)Nat.Biotechnol.23,1126-1136；Holt等,(2003)Trends Biotechnol.21, 484-490；Jespers等,(2004)Nat.Biotechnol.22,1161-1165；To等,(2005)J. Biol.Chem.280,41395-41403)。用于从非人物种获得V_H或V_L结构域的类 似技术为本领域已知。此外，V_H和V_L结构域包括重组产生的V_H或V_L， 以及通过亲和力成熟、稳定化、增溶或其他抗体改造方法进一步修饰这种 V_H或V_L而产生的那些V_H或V_L。还涵盖保持或改善V_H或V_L的稳定性和 非聚集特征的同源物、衍生物或变体。
仅为了说明的目的，以下章节用单结构域抗体背景的公开内容描述， 但是，应理解，该公开内容可适用于许多抗体、抗体片段或其组合，该抗 体、抗体片段或其组合具有至少一个引出对已存在的抗体的免疫应答的暴 露C端、N端或C+N端，其中在C端、N端或C+N端添加或缺失氨基酸 修饰暴露的C端、N端或C+N端消除了该应答。同样，该公开内容也适 用于具有至少一个引出对已存在的抗体的免疫应答的暴露C端、N端或 C+N端的抗体-备选支架(例如纤连蛋白)，其中在C端、N端或C+N端添 加或缺失氨基酸修饰暴露的C端、N端或C+N端消除了该应答。
人单结构域抗体
本发明基于以下惊人发现，人血清中已存在的抗体结合源自人来源的 人单结构域抗体，并产生已存在的免疫应答。由于单结构域抗体具有人来 源，而不是来自其他物种或源自合成文库的单结构域抗体的衍生或修饰形 式，申请人惊奇地发现，存在于来自人志愿者的血清中的已存在的抗体结 合于本文公开的几种单结构域抗体，并产生已存在的免疫应答。甚至更惊 人和意外的是这样的发现，人V_H或V_Lκ单结构域抗体的C端区域的修饰 (添加或缺失单氨基酸残基)消除了已存在的免疫应答。但是，根据本文 公开的数据，没有存在对人V_Lλ单结构域抗体的C端的已存在的免疫应答 的证据(见例如Lefranc等,(1999),上文；Ruiz等,(2000)上文；Lefranc, (2001)上文；Lefranc,(2003)上文；Lefranc等,(2004)上文；Lefranc等, (2005)上文)。
虽然源自骆驼重链的单结构域抗体(V_HH)甚至在具有人源化突变时(见 例如WO2012/175741)也显示某种已存在的免疫应答，但可以存在一些已 存在的可以与骆驼重链反应的抗体不足为奇。对于骆驼重链，向C端添加 氨基酸残基的C端修饰减少了已存在的免疫应答。这类氨基酸添加在 WO2013/024059中也显示减少已存在的免疫应答。
但是，到目前为止，几乎没有证据表明已存在的抗体结合人单结构域 抗体，且此结合可以通过从本文公开的未修饰的人单结构域抗体支架的C 端区域添加或缺失至少一个氨基酸残基来消除。对这些人V_H和V_L单结构 域支架的已存在的免疫应答的鉴定是惊人和意外的发现，因为这些支架源 自人来源，而不是可包含不见于全人库中的序列(即不出现在人序列中的 突变)的合成文库。基于这些突变的存在，可以预期对源自合成文库的抗 体的某种已存在的免疫应答。但是，基于本文公开的这些人衍生的支架， 不会预期或预测已存在的免疫应答。申请人首次公开，从未修饰的V_H或 V_Lκ人单结构域抗体支架的C端区域缺失或添加单个氨基酸足以消除已存 在的免疫应答。甚至更惊人的是，仅V_H单结构域抗体支架和V_Lκ单结构 域抗体支架观察到了已存在的免疫应答的消除，但V_Lλ未观察到。
因此，在一方面，本公开涉及分离的包含C端修饰的V_H单结构域抗 体，其中该C端修饰包括缺失至少一个氨基酸残基，使得对单结构域抗体 缺失至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在的抗体与单结构域抗体的 相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合。
因此，在一方面，本公开涉及分离的包含C端修饰的V_H单结构域抗 体，其中该C端修饰包括添加至少一个氨基酸残基，使得对单结构域抗体 添加至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在的抗体与单结构域抗体的 相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合。
因此，在一方面，本公开涉及分离的包含C端修饰的V_Lκ单结构域 抗体，其中该C端修饰包括缺失至少一个氨基酸残基，使得对单结构域抗 体缺失至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在的抗体与单结构域抗体 的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合。
因此，在一方面，本公开涉及分离的包含C端修饰的V_Lκ单结构域 抗体，其中该C端修饰包括添加至少一个氨基酸残基，使得对单结构域抗 体添加至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在的抗体与单结构域抗体 的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合。
在一个实施方案中，该单结构域抗体可以源自V_H区或V_L区。用PhoA 前导序列MKQSTIALALLPLLFTPVTKA(SEQ ID NO:1)(其用于纯化蛋 白质)按实施例章节中所述产生单结构域抗体V_H和V_L支架。但是，一旦表 达和纯化，即去除PhoA前导序列，保留下文所示的单结构域抗体V_H和V_L序列(SEQ ID NO:2-13)。
在一个实施方案中，人单结构域抗体包含WO2006/099747和 WO2009/079793和WO2012/100343中公开的重链或轻链序列，这三个专 利在此以其整体引入作为参考。在一个实施方案中，人单结构域抗体包含 WO2012/100343中讨论的在构架区内具有二硫键的重链或轻链序列。到目 前为止，未在人系统中鉴定出可检测量的游离循环人单结构域抗体。
在一个实施方案中，人单结构域抗体包含选自以下的重链或轻链序列：
轻链结构域构架支架
HVLP335(κ)
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSSLAWYQQKPGQAPRLLIYGTSNRATGIP DRFSGSGSGTHFTLTINRLEPGDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:2)
HVLP3103S(κ)
ETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRN- NLAWYQQRPGQAPRLLCYGASTRATGIPARFSCSGSGTDFTLTISSLQVEDVAVYYCQ QYYTTPKTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:3)
HVLP325(λ)
EIVLTQSPTTLSLSPGERATLSCRASQSVGR- YLAWYQQRPGQAPRLLVFDTSNRAPGVPARFSGRGSGTLFTLTISSLEPEDSAVYFCQQ RSSGLTFGGGTKVTVL(SEQ ID NO:4)
HVLP325S(λ)
EIVLTQSPTTLSLSPGERATLSCRASQSVGR- YLAWYQQRPGQAPRLLCFDTSNRAPGVPARFSCRGSGTLFTLTISSLEPEDSAVYFCQQ RSSGLTFGGGTKVTVL(SEQ ID NO:5)
HVLP351(λ)
EIVMTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVGTSLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIS ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRYNWPR-TFGGGTKVTVL(SEQ 1D NO:6)
HVLP351S(λ)
EIVMTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVGTSLAWYQQKPGQAPRLLCYDASNRATGIS ARFSCSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRYNWPR-TFGGGTKVTVL(SEQ ID NO:7)
重链结构域构架支架
HVHP426
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIVDGYAMHWVRQAPGQGLEWVSVTNNGGS TSYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARQSITGPTGAFDIWGQGT MVTVSS(SEQ ID NO:8)
HVHP426S
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIVDGYAMHWVRQAPGQGLEWVCVTNNGGS TSYADSVKGRFTCSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARQSITGPTGAFDIWGQG TMVTVSS(SEQ ID NO：9)
HVHP420
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMTWVRQAPGKGLEWVGRIKTKTD GGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDRDHSSGSWGQGT LVTVSS(SEQ ID NO：10)
HVHM81
EVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISGSGAS TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTALYYCARQSITGPTGAFDVWGQG TMVTVSS(SEQ ID NO：11)
HVHP421S
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISGSGGS TYYADSVKGRFTCSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGKGGSSGYDHPDYW GQGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)
HVHP430S
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISSSGGST YYADSVKGRFTCSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVREEYRCSGTSCPGAFDIW GOGTMVTVSS(SEO ID NO:13)
在一个实施方案中，单结构域抗体包含WO2012/100343(在此以其整 体引入作为参考)中所述的一个或多个非标准Cys残基，以及任意天然(标 准)二硫键。在一个实施方案中，向单结构域抗体的构架区中引入至少两个 非标准Cys残基。在一个实施方案中，该两个Cys残基取代抗体可变区的 FR2和FR3中的残基。在一个实施方案中，在选自V_H sdAb结构域的V_HFR2区的残基47至49的位置处引入Cys残基，在选自V_H sdAb结构域的 V_H FR3区的残基69至71的位置处引入Cys残基。在一个实施方案中， 在选自V_L sdAb结构域的V_L FR2区的残基46至49的位置处引入Cys残 基，在选自V_L sdAb结构域的V_L FR3区的残基62至66的位置处引入Cys 残基。在一个实施方案中，在V_H结构域的位置49处引入至少一个非标准 Cys残基，在V_H结构域的位置69处引入至少一个非标准Cys残基。在一 个实施方案中，在V_L结构域的位置48处引入至少一个非标准Cys残基， 在V_L结构域的位置64处引入至少一个非标准Cys残基。
在一个实施方案中，单结构域抗体是“humaneered”(也备选地称为 “人源化的”)，即源自人以外的物种的sdAb，在对人个体施用的sdAb 的背景中，已用免疫原性较低或无免疫原性的氨基酸取代具有免疫原性或 可能具有免疫原性的氨基酸残基。本公开考虑本领域已知的用于产生 humaneered抗体的任意方法，包括但不限于Kalobios的humaneering技 术。注意，在humaneered单结构域抗体时，可以用任意其他免疫原性较 低的氨基酸残基取代免疫原性氨基酸残基，而不考虑这是否构成保守氨基 酸改变。
在一个实施方案中，本公开涉及分离的包含具有C端修饰的暴露C端 的scFv，其中该C端修饰包括添加或缺失至少一个氨基酸残基，使得对 scFv的暴露C端添加或缺失至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在 的抗体与scFv的相互作用而不干扰scFv与其靶标的结合；其中scFv的 V_H包括至少一个氨基酸残基的缺失，V_L是以通过Kabat编号确定的Lys 氨基酸残基结束的人κ轻链，且包括至少一个氨基酸残基的添加或缺失。 scFv的V_H和V_L可以用诸如GS接头的接头连接在一起。
在一个实施方案中，Lys位于通过Kabat编号确定的氨基酸位置107。 在一个实施方案中，scFv包含：选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ  ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的人V_H构架支架；选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的人V_L构架支架；及将 V_H和V_L构架支架连接在一起的接头。
在一个实施方案中，该C端修饰进一步包括从scFv的C端缺失至少 一个附加氨基酸残基。在一个实施方案中，该C端修饰进一步包括从scFv 的C端缺失至少两个附加氨基酸残基。在一个实施方案中，该C端修饰进 一步包括从scFv的C端缺失至少三个、至少四个、至少五个附加氨基酸 残基。
在一个实施方案中，该C端修饰进一步包括对scFv的C端添加至少 一个附加氨基酸残基。在一个实施方案中，该C端修饰进一步包括对scFv 的C端添加至少两个附加氨基酸残基。在一个实施方案中，该C端修饰进 一步包括对scFv的C端添加至少三个、至少四个、至少五个附加氨基酸 残基。
在一个实施方案中，人V_H构架支架中的C端修饰是缺失选自Arg、 Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln和Gly-Gln-Pro的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该C端修饰包括从V_L构架支架VEIK缺失一个 氨基酸残基至三个氨基酸残基。在一个实施方案中，该C端修饰包括对 V_L序列VEIK添加一个氨基酸残基至三个氨基酸残基，其中该附加氨基酸 残基选自天然或非天然氨基酸残基。在一个实施方案中，该C端修饰是添 加选自Arg、Arg-Thr、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Arg-Thr-Val-Ala和 Arg-Thr-Val-Ala-Ala的氨基酸序列。
在一个实施方案中，与不含C端修饰的单结构域抗体相比，该C端修 饰使已存在的抗体应答消除至少约10％。
在一个实施方案中，本公开涉及分离的包含具有C端修饰的暴露C端 的scFv，其中scFv包含选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的V_H；选自SEQ  ID NO:2和SEQ ID NO:3的V_L，其中暴露的C端在V_H上，C端修饰包 括缺失至少一个氨基酸残基，使得scFv的暴露C端缺失至少一个氨基酸 残基消除了至少一种已存在的抗体与scFv的相互作用而不干扰scFv与其 靶标的结合。
在一个实施方案中，本公开涉及分离的包含具有C端修饰的暴露C端 的scFv，其中scFv包含选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的V_H；选自SEQ  ID NO:2和SEQ ID NO:3的V_L，其中暴露的C端在V_L上，C端修饰包 括添加至少一个氨基酸残基，使得scFv的暴露C端添加至少一个氨基酸 残基消除了至少一种已存在的抗体与scFv的相互作用而不干扰scFv与其 靶标的结合。
已存在的抗体
已存在的免疫应答和已存在的抗体可以在生命早期形成且依赖于个 体。对于发展单克隆抗体和抗体片段作为新治疗剂，已存在的抗体的存在 限制了治疗性抗体的使用并使其复杂化。图1显示抗体中可以产生导致对 已存在的抗体的应答的暴露C端的切割位置(位置A、B、C)。图2A-2B显 示可以包含暴露的C端的抗体的实例。2A是单克隆抗体和Fab-(Fab)和 Fv-片段(Fv)和单链抗体(scFv)；2B是单结构域抗体(VH和VL)。
虽然其在临床背景中的有害作用凸显了其严重结果，但对已存在的抗 体的相互作用机制仍知之甚少。来自已存在的抗体的可能的潜在干扰机制 似乎是潜在、可变和不可预测的问题，与用来检测已存在的抗体的免疫测 定、测定设计或形式无关。已存在的抗体通常是多克隆抗体。抗原与单克 隆抗体的结合亲和力(即结合常数或Ka，其是两个速率(结合和解离速率) 的比值)往往是一致的，而在涉及多克隆抗体(即试剂或干扰抗体)的免疫学 反应中，Ka或抗体亲抗原性是抗体群体中每一种的结合常数的平均值。 因此，涉及多克隆抗体的免疫学反应更可变和复杂。此外，已存在的抗体 可以例如在独特型网络免疫应答中模拟抗原自身、模拟试剂抗体或模拟二 者(Pan等(1995)Exp Biol Med J；9:43-49；Weir等Immunology 1997:69 Churchill Livingstone Edinburgh；Fields等(1995)Nature；374:739-742)。 一些已存在的抗体不将抗原或试剂抗体识别为相互作用实体，但它们可以 识别“抗原-抗体结合复合物”(即metatope)并结合它(Voss EW(1993)Mol  Immunol；30:949-951)，从而改变免疫测定动力学。因此，正常的结合反应 可以涉及抗原上和/或抗体上的一个以上结合部位。已存在的抗体的存在可 以破坏此结合反应，破坏的量级可取决于诸如已存在的抗体的效价、它们 的抗体亲抗原性和反应时间、及抗体结合部位的位置的因素。已存在的抗 体在捕获抗体上的结合部位可以导致抗原结合的封闭(部分或完全)，产生 不真实的低结果。备选地，它可以通过结合捕获抗体上的远端部位但与信 号抗体反应来增加与信号抗体的结合，与后者产生不真实的更高的结果。
已存在的抗体就种类(IgG、IgM或IgA)、亚类(例如IgG1、-2或-3)、 效价和亲和力/抗体亲抗原性及表位/互补位的多重性而言的性质变异只是 凸显潜在已存在的抗体时的结合反应的复杂性和不可预测性的实例，说明 可产生干扰的许多场景和变换的免疫学相互作用。
至少一种已存在的抗体对单结构域抗体的结合可以改变单结构域抗体 的药代动力学和药效学行为，产生新的复合物和功能，改变也可以具有组 织分布结果的复合物的大小。因此，此现象代表需避免的显著的安全性和 有效性风险。
申请人认为，已存在的免疫应答由将暴露正常情况下不暴露的N端或 C端序列的任意蛋白质引出。本公开试图通过修饰ABD的C端、N端或 C+N端二者来消除已存在的抗体的干扰，使得已存在的抗体不再与ABD 的C端、N端或C+N端二者相互作用。存在可以用来修饰这种应答的许 多变换。在一个实施方案中，通过对ABD的C端添加至少一个氨基酸残 基来修饰C端。在另一实施方案中，通过从ABD的C端缺失至少一个氨 基酸残基来修饰C端。在一个实施方案中，通过对ABD的N端添加至少 一个氨基酸残基来修饰N端。在另一实施方案中，通过从ABD的N端缺 失至少一个氨基酸残基来修饰N端。在一个实施方案中，通过对ABD的 C端添加至少一个氨基酸残基来修饰C端，同时通过从ABD的N端缺失 至少一个氨基酸残基来修饰N端。在一个实施方案中，通过对ABD的N 端添加至少一个氨基酸残基来修饰N端，同时通过从ABD的C端缺失至 少一个氨基酸残基来修饰C端。
虽然不限受限于提供理论，但对ABD的C端、N端或C+N端二者的 修饰可以导致：(i)通过改变ABD的C端、N端或C+N端二者的三维构型 以使得已存在的抗体不再识别ABD，来消除至少一种已存在的抗体的相互 作用；(ii)改变ABD的C端、N端或C+N端二者对已存在的抗体的暴露； (iii)改变ABD和已存在的抗体之间的空间位阻；(iv)破坏C端、N端中的 至少一个构象新表位，或C+N端二者中分开的新表位；和/或(v)掩盖ABD 的构架中的至少一个新表位。
通过添加至少一个氨基酸来掩盖或封闭ABD的暴露的C端、N端或 C+N端二者，末端的构象可以改变；或者新表位可以不再可用于与已存在 的抗体的相互作用。同样，从ABD的C端、N端或C+N端二者缺失至少 一个氨基酸残基通过改变末端或新表位处的构象来修饰末端，使得它们不 再可用于与已存在的抗体的相互作用。
在一个实施方案中，本公开试图通过修饰分离的单结构域抗体的C端 来消除已存在的抗体的干扰作用，使得已存在的抗体不再与单结构域抗体 的C端相互作用。在一个实施方案中，通过对单结构域抗体的C端添加至 少一个氨基酸残基来修饰C端。在另一实施方案中，通过从单结构域抗体 的C端缺失至少一个氨基酸残基来修饰C端。
虽然不限受限于提供理论，但对单结构域抗体(例如人V_H或V_L)的C 端的修饰可以导致：(i)通过改变C端单结构域抗体的三维构型来消除至少 一种已存在的抗体的相互作用，使得已存在的抗体不再识别单结构域抗体； (ii)改变C端单结构域抗体对至少一种已存在的抗体的暴露；(iii)改变单结 构域抗体和已存在的抗体之间的空间位阻；(iv)破坏C端中的至少一个构 象新表位；和/或(v)掩盖单结构域抗体的构架中的至少一个新表位。
在一个实施方案中，单结构域抗体包含含有新表位的暴露的C端肽， 已存在的抗体与该C端新表位特异性相互作用。对单结构域抗体的C端添 加至少一个氨基酸残基或从单结构域抗体的C端缺失至少一个氨基酸残基 改变了该新表位的结构，使得已存在的抗体不再识别该新表位，不再与单 结构域抗体的C端相互作用。
本文公开的数据显示，分离的单结构域抗体的暴露的C端是已存在的 抗体相互作用的优选新表位。在一个实施方案中，可以通过对单结构域抗 体的C端添加至少一个氨基酸残基来掩盖被已存在的抗体所识别的分离的 单结构域抗体的暴露的C端处的新表位。
在一个实施方案中，对分离的单结构域抗体的C端添加至少一个氨基 酸残基来掩盖单结构域抗体的C端处的新表位。在另一实施方案中，对分 离的单结构域抗体的C端添加至少两个氨基酸残基来掩盖单结构域抗体的 C端处的新表位。在另一实施方案中，对单结构域抗体的C端添加至少三 个氨基酸残基来掩盖分离的单结构域抗体的C端处的新表位。在另一实施 方案中，对分离的单结构域抗体的C端添加至少四个氨基酸残基来掩盖单 结构域抗体的C端处的新表位。在另一实施方案中，对分离的单结构域抗 体的C端添加至少五个氨基酸残基来掩盖单结构域抗体的C端处的新表 位。在另一实施方案中，对分离的单结构域抗体的C端添加至少六个氨基 酸残基来掩盖单结构域抗体的C端处的新表位。在另一实施方案中，对分 离的单结构域抗体的C端添加至少七个氨基酸残基来掩盖单结构域抗体的 C端处的新表位。在另一实施方案中，对分离的单结构域抗体的C端添加 至少八个氨基酸残基来掩盖单结构域抗体的C端处的新表位。在另一实施 方案中，对分离的单结构域抗体的C端添加至少九个氨基酸残基来掩盖单 结构域抗体的C端处的新表位。在另一实施方案中，对分离的单结构域抗 体的C端添加至少十个氨基酸残基来掩盖单结构域抗体的C端处的新表 位。在另一实施方案中，对分离的单结构域抗体的C端添加至少1-10个 氨基酸残基来掩盖单结构域抗体的C端处的新表位。
在一个实施方案中，已存在的抗体识别的单结构域抗体的暴露的C端 处的新表位可以通过从单结构域抗体的C端缺失至少一个氨基酸残基来消 除。因此，在一个实施方案中，本发明涉及分离的包含C端修饰的V_H单 结构域抗体，其中该C端修饰包括缺失至少一个氨基酸残基，使得缺失单 结构域抗体中的至少一个氨基酸残基消除了已存在的抗体与单结构域抗体 的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合。
在一个实施方案中，通过从单结构域抗体的C端缺失至少一个氨基酸 残基来消除已存在的抗体识别的单结构域抗体的暴露的C端处的新表位。 在另一实施方案中，通过从单结构域抗体的C端缺失至少两个氨基酸残基 来消除已存在的抗体识别的单结构域抗体的暴露的C端处的新表位。在另 一实施方案中，通过从单结构域抗体的C端缺失至少三个氨基酸残基来消 除已存在的抗体识别的单结构域抗体的暴露的C端处的新表位。在另一实 施方案中，通过从单结构域抗体的C端缺失至少四个氨基酸残基来消除已 存在的抗体识别的单结构域抗体的暴露的C端处的新表位。在另一实施方 案中，通过从单结构域抗体的C端缺失至少五个氨基酸残基来消除已存在 的抗体识别的单结构域抗体的暴露的C端处的新表位。在另一实施方案中， 通过从单结构域抗体的C端缺失至少六个氨基酸残基来消除已存在的抗体 识别的单结构域抗体的暴露的C端处的新表位。在另一实施方案中，通过 从单结构域抗体的C端缺失至少七个氨基酸残基来消除已存在的抗体识别 的单结构域抗体的暴露的C端处的新表位。在另一实施方案中，通过从单 结构域抗体的C端缺失至少八个氨基酸残基来消除已存在的抗体识别的单 结构域抗体的暴露的C端处的新表位。在另一实施方案中，通过缺失C端 的至少九个氨基酸残基来消除已存在的抗体识别的单结构域抗体的暴露的 C端处的新表位。在另一实施方案中，通过从单结构域抗体的C端缺失至 少十个氨基酸残基来消除已存在的抗体识别的单结构域抗体的暴露的C端 处的新表位。在另一实施方案中，通过从单结构域抗体的C端缺失至少1-10 个氨基酸残基来消除已存在的抗体识别的单结构域抗体的暴露的C端处的 新表位。
在一个实施方案中，添加或缺失表1中公开的氨基酸残基来改变诸如 单结构域抗体的ABD的C端处的新表位。
表1：C端修饰

  氨基酸序列 1) 野生型-无氨基酸延伸 VH修饰   2) Ala添加 3) Ala-Ala添加 4) Ala-Ser添加 5) Ala-Ser-Thr添加 6) Ala-Ser-Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:14)添加
7) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:15)添加 8) Gly添加 9) Gly-Gly添加 10) Gly-Ser添加 11) Arg缺失 12) Arg-Thr缺失 13) Arg-Thr-Val缺失 14) Gly-Gln缺失 15) Gly-Gln-Pro缺失 VLκ修饰   16) Arg添加 17) Arg-Thr添加 18) Arg-Thr-Val添加 19) Arg-Thr-Val-Ala添加 20) Arg-Thr-Val-Ala-Ala添加 VLλ修饰   21) Gly添加 22) Gly-Gln添加 23) Gly-Gln-Pro添加 24) Gly-Gln-Pro-Lys添加 25) Gly-Gln-Pro-Lys-Ala添加 26) Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-ala添加
具有C端添加的人V_H
在一个实施方案中，该C端修饰是对V_H链的C端添加1至5个氨基 酸。在一个实施方案中，对单结构域抗体的C端添加Ala来掩盖分离的单 结构域抗体的C端处的新表位。在一个实施方案中，对单结构域抗体的C 端添加Ala-Ala来掩盖分离的单结构域抗体的C端处的新表位。在一个实 施方案中，对单结构域抗体的C端添加Ala-Ser来掩盖分离的单结构域抗 体的C端处的新表位。在一个实施方案中，对分离的单结构域抗体的C端 添加Ala-Ser-Thr来掩盖单结构域抗体的C端处的新表位。在一个实施方 案中，对单结构域抗体的C端添加Ala-Ser-Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:14) 来掩盖分离的单结构域抗体的C端处的新表位。在一个实施方案中，对单 结构域抗体的C端添加Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:15)来掩盖分离 的单结构域抗体的C端处的新表位。在一个实施方案中，对单结构域抗体 的C端添加Ala-Ser-Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:14)来掩盖分离的单结构域 抗体的C端处的新表位。在一个实施方案中，对单结构域抗体的C端添加 Gly-Gly来掩盖分离的单结构域抗体的C端处的新表位。在一个实施方案 中，对单结构域抗体的C端添加Gly-Ser来掩盖分离的单结构域抗体的C 端处的新表位。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及分离的包含C端修饰的V_H单 结构域抗体，其中该C端修饰包括添加至少一个氨基酸残基，使得在单结 构域抗体中添加至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在的抗体与单结 构域抗体的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:8 的V_H构架支架，该C端修饰包括添加一个氨基酸至三个氨基酸。在一个 实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:9的V_H构架支 架，该C端修饰包括添加一个氨基酸至三个氨基酸。在一个实施方案中， 该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:10的V_H构架支架，该C端 修饰包括添加一个氨基酸至三个氨基酸。在一个实施方案中，该分离的单 结构域抗体包含含有SEQ ID NO:11的V_H构架支架，该C端修饰包括添 加一个氨基酸至三个氨基酸。在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体 包含含有SEQ ID NO:12的V_H构架支架，该C端修饰包括添加一个氨基 酸至三个氨基酸。在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有 SEQ ID NO:13的V_H构架支架，该C端修饰包括添加一个氨基酸至三个 氨基酸。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:8 的V_H构架支架，该C端修饰包括添加选自Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、 Ala-Ser-Thr、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:14)和 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:15)的氨基酸残基。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:9 的V_H构架支架，该C端修饰包括添加选自Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、 Ala-Ser-Thr、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:14)和 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:15)的氨基酸残基。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:10 的V_H构架支架，该C端修饰包括添加选自Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、 Ala-Ser-Thr、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:14)和 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:15)的氨基酸残基。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:11 的V_H构架支架，该C端修饰包括添加选自Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、 Ala-Ser-Thr、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:14)和 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:15)的氨基酸残基。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:12 的V_H构架支架，该C端修饰包括添加选自Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、 Ala-Ser-Thr、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:14)和 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:15)的氨基酸残基。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:13 的V_H构架支架，该C端修饰包括添加选自Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、 Ala-Ser-Thr、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:14)和 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:15)的氨基酸残基。
图4-9显示对许多野生型V_H单结构域支架的已存在的抗体应答的存 在。这些附图清楚地显示，对于每种支架，在各V_H单结构域支架的C端 添加一个或多个氨基酸残基时，已存在的抗体应答完全消除或显著减少。 数据还显示，与其他添加相比，Ala-Ser-Thr氨基酸添加存在应答增加的趋 势。数据还显示V_H与稳定化的V_H S-S支架相比更高的应答。有趣地，用 许多野生型V_L单结构域支架在目前的测定中未检测到已存在的抗体应答。
具有C端添加的人V_L
在另一方面，本发明涉及分离的包含C端修饰的V_L单结构域抗体， 其中该C端修饰包括添加或缺失至少一个氨基酸残基，使得对单结构域抗 体添加或缺失至少一个氨基酸残基消除了已存在的抗体与单结构域抗体的 相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合，其中V_L是κ轻链，其 中κ轻链的C端以Lys氨基酸残基结束。在一个实施方案中，该Lys处于 通过Kabat编号确定的氨基酸位置107。
在一个实施方案中，该单结构域抗体包含选自SEQ ID NO:2和SEQ  ID NO:3的人V_L构架支架。在一个实施方案中，该单结构域抗体包含具 有SEQ ID NO:2的人V_L构架支架及包括添加一个氨基酸残基至三个氨基 酸残基的C端修饰。在一个实施方案中，该单结构域抗体包含具有SEQ ID  NO:3的人V_L构架支架及包括添加一个氨基酸残基至三个氨基酸残基的C 端修饰。在一个实施方案中，该单结构域抗体包含具有SEQ ID NO:2的 人V_L构架支架及包括添加选自Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、 Arg-Thr-Val-Ala和Arg-Thr-Val-Ala-Ala的氨基酸残基的C端修饰。在一 个实施方案中，该单结构域抗体包含具有SEQ ID NO:3的人V_L构架支架 及包括添加选自Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Arg-Thr-Val-Ala和 Arg-Thr-Val-Ala-Ala的一个氨基酸至三个氨基酸残基的C端修饰。
在一个实施方案中，该单结构域抗体包含具有SEQ ID NO:2的人V_L构架支架，该C端修饰包括添加Arg-Thr-Val。在一个实施方案中，该单 结构域抗体包含具有SEQ ID NO:2的人V_L构架支架，该C端修饰包括添 加Arg-Thr-Val-Ala。
在一个实施方案中，该单结构域抗体包含具有SEQ ID NO:3的人V_L构架支架，该C端修饰包括添加Arg-Thr-Val。在一个实施方案中，该单 结构域抗体包含具有SEQ ID NO:3的人V_L构架支架，该C端修饰包括添 加Arg-Thr-Val-Ala。
在一个实施方案中，该单结构域抗体是选自SEQ ID NO:2和SEQ ID  NO:3的人V_L，且包括一个氨基酸残基至五个氨基酸残基的C端缺失。
在一个实施方案中，该C端修饰是对V_L链的C端添加1至5个氨基 酸。在一个实施方案中，该V_L是κ轻链。在一个实施方案中，对单结构 域抗体的C端添加Arg-Thr-Val来掩盖分离的单结构域抗体的C端处的新 表位。在一个实施方案中，对分离的单结构域抗体的C端添加 Arg-Thr-Val-Ala来掩盖单结构域抗体的C端处的新表位。在一个实施方 案中，对单结构域抗体的C端添加Arg-Thr-Val-Ala-Ala(SEQ ID NO:183) 来掩盖分离的单结构域抗体的C端处的新表位。在具体实施方案中，对单 结构域抗体的C端添加Arg-Thr-Val来掩盖分离的单结构域抗体的C端处 的新表位。尤其有趣的是，在κ轻链(SEQ ID NO:2和3)中而不是在λ轻 链(SEQ ID NO:4-7)中添加1至3个氨基酸残基减少了已存在的免疫应答。 在图20中，以107位(按Kabat确定)的Lys结束的HVHLP335κ单结构 域(SEQ ID NO:2)未显示已存在的免疫应答。但是，对单结构域抗体的C 端添加单个氨基酸(例如Arg)导致对已存在的抗体的免疫应答增加。对单 结构域抗体的C端添加两个氨基酸(例如Arg-Thr)也观察到了这种增加。 但是，在将三个(例如Arg-Thr-Val)或更多个氨基酸(例如Arg-Thr-Val-Ala； 或Arg-Thr-Val-Ala-Ala)添加至单结构域抗体的C端时，废除了已存在的 免疫应答。此数据显示，以VEIK结束的单结构域抗体的C端的 Arg-Thr-Val-Ala-Ala周围似乎存在新表位。
具有C端缺失的人V_H
在一个实施方案中，可以通过从单结构域抗体的C端缺失至少一个氨 基酸残基来消除已存在的抗体识别的单结构域抗体的暴露的C端处的新表 位。因此，在一个实施方案中，本发明涉及分离的包含C端修饰的V_H单 结构域抗体，其中该C端修饰包括缺失至少一个氨基酸残基，使得在单结 构域抗体中缺失至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在的抗体与单结 构域抗体的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合。
在一个实施方案中，通过在单结构域抗体的C端缺失Arg来消除分离 的单结构域抗体的C端处的新表位。在一个实施方案中，通过在单结构域 抗体的C端缺失Arg-Thr来消除分离的单结构域抗体的C端处的新表位。 在一个实施方案中，通过在单结构域抗体的C端缺失Arg-Thr-Val来消除 分离的单结构域抗体的C端处的新表位。在一个实施方案中，通过在单结 构域抗体的C端缺失Gly-Gln来消除分离的单结构域抗体的C端处的新表 位。在一个实施方案中，通过在单结构域抗体的C端缺失Gly-Gln-Pro来 消除分离的单结构域抗体的C端处的新表位。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:8 的V_H构架支架及包括缺失一个氨基酸残基至三个氨基酸残基的C端修饰。 在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:9的V_H构架支架及包括缺失一个氨基酸残基至三个氨基酸残基的C端修饰。在一 个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:10的V_H构 架支架及包括缺失一个氨基酸残基至三个氨基酸残基的C端修饰。在一个 实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:11的V_H构架 支架及包括缺失一个氨基酸残基至三个氨基酸残基的C端修饰。在一个实 施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:12的V_H构架支 架及包括缺失一个氨基酸残基至三个氨基酸残基的C端修饰。在一个实施 方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:13的V_H构架支架 及包括缺失一个氨基酸残基至三个氨基酸残基的C端修饰。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:8 的V_H构架支架，该C端修饰包括缺失选自Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、 Gly-Gln和Gly-Gln-Pro的一个氨基酸至三个氨基酸。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:9 的V_H构架支架，该C端修饰包括缺失选自Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、 Gly-Gln和Gly-Gln-Pro的一个氨基酸至三个氨基酸。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:10 的V_H构架支架，该C端修饰包括缺失选自Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、 Gly-Gln和Gly-Gln-Pro的一个氨基酸至三个氨基酸。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:11 的V_H构架支架，该C端修饰包括缺失选自Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、 Gly-Gln和Gly-Gln-Pro的一个氨基酸至三个氨基酸。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:12 的V_H构架支架，该C端修饰包括缺失选自Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、 Gly-Gln和Gly-Gln-Pro的一个氨基酸至三个氨基酸。
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:13 的V_H构架支架，该C端修饰包括缺失选自Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、 Gly-Gln和Gly-Gln-Pro的一个氨基酸至三个氨基酸。
具有C端缺失的人V_L
在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:2 的V_L构架支架及包括缺失一个氨基酸残基至三个氨基酸残基的C端修饰。 在一个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:3的V_L构架支架及包括缺失一个氨基酸残基至三个氨基酸残基的C端修饰。在一 个实施方案中，该分离的单结构域抗体包含含有SEQ ID NO:2的V_L构架 支架，该C端修饰包括从C端缺失一个氨基酸(例如Arg)。
数据显示，只有以107位(按Kabat确定)的Lys结束的V_Lκ轻链而不 是V_Lλ轻链倾向于已存在的免疫应答。虽然不受限于理论，但申请人认为， 围绕V_Lκ轻链的C端VEIK序列的新表位造成已存在的免疫应答，因为 从VEIK序列缺失至少一个氨基酸(产生VEI)废除了已存在的免疫应答。 用VEIK未观察到免疫应答，但对C端VEIK序列添加一个氨基酸残基(例 如Arg)或两个氨基酸残基(例如Arg-Thr)(产生VEIKR或VEIKRT)增加了 已存在的免疫应答。但是，对C端VEIK序列进一步添加三个氨基酸残基 (例如Arg-Thr-Val)至四个氨基酸残基(例如Arg-Thr-Val-Ala)(分别产生 VEIKRTV或VEIKRTVA)再次废除了已存在的免疫应答。因此，围绕C 端VEIK序列似乎存在三至四个氨基酸残基的窄窗，其似乎负责已存在的 抗体或已存在的免疫分子的相互作用。
在一个实施方案中，本公开涉及分离的包含C端修饰的V_H单结构域 抗体，其中该C端修饰包括缺失至少一个氨基酸残基，使得在单结构域抗 体中缺失至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在的抗体与单结构域抗 体的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合。
在一个实施方案中，单结构域抗体的C端是暴露的，使得暴露的C端 可用于与已存在的抗体相互作用，其中该C端修饰减少了C端暴露于已存 在的抗体。
在一个实施方案中，该C端修饰通过选自以下的机制来修饰单结构域 抗体的C端：通过改变C端单结构域抗体的三维构型来消除已存在的抗体 的相互作用，使得已存在的抗体不再识别单结构域抗体；改变C端单结构 域抗体对已存在的抗体的暴露；改变单结构域抗体和已存在的抗体之间的 空间位阻；破坏C端中的至少一个构象新表位；及掩盖单结构域抗体的构 架中的至少一个新表位。
在一个实施方案中，该单结构域抗体是人V_H。
在一个实施方案中，该人V_H选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ  ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13。
在一个实施方案中，该氨基酸残基选自天然存在的氨基酸或非天然存 在的氨基酸。在一个实施方案中，该C端修饰进一步包括从单结构域抗体 的C端缺失至少一个附加氨基酸残基。
在一个实施方案中，该C端修饰进一步包括从单结构域抗体的C端缺 失至少两个附加氨基酸残基。
在一个实施方案中，该C端修饰进一步包括从单结构域抗体的C端缺 失至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至 少九个附加氨基酸残基。
在一个实施方案中，该C端修饰是缺失选自Arg、Arg-Thr、 Arg-Thr-Val、Gly-Gln和Gly-Gln-Pro的氨基酸序列。
在一个实施方案中，与不含C端修饰的单结构域抗体相比，该C端修 饰使已存在的抗体应答消除了至少约10％。
在一个实施方案中，该V_H包含SEQ ID NO:8，其中该C端修饰包括 缺失一个氨基酸至三个氨基酸。在一个实施方案中，该V_H包含SEQ ID NO: 9，其中该C端修饰包括缺失一个氨基酸至三个氨基酸。在一个实施方案 中，该V_H包含SEQ ID NO:10，其中该C端修饰包括缺失一个氨基酸至 三个氨基酸。在一个实施方案中，该V_H包含SEQ ID NO:11，其中该C 端修饰包括缺失一个氨基酸至三个氨基酸。在一个实施方案中，该V_H包 含SEQ ID NO:12，其中该C端修饰包括缺失一个氨基酸至三个氨基酸。 在一个实施方案中，该V_H包含SEQ ID NO:13，其中该C端修饰包括缺 失一个氨基酸至三个氨基酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码单结构 域抗体的组合物的核酸；包含该核酸的表达载体；及包含该表达载体的宿 主细胞或生物。
在一个实施方案中，本公开涉及消除个体中已存在的免疫应答的方法， 其包括：施用包含C端修饰的单结构域抗体，其中该C端修饰包括缺失至 少一个氨基酸残基，使得对单结构域抗体缺失至少一个氨基酸残基消除了 已存在的抗体与单结构域抗体的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标 的结合。
在一个实施方案中，本公开涉及在具有抗单结构域抗体的已存在的抗 体的个体中改善对单结构域抗体的应答的方法，其包括：施用包含C端修 饰的单结构域抗体，其中该C端修饰包括缺失至少一个氨基酸残基，使得 对单结构域抗体缺失至少一个氨基酸残基消除了至少一种已存在的抗体与 单结构域抗体的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结合。
在一个实施方案中，本公开涉及用单结构域抗体预测已存在的抗体是 否将产生已存在的免疫应答的方法，其包括：使单结构域抗体与人样品接 触；测定已存在的抗体(如果存在于人样品中)是否结合单结构域支架；通 过缺失至少一个氨基酸残基来修饰单结构域抗体的C端区域，使得该C端 修饰消除了已存在的抗体与单结构域抗体的相互作用。在一个实施方案中， 该人样品选自血液和血清。
同源单结构域抗体
在另一方面，本公开涉及分离的具有暴露的C端的单结构域抗体，其 包含与选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸 序列同源的V_H或V_L，其中已通过添加或缺失至少一个氨基酸残基来修饰 单结构域抗体的C端，使得添加或缺失至少一个氨基酸残基消除了已存在 的抗体与单结构域抗体的相互作用而不干扰单结构域抗体与其靶标的结 合。
在一个实施方案中，本公开涉及与选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨 基酸序列同源的具有暴露的C端的V_H单结构域抗体，其中已通过缺失至 少一个氨基酸残基来修饰单结构域抗体的C端，使得缺失至少一个氨基酸 残基消除了已存在的抗体与单结构域抗体的相互作用而不干扰单结构域抗 体与其靶标的结合。
在一个实施方案中，本公开涉及与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸 序列同源的具有暴露的C端的V_L单结构域抗体，其中已通过缺失至少一 个氨基酸残基来修饰单结构域抗体的C端，使得缺失至少一个氨基酸残基 消除了已存在的抗体与单结构域抗体的相互作用而不干扰单结构域抗体与 其靶标的结合。
在一个实施方案中，本公开提供分离的V_H，其包含与选自SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和 SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、 96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。在另一实施方案中，本公开 提供分离的V_L，其包含与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少 50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的 氨基酸序列。还包括在本公开的范围内的是优化用于在哺乳动物细胞中表 达的V_H和V_L亲本核苷酸序列。还包括在本公开的范围内的是已突变但与 上述序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％百分比同 一性的氨基酸或核酸。在一些实施方案中，它们包括突变体氨基酸序列， 其中在与上述序列相比时，已通过氨基酸缺失、插入或取代突变了V_H或 V_L中的不超过1、2、3、4或5个氨基酸。
还包括在本公开的范围内的是具有保守修饰的分离的具有暴露的C端 的单结构域抗体，其中通过添加或缺失至少一个氨基酸残基来修饰单结构 域抗体的C端，使得对单结构域抗体添加或缺失至少一个氨基酸残基消除 了至少一种已存在的抗体与单结构域抗体的相互作用而不干扰单结构域抗 体与其靶标的结合。
对于多肽序列，“保守序列修饰”包括对多肽序列的单个取代、缺失或 添加，其导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上相似的氨基 酸的保守取代表为本领域公知。这类保守修饰的变体是本发明的多态性变 体、物种间同源物和等位基因的补充，而不排除本发明的多态性变体、物 种间同源物和等位基因。以下八组包含互为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸 (A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷 氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、 甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)； 7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见例如 Creighton,Proteins(1984))。在一些实施方案中，用术语“保守序列修饰” 来指不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修 饰。
在两条或更多核酸或多肽序列的背景中，短语“百分比相同的”或“百分 比同一性”指相同的两条或更多序列或子序列。在为了比较窗内或指定区域 内的最大对应而用以下序列比较算法或通过手工比对和视觉检查测量来比 较和比对时，如果两条序列具有特定百分比(即，在特定区域内，或在不指 定时，在全长序列内具有60％同一性，可选地65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％或99％同一性)的相同氨基酸残基或核苷酸，则两条序 列“基本相同”。可选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨 基酸)的区域内，或更优选地在长度为100到500或1000或更多核苷酸(或 20、50、200或更多氨基酸)的区域内。
对于序列比较，通常一条序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。 当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定 子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定 备选参数。序列比较算法然后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列 的百分比序列同一性。
本文所用的“比较窗口”包括参考选自20到600、通常约50到约200， 更通常约100到约150的任何一定数量的相邻位置的区段，其中可在两条 序列进行最佳比对后将序列与相同数量相邻位置的参考序列进行比较。用 于比较的序列比对方法为本领域所熟知。例如通过Smith和 Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，通过 Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过 搜索Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的 相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software  Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的 GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过手工比对和视觉检查(见例 如Brent等,(2003)Current Protocols in Molecular Biology)进行序列最佳比 对用于比较。
适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是 BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等,(1977)Nuc.Acids  Res.25:3389-3402；和Altschul等,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。 用于进行BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology  Information公开获得。此算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的 短字来鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时， 该短字匹配或满足某一正值阈值得分T。T称为邻近字得分阈值(Altschul 等,上文)。这些初始邻近字命中作为起始搜索的种子，以发现含有它们的 更长HSP。只要可增加累积比对得分，则沿每一序列的两个方向延伸字命 中。对于核苷酸序列，用参数M(对一对匹配残基的奖赏得分；总是大于0) 和N(对错配残基的罚分；总是小于0)计算累积得分。对于氨基酸序列，用 得分矩阵来计算累积得分。在累积比对得分从其最高达到值跌落X量、累 积比对得分因一个或更多负得分残基比对的累积而到达零或以下、或到达 任一序列的末端时，停止字命中在每一方向上的延伸。BLAST算法参数 W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列) 使用默认字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨 基酸序列，BLASTP程序使用默认字长3、期望值(E)10和BLOSUM62得 分矩阵(见Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。
BLAST算法也进行两条序列之间相似性的统计学分析(见例如， Karlin和Altschul,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST 算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，其提供两条核苷酸或 氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考 核酸的比较中最小总和概率低于约0.2，更优选低于约0.01，并最优选低于 约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
也可使用已经整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller， (1988)Comput.Appl.Biosci.,4:11-17)的算法，使用PAM120加权残基表、 空位长度罚分12和空位罚分4测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。 此外，可使用已经整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)中的GAP 程序的Needleman和Wunsch(1970)J.Mol,Biol.48:444-453)算法，使 用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位加权16、14、12、10、8、 6或4和长度加权1、2、3、4、5或6来测定两条氨基酸序列之间的百分 比同一性。
除了上文指出的序列同一性的百分比，两条核酸序列或多肽基本相同 的另一指示是第一条核酸编码的多肽与针对第二条核酸编码的多肽产生的 抗体免疫交叉反应，如下文所述。因此，多肽通常与第二条多肽基本相同， 例如，其中两条肽仅因保守取代而不同。两条核酸序列基本相同的另一指 示是两个分子或其互补序列在严格条件下彼此杂交，如下文所述。两条核 酸序列基本相同的又一指示是可使用相同的引物来扩增该序列。
改造和修饰的单结构域抗体
在另一方面，用例如单结构域抗体的一个或多个V_H和/或V_L序列作为 起始材料来改造可以具有已从起始单结构域抗体改变的特性的修饰的单结 构域抗体，可以进一步改造已修饰为消除与已存在的抗体的相互作用的分 离的具有暴露的C端的单结构域抗体。可以通过修饰一个或两个V_H和/或 V_L序列内，例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的一个或 多个残基来改造分离的具有暴露的C端的单结构域抗体。
可以进行的一类可变区改造是CDR移植。单结构域抗体主要通过定 位在CDR中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于此原因，CDR内的氨 基酸序列比CDR之外的序列在单个单结构域抗体之间更多样。由于CDR 序列负责大多数抗体-抗原相互作用，通过构建包括移植至来自具有不同特 性的不同抗体的构架支架上的来自野生型单链抗体的CDR序列的表达构 建体，可能表达模拟特定野生型单链抗体的特性的重组单链抗体(见例如 Riechmann等,(1998)Nature 332:323-327；Jones等,(1986)Nature 321:522-525；Queen等,(1989)Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86:10029-10033； Winter的美国专利号5,225,539；及Queen等的美国专利号5,530,101、 5,585,089、5,693,762和6,180,370)。
在另一实施方案中，可以例如通过添加一个或多个Cys残基来在其构 架区中修饰分离的单结构域抗体。例如，单结构域抗体可以包含含有引入 抗体可变区的构架区FR2和FR3中的至少两个非标准Cys残基的多肽序 列。在一个实施方案中，该多肽在选自V_H sdAb结构域的V_H FR2区的残 基47至49的位置处包含Cys残基，并在选自V_H sdAb结构域的V_H FR3 区的残基69至71的位置处包含Cys残基。在一个实施方案中，该多肽在 选自V_L sdAb结构域的V_L FR2区的残基46至49的位置处包含Cys残基， 并在选自V_L sdAb结构域的V_L FR3区的残基62至66的位置处包含Cys 残基，如上文所讨论(见WO2012/100343，在此引入作为参考)。
双特异性和多价抗体
在另一方面，已修饰为消除与已存在的抗体的相互作用的分离的具有 暴露的C端的单结构域抗体可以是双特异性或多特异性抗体。分离的具有 修饰的C端的单结构域抗体可以衍生化或连接至另一功能分子，例如另一 肽或蛋白质(例如另一抗体或受体的配体)，以产生结合至少两个不同结合 部位或靶分子的双特异性分子。
在一种抗体内结合两种或多种抗原可以提供其他临床益处(Morrison 等,(1997)Nature Biotech.15:159-163；Alt等(1999)FEBS Letters 454:90-94；Zuo等,(2000)Protein Engineering 13:361-367；Lu等,(2004) JBC 279:2856-2865；Lu等,(2005)JBC 280:19665-19672；Marvin等, (2005)Acta Pharmacologica Sinica 26:649-658；Marvin等,(2006)Curr  Opin Drug Disc Develop 9:184-193；Shen等,(2007)J Immun Methods 218:65-74；Wu等,(2007)Nat Biotechnol.11:1290-1297；Dimasi等,(2009)J  Mol Biol.393:672-692；和Michaelson等,(2009)mAbs 1:128-141)。
双特异性分子可以是包含一种单链抗体和结合决定簇的单链分子，或 包含两种结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两 种单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号 5,260,203、美国专利号5,455,030、美国专利号4,881,175、美国专利号 5,132,405、美国专利号5,091,513、美国专利号5,476,786、美国专利号 5,013,653、美国专利号5,258,498和美国专利号5,482,858中。
为了产生双特异性分子，可以将具有修饰的C端的V_H或V_L功能性连 接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)至一种或多 种其他结合分子，如另一单结构域抗体、抗体、抗体片段、肽或结合模拟 物，使得产生双特异性分子。可使用本领域已知的方法，通过缀合成分结 合特异性来制备双特异性分子。例如，可分开产生双特异性分子的每一结 合特异性，然后相互缀合，例如，可用多种偶联或交联剂来进行共价缀合。 交联剂的实例包括蛋白A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰-硫代乙 酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、o-亚苯基二马来酰亚 胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀 酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸酯(磺基-SMCC)(见例如, Karpovsky等人,(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu等人,(1985)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括在Paulus(1985)Behring Ins.Mitt. No.78:118-132；Brennan等人,(1985)Science 229:81-83),和Glennie等 人,(1987)J.Immunol.139:2367-2375)中描述的那些。缀合剂是SATA和磺 基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)获得。
可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS 分析、生物测定(例如生长抑制)、或Western印迹测定来确认双特异性分 子与其特异性靶标的结合。这些测定中的每一种一般通过利用对目的复合 物特异的标记试剂(例如抗体)来检测特别重要的蛋白质-抗体复合物的存 在。
产生单结构域抗体的方法
在一个实施方案中，已修饰为消除与已存在的抗体的相互作用的分离 的具有暴露的C端的单结构域抗体可以通过以下制备：提供抗希望的抗原 的V_HH结构域，并(i)针对抗该抗原的序列筛选包含重链抗体序列和/或V_HH序列的文库；(ii)从该文库获得重链和/或V_HH序列；和(iii)通过在暴露的C 端添加或缺失至少一个氨基酸残基来修饰来自该重链和/或V_HH序列的 V_HH序列。
在一个实施方案中，已修饰为消除与已存在的抗体的相互作用的分离 的具有暴露的C端的单结构域抗体可以进一步包括步骤：(iv)对该重链抗 体序列和/或V_HH序列进行诱变(例如随机诱变或位点定向诱变)，以提高与 该抗原结合的亲和力和/或特异性；和(v)从该重链和/或V_HH序列获得诱变 的单结构域抗体。
用核苷酸和氨基酸取代产生单结构域抗体
已修饰为消除与已存在的抗体的相互作用的分离的具有暴露的C端的 单结构域抗体可以进一步包含一个或多个可以通过多种方法产生的氨基酸 或核苷酸修饰(例如改变)。通常，通过重组方法产生分离的具有暴露的C 端的单结构域抗体。此外，由于遗传密码的简并性，可以用多种核酸序列 来编码每一希望的分子。
本领域公认的用于产生编码起始分子的氨基酸序列变体的核酸分子的 示例性方法包括但不限于通过早先制备的编码该分子的DNA的位点定向 (或寡核苷酸介导)诱变、PCR诱变和盒诱变来制备。
位点定向诱变是用于制备取代变体的优选方法。此技术为本领域公知 (见例如Carter等Nucleic Acids Res.13:4431-4443(1985)和Kunkel等, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 82:488(1987))。简言之，在进行DNA的位点 定向诱变时，通过首先使编码希望的突变的寡核苷酸与亲本DNA的单链 杂交来改变这种亲本DNA。杂交后，用杂交的寡核苷酸作为引物，用亲本 DNA的单链作为模板，用DNA聚合酶来合成整条第二链。因此，编码希 望的突变的寡核苷酸掺入所得到的双链DNA。
PCR诱变也适合用于产生起始分子的氨基酸序列变体。见Higuchi,in  PCR Protocols,177-183页(Academic Press,1990)；和Vallette等,Nuc. Acids Res.17:723-733(1989)。简言之，在PCR中用小量模板DNA作为起 始材料时，可以用在序列上略微不同于模板DNA中对应的区域的引物来 产生相对大量的仅在引物与模板不同的位置处不同于模板序列的特异性 DNA片段。
用于制备变体的另一种方法——盒诱变——基于Wells等,Gene 34:315-323(1985)所述的技术。起始材料是包含待突变的起始多肽DNA的 质粒(或其他载体)。鉴定待突变的亲本DNA中的密码子。所鉴定的突变位 点的每一侧必须有独特的限制性内切核酸酶位点。如果不存在这类限制位 点，则可以用上述寡核苷酸介导的诱变法在起始多肽DNA中适当的位置 处引入它们来产生它们。在这些位点处切割质粒DNA来将它线性化。用 标准方法合成编码限制位点之间的DNA序列但含有希望的突变的双链寡 核苷酸，其中分开合成寡核苷酸的两条链，然后用标准方法杂交在一起。 此双链寡核苷酸称为盒。将此盒设计为具有与线性化质粒的末端相容的5’ 和3’末端，使得可以将它直接连接至质粒。此质粒现在包含突变的DNA 序列。
备选地，或此外，可以确定编码该分子的多肽变体的希望的氨基酸序 列，并可以合成产生编码这种氨基酸序列变体的核酸序列。在某些实施方 案中，掺入多种物种的密码子选择表来修饰核苷酸序列用于优化蛋白质表 达。取决于要在其中表达具有暴露的C端的单结构域抗体的细胞的物种， 本领域技术人员可参考多种密码子优化图表。
本领域普通技术人员将理解，可以进一步修饰本公开的分离的单结构 域抗体，使得它们在氨基酸序列上不同(例如不同于野生型变体)，但不是 在希望的活性上不同。例如，可以对蛋白质进行导致“非必需”氨基酸残 基处的氨基酸取代的附加核苷酸取代。例如，可以用来自同一侧链家族的 另一氨基酸残基取代分子中的非必需氨基酸残基。在另一实施方案中，可 以用在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的结构上相似氨基酸区段取 代氨基酸区段，即保守取代，其中可以进行用具有相似侧链的氨基酸残基 取代氨基酸残基。
本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族，包括碱性侧链(例 如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电 荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨 酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨 酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
除氨基酸取代外，本公开考虑起始分子氨基酸序列的其他修饰，以产 生减少已存在的抗体与分离的单结构域抗体的C端的相互作用的分子。在 一个实施方案中，可以对分离的单结构域抗体的C端添加一个或多个氨基 酸残基，使得对C端的修饰掩盖已存在的抗体与单结构域抗体的C端的相 互作用。在另一实施方案中，可以从分离的单结构域抗体的C端缺失一个 或多个氨基酸残基，使得对C端的修饰消除了已存在的抗体与分离的单结 构域抗体的C端的相互作用。与不含C端修饰的单结构域抗体相比，包含 一个或多个氨基酸添加或缺失的分离的具有C端修饰的单结构域抗体将优 选使已存在的抗体应答消除至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少 约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约 80％、至少约90％或至少约100％。
在一个实施方案中，本公开涉及分离的具有C端修饰的单结构域抗体， 其中对单结构域抗体的C端添加一个或多个天然氨基酸残基。在一个实施 方案中，本公开涉及分离的具有C端修饰的单结构域抗体，其中对单结构 域抗体的C端添加一个或多个非天然氨基酸残基。在一个实施方案中，本 公开涉及分离的具有C端修饰的单结构域抗体，从单结构域抗体的C端缺 失一个或多个天然氨基酸残基。
文库构建和筛选
用WO2006/09974(在此以其整体引入作为参考)中公开的方法来产生 单结构域抗体的文库。产生具有随机密码子的寡核苷酸，并掺入V_H序列。 将每种独特的寡核苷酸掺入V_H基因，修饰的V_H基因构成具有轻微变异的 序列的文库。通常，这样设计寡核苷酸，使得V_H的CDR或环随机化。例 如，可以随机化一个、两个或全部三个V_H CDR。然后将V_H文库克隆入适 当的载体(取决于要使用的文库的类型)，并将核酸序列表达为多肽。通常 通过淘选来针对与文库多肽结合的分子筛选文库。文库可以是噬菌体展示 文库，或其他展示文库，如核糖体展示和酵母展示。
一旦分离出通过选择方法鉴定的V_Hs或V_Ls，即可以进一步操作它们， 以选择诸如溶解性、稳定性、单体性(monomericity)、结合特异性、人来 源或高可表达性的改善的生物物理特性。这可以通过诸如DNA改组或交 错延伸法的体外重组技术来达到。DNA改组涉及将诸如抗体片段的第一 (供体)和第二(受体)多肽的核酸序列切割为随机片段，然后通过PCR样反 应来重新组装随机片段。然后筛选重新组装的片段来选择希望的特性。
例如，可以将一个或多个具有高稳定性的V_Hs(供体)与一个或多个缺 乏足够稳定性的V_Hs(受体)混合，并进行DNA改组。这产生受体V_Hs的 掺入了来自供体V_Hs的稳定性残基的突变体。可以通过本文所述的方法或 通过其他进化蛋白质筛选系统(如核糖体展示、酵母展示、细菌细胞展示和 噬菌体展示)来鉴定新稳定的突变体。类似地，此技术可以用来转移希望得 到的性状，如溶解性、单体性和高表达。
在供体和受体V_Hs都具有希望得到的特性时，此技术可以用来产生具 有两种特性的V_H。例如，可以用稳定的受体V_H来改组结合重要的治疗或 诊断配体的不稳定的供体V_H。为了确保新产生的稳定V_Hs也具有结合该 配体的能力，筛选系统可以涉及配体结合步骤。
DNA改组也可以用于人源化非人V_Hs，如骆驼重链抗体可变结构域及 铰口鲨和须鲨(wobbegong shark)可变结构域，或结合治疗靶标的非人V_Ls。 可以用具有希望得到的特性(如溶解性、稳定性、单体性和高可表达性)的 人V_Hs和V_Ls作为供体。例如，可以将一种或多种具有良好溶解性的人 V_Hs(供体)与一种或多种非人治疗性V_Hs(受体)混合，并进行DNA改组。 这产生受体V_Hs的既稳定又人源化的突变体。可以通过本文所述的方法或 通过其他进化蛋白质筛选系统(如核糖体展示、酵母展示、细菌细胞展示和 噬菌体展示)来鉴定新产生的人源化和稳定的突变体。在另一实例中，受体 V_H可以是治疗性V_HH(骆驼重链抗体可变结构域)。
此外，此技术还用于选择除V_Hs和V_Ls外的多肽的希望得到的特性。 如上文所讨论，供体多肽和受体多肽都可以是人的，或者供体可以是人的， 而受体是非人的。
用于赋予V_Hs和V_Ls溶解性、单体性、高可表达性或稳定性的可能的 方法可以是通过将CDR移植至受体V_Hs和V_Ls上。由于已知CDR涉及单 结构域抗体的溶解性和稳定性，因此，移植这些区域(如来自通过本文所述 的方法分离的V_Hs和V_Ls的CDR)可以赋予受体V_Hs和V_Ls溶解性和/或稳 定性。
可以用基于噬菌斑大小的选择方法从首次用于实验的人V_H噬菌体展 示文库鉴定具有不同种系序列和总体序列的单体人V_Hs(见例如 WO2006099747)。V_Hs在37℃胰蛋白酶处理、37℃孵育数周或4℃保存数 月后保持功能和单体，具有高热重折叠效率，在大肠杆菌中以良好的产率 产生，并具有蛋白A结合活性。此外，可以鉴定几种单体人V_Ls。
利用以上V_Hs作为支架的来自合成文库的V_Hs也将表现这类特性。类 似地，可以产生利用V_Ls作为支架的文库。之前报道的具有有利的生物物 理特性的全人V_Hs基于单个V种系序列：DP-47(Jespers等(2004),Nat. Biotechnol；22,1161-1165；和Jespers等(2004)J.Mol.Biol.337:893-903)。 此研究中的单体人V_Hs源自包括DP-47的六种不同种系序列的观察结果证 明，稳定的V_Hs就种系基因使用而言不受限制。实际上，如果选择不限于 具有蛋白A结合活性的V_H3家族V_Hs亚组，很可能我们将分离出家族和 种系来源不同于本文所述的那些的单体V_Hs。
在单个支架上构建了合成的V_H文库。这种库产生方法与利用多重支 架的天然体内“方法”形成鲜明对比。根据此处报道的序列，可以利用多 样的V_Hs和V_Ls组的可得性，产生基于多重V_H和V_L支架的文库。这类文 库将是体内库的更好的仿效，因此将具有更优的复杂性。这类库将优选由 子文库组成，其中通过单个V_H或V_L支架上的CDR3随机化(和CDR1和/ 或CDR2随机化，根据需要)而不破坏亲本CDR3长度来产生各子文库。
该V_Hs和V_Ls的通用性就选择用于人源化对治疗靶标特异的V_HHs、 V_Hs和V_Ls的最优V_H或V_L构架而言也是有益的。可以相对容易地从免疫、 未免疫或合成的V_HH文库获得抗治疗靶标的高亲和力骆驼V_HHs，随后进行 人源化(CDR移植、表面重塑、去免疫)来去除可能的V_HH免疫原性，从而 提供人V_H文库法的备选方法用于产生治疗性V_Hs。通过后一种方法产生高 亲和力治疗性V_HS可以通常需要对选自最初合成的人V_H文库选择的主要 结合子(lead binder)进行附加的冗长和耗时的体外亲和力成熟。
可以相对容易地从免疫、未免疫或合成的V_H文库获得抗治疗靶标的 非人V_Hs，随后进行人源化(CDR移植、表面重塑、去免疫)来消除非人V_H免疫原性，从而提供人V_H文库法的备选方法用于产生治疗性V_Hs。
可以相对容易地从免疫、未免疫或合成的V_HH文库获得抗治疗靶标的 非人V_Ls，随后进行人源化(CDR移植、表面重塑、去免疫)来消除V_HH免 疫原性，从而提供人V_L文库法的备选方法用于产生治疗性V_Ls。
通常，具有改善的生物物理特性的蛋白质的选择需要稳定性压力，以 确保稳定变体比不稳定或较不稳定的变体优先从文库群体中选出(Forrer 等(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9:514-520；Waldo(2003)Curr.Opin. Chem.Biol.7:33-38；Jung等(1999).J.Mol.Biol.294:163-180；和 Matsuura等(2003)FEBS Lett.539:24-28)。例如，在相关工作中，需要 对V_H噬菌体展示文库进行热处理来选择聚集抗性V_Hs。涉及噬菌体展示的 进化选择法的实例包括常规噬菌体展示、选择性感染噬菌体和蛋白酶解法。 在前两种方法中，基于稳定蛋白质比不稳定的蛋白质对其配体具有更好的 结合特性的假设，用亲和力选择来从文库选择稳定种类。但是，即使包括 附加的稳定性选择步骤，这些方法可以主要用于富集较高的亲和力而不是 较高的稳定性。结合步骤的需要将这些方法的适用性限于具有已知配体的 蛋白质。第三，蛋白酶解法基于这样的事实，稳定蛋白质通常紧致，因此 对蛋白酶具有抗性，而不稳定的蛋白质则不然。以这样的方式改造噬菌体 展示形式，使得所展示的蛋白质的蛋白酶稳定性转化为噬菌体感染性。因 此，在用蛋白酶处理变体噬菌体展示文库时，只有展示稳定蛋白质的噬菌 体保持其感染性，随后可以通过感染大肠杆菌宿主来选择。由于此方法独 立于配体结合，它具有通用性。但是，甚至稳定和良好折叠的蛋白质也具 有蛋白酶敏感部位，例如环和接头，这有时可妨碍在蛋白酶解法中选择稳 定种类(Bai等(2004).Eur.J.Biochem.271:1609-1614)。
对于WO2006099747中公开和本文中使用的进化法，简单地通过肉眼 来鉴定具有较优生物物理特性的蛋白质。该方法不需要配体结合、蛋白酶 解或去稳定化步骤，从而避免了可以在所报道的选择方法中遇到的复杂化。 无需结合步骤还意味着此方法具有通用性。作为一种选择，可以包括结合 步骤，以确保所选择的蛋白质具有功能。
使用本领域公知的技术，如例如WO2011/138391、WO2011/138392 和WO2012/022814中所述的那些，还可以使用标准抗体和抗体片段的文 库构建和筛选。诸如描述于例如WO2012/016245、WO2009/133208、 WO2009/083804、US20110038866和US20110275535中的纤连蛋白的抗体 样支架的文库构建和筛选也在本公开的精神之内。
制备方法
通常通过重组表达来产生已修饰为消除与已存在的抗体的相互作用的 分离的具有暴露的C端的单结构域抗体。将编码该分子的核酸插入表达载 体。编码该分子的DNA区段在表达载体中有效连接至确保其表达的控制 序列。表达控制序列包括但不限于启动子(例如天然相关启动子或异源启动 子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。优选地，表达控制序列是能 够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦将载体掺入 适当的宿主，即在适于高水平表达该核苷酸序列的条件下维持宿主，并收 集和纯化单结构域抗体。
这些表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分 在宿主生物中复制。通常，表达载体包含选择标记(例如氨苄青霉素抗性、 潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)，以允许检测用希望的DNA序列 转化的那些细胞(见例如Itakura等,美国专利4,704,362)。
大肠杆菌是对克隆本公开的多核苷酸(例如DNA序列)尤其有用的一 种原核宿主。其他适用的微生物宿主包括芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)，及其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如沙门氏菌属 (Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和多种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。
其他微生物(如酵母)也用于表达。酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母 属(Pichia)是示例性酵母宿主，根据需要，适宜的载体具有表达控制序列(例 如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶 和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素 (isocytochrome)C和负责甲醇、麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等。
除微生物外，还可以用哺乳动物组织培养物来表达和产生本公开的修 饰的单结构域抗体(例如编码单结构域抗体或其片段的多核苷酸)。见 Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。实 际上优选真核细胞，因为本领域已发展了许多能够分泌异源蛋白质(例如完 整的免疫球蛋白)的适宜的宿主细胞，包括CHO细胞系、多种COS细胞 系、HeLa细胞、293细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。用 于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点、启动子和增 强子(Queen等,(1986)Immunol.Rev.89:49)，及必要的加工信息位点，如 核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。优选 的表达控制序列是源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、 巨细胞病毒等的启动子(See Co等,(1992)J.Immunol.148:1149)。
备选地，编码序列可以掺入转基因用于引入转基因动物的基因组，随 后表达在转基因动物的乳汁中(见例如Deboer等,U.S.5,741,957；Rosen, U.S.5,304,489；和Meade等,U.S.5,849,992)。适宜的转基因包括与来自乳 腺特异性基因(如酪蛋白或β乳球蛋白)的启动子和增强子有效连接的轻链 和/或重链编码序列。
包含目的多核苷酸序列和表达控制序列的载体可以通过公知的方法转 移入宿主细胞，该方法取决于细胞宿主的类型而不同。例如，化学感受态 原核细胞可以短暂热激，而磷酸钙处理、电穿孔、脂转染、生物射弹或基 于病毒的转染可以用于其他细胞宿主。(通常见Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,第2版,1989)。 其他用于转化哺乳动物细胞的方法包括使用1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲 基聚甲溴化物、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(通常见 Sambrook等,上文)。为了产生转基因动物，将转基因显微注射入受精卵， 或者可以掺入胚胎干细胞的基因组，并将这类细胞的细胞核转移入去核卵。
一旦表达，即可以按照本领域的标准方法纯化本公开的修饰的单结构 域抗体，该方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、HPLC纯化、凝胶电 泳等(通常见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))。 对于药用，优选至少约90％至95％同质的基本上纯的分子，最优选98％ 至99％或更同质。
组合物
已修饰为消除与已存在的抗体的相互作用的具有暴露的C端的单结构 域抗体具有体内治疗用途。因此，本公开还提供组合物，例如药物组合物， 其包含与可药用载体配制在一起的一种或一组修饰的单结构域抗体(或其 变体、融合物和缀合物)。本公开的药物组合物还可以在联合治疗中施用， 即与其他药物组合。例如，该联合治疗可以包括本公开的组合物与至少一 种附加治疗剂，如抗炎剂、抗癌剂和化疗剂。
本公开的药物组合物也可以与放射治疗结合施用。与其他修饰的单结 构域抗体共同施用也为本公开所涵盖。
本文所用的“可药用载体”包括生理学上相容的任意和全部溶剂、分 散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，该载 体适合用于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如通过注 射或输注)。取决于给药途径，可以将活性化合物(即抗体、双特异性和多 特异性分子)包被在材料中来保护化合物免受酸及其他可以失活化合物的 天然条件的作用。
修饰的单结构域抗体可以通过本领域已知的多种方法施用。如技术人 员将理解，施用的途径和/或方式将取决于希望的结果而不同。可以用防止 化合物快速释放的载体制备活性化合物，如控制释放制剂，包含植入物、 经皮膜片和微囊包埋递药系统。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物， 例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于 制备这类制剂的许多方法已取得专利或一般为本领域技术人员已知。见例 如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson 编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
为了通过某些给药途径施用修饰的单结构域抗体，可以有必要用防止 其失活的材料包被化合物，或者与防止其失活的材料共同施用该化合物。 例如，化合物可以在适当的载体(例如脂质体)或稀释剂中对个体施用。可 药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。脂质体包括水包油包水 (water-in-oil-in-water)CGF乳剂以及常规脂质体(Strejan等(1984)J. Neuroimmunol.7:27)。
可药用载体包括无菌水溶液或分散体及用于临时制备无菌可注射溶液 或分散体的无菌粉末。这类介质和物质在药物活性物质中的用途为本领域 已知。除非任意常规介质或物质与活性化合物不相容，还考虑常规介质或 物质在本公开的药物组合物中的用途。还可以将补充活性化合物掺入组合 物中。
治疗组合物通常必须无菌，且在制备和保存的条件下稳定。组合物可 以配制为溶液、微乳、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。载体可 以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及 其适宜混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、 在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小及通过使用表面活性剂来维持 恰当的流动性。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、 多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收 的物质(例如单硬脂酸盐和明胶)来产生可注射组合物的延长吸收。
可以通过根据需要按所需量将活性化合物掺入含有一种或一组上列成 分的适当溶剂，然后进行无菌微量过滤来制备无菌可注射溶液。通常，通 过将活性化合物掺入含有基础分散介质和所需的来自上列那些的其他成分 的无菌载体来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况 下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从其之前经无菌过滤 的溶液产生活性成分加任意附加的希望的成分的粉末。
调整剂量方案以提供最优的期望反应(例如治疗反应)。例如，可以施 用单个大丸剂、可以随时间推移施用若干分份剂量或者按治疗情况的紧急 需要所指示按比例降低或提高剂量。例如，修饰的单结构域抗体可以通过 皮下注射每周施用一次或两次，或通过皮下注射每月施用一次或两次。
以剂量单位形式配制肠胃外组合物对施用的容易性和剂量的均一性尤 其有利。本文所用的剂量单位形式指适合作为待处理的个体的单个剂量的 物理上分开的单位；每个单位包含计算为与所需药物载体联合产生期望的 疗效的预定活性化合物量。本公开的剂量单位形式的规格取决于和直接依 赖于：(a)活性化合物的独特特征和要达到的具体疗效；和(b)混合这种活性 化合物用于个体中敏感性治疗的技术的限制。
可药用抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸 半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如 棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、 卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺 四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
对于治疗组合物，本公开的制剂包括适合用于口腔、鼻、局部(包括 口和舌下)、直肠、阴道和/或胃肠外施用的那些。制剂可以方便地以单位 剂量形式提供，且可以通过药学领域已知的任意方法来制备。可以与载体 物质组合来产生单个剂型的活性成分的量将取决于所治疗的个体和具体的 施用方式。可以与载体物质组合来产生单个剂型的活性成分的量通常将是 产生疗效的组合物的量。通常，在100％中，此量将在从约0.001％至约90％ 活性成分的范围内，优选从约0.005％至约70％，最优选从约0.01％至约 30％。
本公开的适合用于阴道施用的制剂还包括含有已知适当的载体的阴道 栓、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。用于局部或经皮施 用修饰的单结构域抗体组合物的剂型包括粉剂、喷雾剂、膏剂、糊剂、霜 剂、洗剂、凝胶剂、溶液、膜片剂和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件 下与可药用载体及与可以需要的任意防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
本文所用的短语“肠胃外施用”指肠内和局部施用之外的施用方式， 通常通过注射，且非限制性地包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、 眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、 蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
可以用于本公开的药物组合物中的适宜的水性和非水性载体的实例包 括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适宜的混合物、 植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)。可以例如通过使用诸如卵 磷脂的包衣材料、在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小及通过使用 表面活性剂来维持恰当的流动性。
这些组合物还可以包含辅助剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。 可以通过上文的灭菌操作和通过包含多种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基 苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等)这两种方法来确保防止微生物的 存在。还可希望将等渗剂(如糖、氯化钠等)包含于组合物中。此外，可以 通过包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝和明胶)来产生可注射药物形式的 延长吸收。
在将本公开的化合物作为药物对人类和动物施用时，它们可以单独或 作为药物组合物提供，该药物组合物包含与可药用载体组合的0.001％至 90％(更优选0.005％至70％，如0.01％至30％)活性成分。
不考虑所选择的给药途径，通过本领域技术人员已知的常规方法将本 公开的修饰的单结构域抗体(其可以以适宜的水合形式使用)和/或本公开的 药物组合物配制为可药用剂型。
为了获得对就具体患者、施用方式和组合物达到希望的治疗反应有效 而对患者没有毒性的活性成分量，本公开的药物组合物中活性成分的实际 剂量水平可以不同。所选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，其 包括所利用的本公开的具体组合物的活性；给药途径；施用时间；所利用 的具体化合物的排泄速率；处理持续时间；与所利用的具体组合物组合使 用的其他药物、化合物和/或材料；所处理的患者的年龄、性别、体重、状 态、一般健康和过往病史；和医学领域公知的类似因素。具有本领域普通 技术的医师或兽医可以容易地确定并开出所需的药物组合物的有效量。例 如，医师或兽医可以在低于达到希望的疗效所需的水平的水平开始本公开 的化合物用于药物组合物中的剂量，并逐渐增加剂量，直至达到希望的作 用。通常，本公开的组合物的适宜日剂量将是对产生疗效有效的最低剂量 的化合物量。这种有效剂量通常将取决于上述因素。优选静脉内、肌肉内、 腹膜内或皮下施用，优选靠近靶部位施用。如果希望，治疗组合物的有效 日剂量可以作为可选地以单位剂量在一整天内按适当的间隔施用的两个、 三个、四个、五个、六个或更多个小剂量施用。虽然可能单独施用本公开 的化合物，但优选将该化合物作为药物制剂(组合物)施用。
可以用本领域已知的医疗器械施用治疗组合物。例如，在优选实施方 案中，可以用无针的皮下注射器械施用本公开的治疗组合物，如美国专利 号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或 4,596,556中所公开的器械。用于本公开的公知的植入物和组件的实例包 含：美国专利号4,487,603，其公开用于以受控速率给药的可植入式微量输 注泵；美国专利号4,486,194，其公开用于通过皮肤施用药物的治疗器械； 美国专利号4,447,233，其公开用于以精确输注速率递送药物的药物输注 泵；美国专利号4,447,224，其公开用于连续药物递送的变速流可植入式输 注器；美国专利号4,439,196，其公开具有多室隔间的渗透性药物递送系统； 美国专利号4,439,196，其公开渗透性药物递送系统。许多其他的这类植入 物、递送系统和组件为本领域技术人员已知。
在某些实施方案中，可以配制本公开的分子来确保在体内的正确分布。 例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了确保本公开的治 疗化合物跨过BBB(如果希望)，可将它们配制在例如脂质体中。制备脂 质体的方法见例如美国专利4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可 以包含选择性转运入特定细胞或器官的一个或多个部分，从而增强靶向药 物递送(见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶 向部分包括叶酸或生物素(见例如Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖 苷(Umezawa等,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗 体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等(1995) Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe 等(1995)Am.J.Physiol.1233:134)，其不同种类可以包含本公开的制剂， 以及所发明的分子的成分；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem. 269:9090)；还见K.Keinanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion(1994) Immunomethods 4:273。在一个实施方案中，将本公开的治疗化合物配制 在脂质体中；在更优选的实施方案中，该脂质体包括靶向部分。在一个实 施方案中，通过对靠近肿瘤或感染的部位快速浓注来递送脂质体中的治疗 化合物。组合物必须为以容易注射的程度存在的流体。它必须在制备和保 存的条件下稳定，且必须防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。
组合物必须无菌，且为可通过注射器递送组合物的程度的流体。除水 外，载体可以是等渗缓冲盐溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体 聚乙二醇等)及其适宜混合物。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分 散体的情况下通过维持所需的颗粒大小及通过使用表面活性剂来维持恰当 的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如 甘露醇或山梨醇)和氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质(例 如单硬脂酸盐或明胶)来产生可注射组合物的长期吸收。
在按上文所述适宜地保护活性化合物时，化合物例如用惰性稀释剂或 可同化可食用载体可以口服施用。
治疗和诊断应用
可以构建本文所述的已修饰为消除与已存在的抗体的相互作用的具有 暴露的C端的单结构域抗体来结合任意目的抗原或靶标。这类靶标包括但 不限于簇结构域、细胞受体、细胞受体配体、生长因子、白介素、蛋白质 过敏原、细菌或病毒。还可以将本文所述的修饰的单结构域抗体修饰为具 有增加的稳定性和半衰期，以及附加的功能部分。因此，这些分子可以在 所有使用抗体的领域，包括研究、治疗和诊断领域中用于取代抗体。此外， 由于这些分子具有优于抗体的溶解性和稳定性特性，本文的修饰的单结构 域抗体可以在将破坏或失活抗体分子的条件下使用。
例如，可以对培养中(例如体外或离体)或个体中(例如体内)的细胞施用 修饰的单结构域抗体来治疗、预防或诊断多种障碍。本文所用的术语“个 体”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非 哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行 动物。在将修饰的单结构域抗体与另一药物一起施用时，二者可以以任一 顺序或同时施用。
包含本公开的组合物(例如修饰的单结构域抗体，其变体、融合物和缀 合物)和使用说明书的试剂盒也在本公开的范围之内。试剂盒可以进一步包 含至少一种附加试剂，或一种或多种附加的本公开的修饰的单结构域抗体。 试剂盒通常包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试 剂盒上或随试剂盒提供或以其他方式伴随试剂盒的任意文字或记录材料。
如上文所讨论，本公开的分子可以用于研究、治疗和诊断领域的所有 领域。可以用本公开的修饰的单结构域抗体(及其变体、融合物和缀合物) 治疗的示例性疾病/障碍包括自身免疫病、癌症、感染和其他病原性适应症。
其中可以使用本公开的修饰的单结构域抗体的自身免疫病症的具体实 例包括但不限于以下：多发性硬化和其他脱髓鞘病；类风湿性关节炎；炎 性肠病；系统性红斑狼疮；I型糖尿病；炎性皮肤障碍；Sjogren综合症； 及移植排斥。
其中可以使用修饰的单结构域抗体的癌症的具体实例包括但不限于以 下：肺癌；乳腺癌；前列腺癌；膀胱癌；黑素瘤；非霍奇金淋巴瘤；结肠 和直肠癌；胰腺癌；子宫内膜癌；肾癌；皮肤癌(非黑素瘤)；白血病；及 甲状腺癌。
修饰的单结构域抗体可以用于治疗或预防过度增生性疾病或癌症和癌 症的转移性扩散。癌症的非限制性实例包括膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、 乳腺癌、软骨癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、神经组织癌、 卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、骨骼肌癌、皮肤癌、脊髓癌、脾脏癌、胃癌、 睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、气管癌、泌尿生殖道癌、输尿管癌、尿道癌、 子宫癌或阴道癌。如本文所述，血管发生相关疾病包括但不限于血管发生 依赖性癌症，包括例如实体瘤、血液肿瘤(白血病)和肿瘤转移；良性肿瘤， 例如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和化脓性肉芽肿；炎性障碍， 如免疫性和非免疫性炎症；慢性关节风湿病和银屑病；眼血管发生性疾病， 例如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植排斥、新 生血管性青光眼、晶体后纤维增生症、发红；Osler-Webber综合症；心肌 血管发生；斑点新血管形成；毛细血管扩张症；血友病关节；血管纤维瘤； 创伤肉芽和创伤愈合；遗传性出血性毛细血管扩张症银屑病硬皮病；化脓 性肉芽肿；cororany collaterals；缺血性肢体血管发生；角膜病；发红；关 节炎；糖尿病性新血管形成；骨折；血管发生；血细胞发生(见例如 WO2005056764)。其中可以使用本公开的修饰的单结构域抗体的感染的具 体实例包括但不限于以下：细胞感染、真菌感染、细菌感染和病毒感染。
本文还包括用于用单结构域抗体预测已存在的抗体是否产生已存在的 免疫应答的方法，其包括：使单结构域抗体与人样品接触；如果存在于人 样品中，则测定已存在的抗体是否结合单结构域支架；通过缺失至少一个 氨基酸残基来修饰单结构域抗体的C端区域，使得C端修饰消除了已存在 的抗体与单结构域抗体的相互作用。该人样品选自血液和血清。
除非另有说明，未详细地明确描述的所有方法、步骤、技术和操作可 以以对技术人员而言显而易见的本身已知的方式进行且已进行。同样参考 例如本文提到的标准手册和一般背景技术及其中引用的其他参考文献。
实施例
实施例1：分析针对sdAb支架的已存在的抗体在人血清样品中的存在
此测定的目的是通过不同的C端氨基酸延伸来检测来自不同供体的人 血液样品中已存在的IgG对单结构域抗体(sdAb)的应答及此应答的变异。 这些延伸在氨基酸组成和长度上不同。针对其与人血清的免疫原应答测试 了不含任何延伸的人衍生sdAb(基于重链和轻链)的不同支架。总体目标是 发现对已存在的抗体无任何应答或具有低应答的构建体。
样品：
在下文所述的测定中测试了不含任何延伸(如通过Kabat所定义的) 的三个人衍生重链sdAb支架(HVHP,SEQ ID NO:8-13)和三个人衍生轻链 sdAb支架(LVHP,SEQ ID NO:2-7)。用这些支架来产生可以比较C端处的 延伸和截短的影响的基线。在第二组实验中，进行了C端修饰及其对已存 在的抗体的影响。所测试的C端修饰涉及从V_H或V_L支架的C端添加(延 伸)或缺失氨基酸残基。
制备了具有C端延伸的支架，其代表可变结构域和恒定结构域之间的 接头区中的天然存在的氨基酸，其包括但不限于Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、 Ala-Ser-Thr、Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln、Gly-Gln-Pro、 Ala-Ser-Thr-Lys-Pro(SEQ ID NO:14)。对于所列的最后一个变体，添加了 非天然存在的脯氨酸，以防止已知的C端赖氨酸脱落。此外，还测试了使 用通常用作单结构域之间的接头的Ala-Ala和Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ  ID NO:15)序列的延伸。测试的其他延伸有Gly、Gly-Gly和Gly-Ser。
工作流名称 MW(Da) 浓度(mg/ml) pTH296中的HVHP430S 13413 0.3 pTH296中的HVHP426S 12819 0.6 pTH296中的HVHP421S 13130 0.4 pTH296中的HVLP325S 11391 0.2 pTH296中的HVLP351S 11623 0.2 pTH296中的HVLP3103S 11620 0.05
血清血液样品：
使用了20份来自男性供体的血清样品和20份来自女性供体的样品。 在此，用已知的样品作为各组的有应答或无应答的阳性和阴性对照。


缓冲液：
包被缓冲液 1x PBS，5mL 10x PBS加50mL H₂O 洗涤缓冲液 1x TBST，2袋TBS-Tween 20粉末溶于2L H₂O 封闭缓冲液 4mL山羊血清+76mL Superblock 测定缓冲液 5.84g NaCl加100mL低交叉缓冲液
检测：
山羊抗-hIgG-HRP(Fc)缀合，10.3mg/mL(Sigma)
方法：
使用了夹心ELISA技术。将sdAb构建体直接固定在微量滴定板上。 然后将人血清样品加至平板的孔。如果sdAb构建体捕获血清样品，则通 过与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗-人IgG来检测它。
第一天，向平板中加入每孔100μL包被溶液(sdAb)，并4℃过夜孵育。 第二天，用每孔300μL洗涤缓冲液洗涤平板3次。用封闭缓冲液每孔 300μL室温封闭2小时后，用300μL洗涤缓冲液洗涤平板3次。用测定 缓冲液1:40稀释人血清样品，然后向孔中加入每孔100μL的稀释样品， 并以300转/分钟在微量滴定板震荡器上室温孵育2小时。然后用300μL 洗涤缓冲液洗涤平板3次。然后向孔中加入每孔100μL检测抗体(1:100.000 稀释)，并按300转/分钟室温孵育平板1小时。用每孔300μL洗涤缓冲液 洗涤平板3次后，向平板中加入每孔100μL的TMB底物溶液，按300转 /分钟室温孵育至少10分钟，然后加入每孔100μL的TMB终止溶液。在 450读取单个孔的吸光度。
将单个孔的值对平板背景(NC的平均值)归一化。然后计算归一化的样 品(两个重复)值的平均值。如果归一化的OD值的平均值大于或等于2，则 将它设为阳性免疫原应答(截止点)。
结果：
针对与人血清的免疫原应答测试了六种单结构域抗体支架：6种人 sdAb支架(3个V_H和3个V_L)。
表2：对已存在的抗体的sdAb重链和轻链支架应答

如表2中可见，在天然存在的接头位置-VSS处终止的全部三种V_H支 架(命名为HVHP430S、HVHP426S、HVHP421S)的数据显示显著的已存 在的免疫应答。相反，只有在天然存在的接头位置–TKVEIK(HVLP325S、 HVLP351S–κ序列)而不是TKVTVL(HVLP3103S–λ序列)处终止的V_L支架(命名为HVLP325S、HVLP351S和HVLP3103S)显示已存在的免疫应 答。这导致我们得出结论，V_H或V_L支架的终止(切割)位置对所观察到的 已存在的免疫应答至关重要。申请人认为，这是可以通过在接头中的不同 氨基酸位置处终止(切割)或通过用并非可变结构域和恒定结构域之间的接 头序列的天然部分的附加氨基酸残基掩盖天然接头暴露的氨基酸残基来改 变此应答的。为了评价申请人的该观点，制备了第二组V_H和V_L支架，其 仅在V_H或V_L支架的C端不同，而其余V_H或V_L支架序列保持相同。测 试了氨基酸截短(缺失)以及沿着天然存在的接头序列保留的氨基酸这二 者。此外，还通过对V_H或V_L支架的C端添加氨基酸残基来测试了用并非 天然接头序列的部分的不同氨基酸掩盖暴露的接头。假设是，健康供体的 血清中对分离的V_H或V_L结构域的已存在的免疫应答是从循环中去除降解 的抗体的天然清除机制的部分。在切割VH-CH1(图1切割位置A)或 VL-CL(图1切割位置B)之间正常情况下隐藏的接头区的C端时，这些已 存在的抗体识别的抗体表位暴露出来。此应答可能通过分别从V_H或V_L支 架的C端添加或去除选择性氨基酸来改变。此外，用并非正常存在于接头 序列中的附加氨基酸掩盖C端还将减少对已存在的抗体的应答。相同的机 制可能产生针对其他抗体片段(如Fab或scFv)中暴露的C端的已存在的免 疫应答。同样，与分离的仅有V_H或仅有V_L的抗体片段一样，此应答可能 通过在天然接头区内的选择性氨基酸处终止(切割)(例如，对于Fab片段， 在CH1-CH2之间(图1切割位置C)，或在scFv的C端)，或通过用并非正 常存在于天然接头序列中的附加氨基酸掩盖来掩盖。表3显示从Geneart 产生来检查C端修饰对已存在的抗体应答的影响的许多V_H和V_L单结构域 抗体序列。V_H和V_L单结构域抗体序列包括PhoA前导序列(SEQ ID NO: 1)，在表达和纯化之后将其去除，只留下上述V_H和V_L单结构域抗体序列 (SEQ ID NO:2-13)。
表3：产生来检查C端修饰对已存在的免疫应答的影响的包括PhoA 前导序列(SEQ ID NO:1)的V_H和V_L单结构域抗体序列。























图3-9中的数据清楚地显示对许多野生型V_H单结构域支架的已存在的 抗体应答的存在。此外，数据惊人地证明，仅对每一不同的人V_H单结构 域支架的C端添加一个或多个氨基酸残基完全消除或显著减少了已存在的 抗体应答。虽然与其他添加相比Ala-Ser-Thr氨基酸添加存在增加应答的 减少的趋势，但用每种V_H支架反复观察到了相同的应答模式。这证明， 在V_H单结构域支架的C端修饰可以通过改变C端单结构域抗体的三维构 型来消除至少一种已存在的抗体与支架的相互作用，使得已存在的抗体不 再识别单结构域抗体；可以改变C端单结构域抗体对至少一种已存在的抗 体的暴露，使得它不反应；改变至少一种单结构域抗体和已存在的抗体之 间的空间位阻；破坏C端中的至少一个构象新表位；或保护单结构域抗体 的构架中的至少一个新表位。
图20中的数据显示，只有以107位(按Kabat确定)的Lys结束的V_Lκ 轻链而不是V_Lλ轻链倾向于已存在的免疫应答。虽然不受限于理论，但申 请人认为围绕V_Lκ轻链的C端VEIK序列的新表位造成已存在的免疫应 答，因为从VEIK序列缺失至少一个氨基酸(产生VEI)废除了已存在的免 疫应答。用VEIK未观察到免疫应答，但对C端VEIK序列添加一个氨基 酸残基(例如Arg)或两个氨基酸残基(例如Arg-Thr)(产生VEIKR或 VEIKRT)增加了已存在的免疫应答。但是，进一步对C端VEIK序列添加 三个氨基酸残基(例如Arg-Thr-Val)至四个氨基酸残基(例如 Arg-Thr-Val-Ala)(分别产生VEIKRTV或VEIKRTVA)再次废除了已存在 的免疫应答。因此，围绕C端VEIK序列似乎存在三至四个氨基酸残基的 窄窗，其似乎负责已存在的抗体或已存在的免疫分子的相互作用。
概括起来，此数据首次显示，几种人V_H和V_Lκ单结构域支架的C 端中存在新表位，其可由存在于健康人志愿者的血清中的已存在的抗体识 别。对这些人V_H和V_Lκ单结构域支架的已存在的免疫应答的鉴定是意外 和惊人的观察，因为这些单结构域支架源自人文库或人来源，而不是合成 文库。因此，人们未预期或未期望对这些人单结构域支架的已存在的免疫 应答或已存在的抗体的存在。此外，通过氨基酸的添加或缺失修饰V_H或 V_Lκ的C端消除了已存在的免疫应答。